謝松

摘 要 目的：以poloxamer P407和P188為凝膠基質(zhì)，制備一種適宜皮下注射的長(zhǎng)效緩釋制劑。方法：以膠凝溫度、黏度和溶蝕速率為指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選原位凝膠配方。結(jié)果：根據(jù)擬合結(jié)果使用poloxamer P407和P188分別為21.63%和2.41%時(shí)，膠凝溫度為34.99 ℃、黏度48.07 cP、溶蝕時(shí)間4.47 h，結(jié)合固體分散體技術(shù)得到釋放平穩(wěn)、7 d累積釋放率可達(dá)80%以上的皮下原位凝膠注射劑。結(jié)論：該模型具有高度顯著性，優(yōu)選處方可以滿足長(zhǎng)效緩釋注射劑的要求。

關(guān)鍵詞 poloxamer 原位凝膠 溶蝕 Box-Behnken響應(yīng)面法

中圖分類(lèi)號(hào)：R944.1； R979.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2019）11-0061-05

Preparation of leflunomide long-term release injection

XIE Song*

（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To prepare a long-term release subcutaneous injection based on poloxamer P407 and P188. Methods： The gelation temperature， viscosity and dissolution rate were taken as dependent variables and the Box-Behnken response surface method was used to optimize the in situ gel formulation. Results： According to the fitting results， when poloxamer P407 and P188 were used at 21.63% and 2.41%， the gelatinization temperature was at 34.99 ℃， the viscosity was 48.07 cP， and the dissolution time was 4.47 h. Combined with solid dispersion technology， the in situ gel injection has it stable release rate for 7 days， and finally obtained more than 80% accumulative release. Conclusion： The model was highly significant. The optimized formulation can meet the requirements of long-term release injection.

KEY WORDS poloxamer； in situ gel； dissolution； Box-Behnken response surface method

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）屬于自身免疫性疾病。是一種發(fā)病緩慢、伴隨炎癥的關(guān)節(jié)疾病，多發(fā)于四肢關(guān)節(jié)[1]。來(lái)氟米特是一種免疫調(diào)節(jié)劑，通常用于治療RA，其結(jié)構(gòu)為異噁唑類(lèi)，通過(guò)化學(xué)合成而得。該藥在國(guó)內(nèi)外已上市多年，為口服固體制劑。其代謝產(chǎn)物特立氟胺有兩個(gè)作用：一是通過(guò)抑制二氫乳清酸脫氫酶的活性從而阻斷嘧啶的從頭合成途徑，影響DNA和RNA的合成；二是可抑制酪氨酸激酶的活性和細(xì)胞的粘附，并能抑制抗體的產(chǎn)生和分泌[2]。該藥臨床應(yīng)用兼具良好的安全性和有效性。

以泊洛沙姆（poloxamer）為基質(zhì)制備的原位凝膠屬溫度敏感型。其不同比例的溶液在感受溫度變化時(shí)會(huì)產(chǎn)生溶膠-凝膠之間的可逆轉(zhuǎn)變。又因非毒性和溶液穩(wěn)定性，使其非常適合作為注射劑的載體[3]。本研究通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選滿足皮下注射要求的原位凝膠配方，同時(shí)采用固體分散體技術(shù)調(diào)節(jié)釋藥速率從而達(dá)到小劑量來(lái)氟米特局部給藥一周一次的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器

UV-1700紫外分光光度計(jì)（島津儀器（蘇州）有限公司）；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司）；SHA-B數(shù)顯恒溫水浴振蕩器（常州國(guó)華電氣有限公司）；DV-Ⅲ旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)（美國(guó)博勒飛公司）；CP-225D型電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）。

1.2 試藥

來(lái)氟米特（南京康滿林化工實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)20160301）；乙基纖維素（瀘州北方化學(xué)工業(yè)有限公司，批號(hào)20160403）；poloxamer P407（批號(hào)WPWJ554C）、poloxamer P188（批號(hào)WPYJ540B）均購(gòu)自巴斯夫（中國(guó)）有限公司；甲醇、乙醇（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 空白凝膠配方優(yōu)選

