鞠 倩曲明靜杜 龍薛 明梁景華許婷婷*姜曉靜*

(1.山東省花生研究所,山東 青島 266100; 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,山東 泰安 271018;3.漳州市英格爾農(nóng)業(yè)科技有限公司,福建 漳州 363000)

花生蚜(AphiscraccivoraKoch),屬昆蟲綱同翅目蚜科蚜屬?；ㄉ翞槎嗍承院οx,除了對(duì)花生有極大的危害外,還可以對(duì)苜蓿、苕子、豌豆、豇豆等200多種寄主植物造成危害[1]。在我國(guó)大部分地區(qū)都有危害發(fā)生,其中山東、河南、河北地區(qū)為花生蚜的重災(zāi)區(qū)?；ㄉ镣ǔＲ猿伞⑷粞寥杭诨ㄉ哪垩?、嫩葉、花柄及果針等處為害,常導(dǎo)致葉片卷縮、變黃,植株生長(zhǎng)緩慢,果針無法下針,進(jìn)一步影響莢果發(fā)育。而且它還是花生病毒的傳播媒介[2-3]。據(jù)中國(guó)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部數(shù)據(jù)顯示,2000-2014年間,每年全國(guó)花生蚜發(fā)生面積達(dá)到1797.24萬畝次,每年由花生蚜蟲造成全國(guó)范圍內(nèi)的花生減產(chǎn)達(dá)28,735.81 t[4]。

因此,花生蚜蟲的快速準(zhǔn)確識(shí)別是對(duì)其進(jìn)行有效防控的首要前提。目前國(guó)際上用于花生蚜蟲鑒定的方法主要是通過形態(tài)特征來確定種類。但花生蚜蟲蟲體僅1.5～2.0 mm,且花生田或其他為害田有其他形態(tài)特征極其類似的過境、非為害蚜蟲干擾其鑒定。因此,傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定法難以滿足田間對(duì)花生蚜進(jìn)行快速準(zhǔn)確識(shí)別的需求,建立一套快速準(zhǔn)確的花生蚜分子檢測(cè)技術(shù)勢(shì)在必行。

本研究采用基于線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶亞基I (mitochondrial DNA cytochrome coxidase subunit I, mtDNA COI)基因的種特異(species-specific COI)PCR技術(shù)[5],研究建立花生蚜的快速檢測(cè)技術(shù)體系,對(duì)花生蚜蟲發(fā)生的及時(shí)預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和有效防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 田間取樣及試蟲鑒定

本研究中所使用的蚜蟲類害蟲均采自山東省花生研究所試驗(yàn)站。所有節(jié)肢動(dòng)物、線蟲、軟體動(dòng)物樣本浸泡于無水乙醇(分析純,99.7%),-20℃保存?zhèn)溆谩Ｋ猩彻?jié)肢動(dòng)物、線蟲、軟體動(dòng)物的形態(tài)鑒定由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王備新教授和西北農(nóng)林科技大學(xué)楊兆福教授協(xié)助完成。

1.2 花生田蚜蟲類害蟲及其他節(jié)肢動(dòng)物、線蟲、軟體動(dòng)物樣本基因組的單頭提取

使用改進(jìn)的試劑盒法提取基因組。首先用無水乙醇洗凈樣本,擦干乙醇后將樣本與適量小鋼珠放入2mL研磨管中,用球磨儀將樣本打碎,將樣品轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中。向離心管中加入250μL Buffer IL和20μL Proteinase K,振蕩或顛倒使樣品混勻。將混勻后的離心管放入恒溫水浴鍋中55℃水浴6h或過夜消化樣品,水浴消化期間