1）空白凝膠的制備 應(yīng)用冷溶法[4]，按處方量量取純化水，冷藏過(guò)夜，取處方比例P407和P188緩慢加入上述冷水中，冷藏至完全溶解，備用。

2）凝膠優(yōu)選配方評(píng)價(jià)指標(biāo) 鑒于項(xiàng)目開(kāi)發(fā)目的是對(duì)患處進(jìn)行局部注射并達(dá)到迅速膠凝、長(zhǎng)效緩釋的目的。故選用膠凝溫度（25 ℃）、黏度和溶蝕速度為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3）膠凝溫度及黏度測(cè)定方法[5] 取空白凝膠液20 ml置于Brookfield旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測(cè)試杯中，選取18號(hào)轉(zhuǎn)子，設(shè)定轉(zhuǎn)速100 r/min，溫控程序?yàn)?～40 ℃，升溫速率0.5 ℃/min，黏度突然上升時(shí)的拐點(diǎn)溫度即為膠凝溫度，取25 ℃時(shí)的黏度為凝膠黏度。

4）溶蝕速率測(cè)定方法[6] 取空白凝膠液5 ml于玻璃試管中，稱(chēng)重，置于調(diào)整到適宜膠凝溫度的恒溫水浴振蕩器中使之完全膠凝，加入與凝膠相同溫度保溫的pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液（PBS）3 ml，振蕩，設(shè)定頻率為50 Hz，計(jì)時(shí)，間隔30 min取出將PBS全部?jī)A出，稱(chēng)取剩余凝膠重量，補(bǔ)加等量的保溫PBS，至累積溶蝕量>95%止。減失重量即為溶蝕量。

5）Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法 以P407和P188含量為響應(yīng)面分析法的因素[7-8]，分別按-a、-1、0、1、a5水平進(jìn)行編碼（a取值為1.414），以凝膠溫度、黏度和溶蝕速率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1、2）。

1.3.2 來(lái)氟米特固體分散體的制備

預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用優(yōu)化的空白凝膠配方載藥體外釋放時(shí)間達(dá)不到預(yù)期的7 d，為了減緩釋藥速率，考慮使用水難溶性固體分散體技術(shù)對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理。

采用溶劑法制備來(lái)氟米特固體分散體[9]，稱(chēng)取乙基纖維素（EC）12 g，溶解于240 ml乙醇中，再加入4 g來(lái)氟米特，超聲使溶解。從5% EC-來(lái)氟米特溶液中回收乙醇、將殘余物真空干燥，得來(lái)氟米特固體分散體。

1.3.3 載藥凝膠制備

1.3.3.1 體外釋放測(cè)定方法

按配方制備空白凝膠，冷藏備用。取稱(chēng)取來(lái)氟米特置于上述空白凝膠中，混合均勻，制成3 mg/ml載藥凝膠。取上述載藥凝膠5 ml置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中使之完全膠凝，然后加入37 ℃ PBS 3 ml，開(kāi)啟振蕩，頻率50 Hz，并開(kāi)始計(jì)時(shí)，固定間隔時(shí)間取樣。取樣時(shí)將PBS全部?jī)A出容器中，補(bǔ)加等量的37 ℃ PBS。從取出的溶液中移取1 ml置于25 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，UV測(cè)定來(lái)氟米特含量。

1.3.3.2 載藥凝膠含量測(cè)定方法

1）來(lái)氟米特甲醇溶液紫外吸收特征的確定 精密稱(chēng)取來(lái)氟米特1 mg，置于100 ml容量瓶中，加甲醇溶液溶解，定容，搖勻，得濃度10 mg/ml來(lái)氟米特溶液。以甲醇溶液為空白對(duì)照，按紫外-可見(jiàn)分光光度法在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定其在甲醇中的最大吸收波長(zhǎng)。

2）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱(chēng)取來(lái)氟米特5.47 mg，置于100 ml容量瓶中，加甲醇溶液溶解，定容，搖勻，得濃度54.7 mg/ml的儲(chǔ)備液。分別移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9、1.0、1.6、2.0、2.5 ml儲(chǔ)備液于10 ml容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別為0.547、1.094、2.188、3.282、4.376、4.923、5.47、8.752、10.94、13.675 mg/ml的溶液。

3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以甲醇溶液為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)260 nm處測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以吸光度對(duì)濃度（mg/ml）作線性回歸，當(dāng)濃度為0.547～13.675 mg/ml時(shí)得來(lái)氟米特于甲醇溶液中的回歸方程y=0.068x+0.005 4，R2=0.999 0。

2 結(jié)果

2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)法擬合結(jié)果分析

使用Design expert 8.0.5b對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)行處理。方差分析結(jié)果顯示，模型具有高度的顯著性，且失擬項(xiàng)不顯著，對(duì)于膠凝溫度和黏度擬合度較好，溶蝕時(shí)間擬合度稍差（表3）。

對(duì)應(yīng)的等高線圖和3D效應(yīng)面圖見(jiàn)圖1、2。

1）優(yōu)化 以上述模型為基礎(chǔ)，設(shè)定膠凝溫度35℃、黏度<100 cP、溶蝕時(shí)間最大化，經(jīng)design expert 8.05b 運(yùn)行優(yōu)化，得結(jié)果為：當(dāng)A=0.46，B=-1，即P407 21.63%，P188 2.41%時(shí)，膠凝溫度為34.99 ℃、黏度48.07 cP、溶蝕時(shí)間4.47 h，可信度88.36%。

2）驗(yàn)證 根據(jù)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行三次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)選取實(shí)驗(yàn)序號(hào)2、11為參照。結(jié)果見(jiàn)表4。

結(jié)果顯示：①雖然對(duì)照實(shí)驗(yàn)11#溶蝕速率最慢（圖3），但凝膠黏度大不利于注射（圖4）；②優(yōu)化方案實(shí)驗(yàn)結(jié)果與設(shè)計(jì)比較接近，在室溫環(huán)境中黏度小于100 cP利于注射時(shí)的吸液和推注，在進(jìn)入皮下后能迅速膠凝。

2.2 來(lái)氟米特固體分散體含測(cè)及差示掃描量熱法（DSC）鑒定結(jié)果

采用上述紫外法測(cè)定來(lái)氟米特固體分散體含量結(jié)果為103.8%，DSC檢驗(yàn)結(jié)果顯示來(lái)氟米特與EC兩者完全熔合（圖5）。

2.3 載藥凝膠體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取制備好的來(lái)氟米特固體分散體適量，配制成3 mg/ml載藥凝膠20 ml，按體外釋放測(cè)定方法和載藥凝膠含量測(cè)定方法測(cè)定含量。

結(jié)果顯示，使用固體分散體技術(shù)可以顯著降低藥物釋放速率，7 d累積釋放達(dá)到80%，呈線性（y=11.248x-11.978，R2=0.998 7），滿足來(lái)氟米特一周給藥一次的臨床要求。

3 討論

溫敏型原位凝膠是一種新的藥物裝載和釋放系統(tǒng)。在儲(chǔ)存時(shí)低黏度的液體，給藥后可迅速在給藥部位形成固態(tài)的凝膠[10]，相比于口服固體制劑具有制備工藝簡(jiǎn)單、藥物分散均勻、給藥方便可實(shí)現(xiàn)緩釋的優(yōu)點(diǎn)[11]。

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)常用于在確信試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)存在非線性影響時(shí)對(duì)因素與指標(biāo)間的關(guān)系進(jìn)行試驗(yàn)分析，尤其是在要求試驗(yàn)的各因素不能同時(shí)在高水平設(shè)置下進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)。本試驗(yàn)基于：①人體基礎(chǔ)體溫37 ℃，又需皮下注射的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)評(píng)價(jià)指標(biāo)分別是膠凝溫度35℃[12]，膠凝溫度太高可能注射后不能迅速形成原位凝膠、膠凝溫度太低可能在夏季室溫比較高的情況下在注射前即產(chǎn)生膠凝。②注射劑一般要求注射液能通過(guò)常規(guī)針頭吸液并推注時(shí)阻力不易過(guò)大，因而設(shè)計(jì)黏度小于100 cP，考慮載藥后黏度會(huì)增加，因此優(yōu)化后的空白凝膠黏度為50 cP，載藥后黏度為67 cP，吸液和推注都比較方便，同時(shí)也為今后提高載藥量預(yù)留空間。③優(yōu)選配方溶蝕速率穩(wěn)定在10%左右，顯示固體分散體結(jié)合原位凝膠技術(shù)可以達(dá)到調(diào)控藥物釋放的目的，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效緩釋。后續(xù)擬進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)藥代試驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果可通過(guò)調(diào)整EC與來(lái)氟米特比例調(diào)節(jié)釋放度。

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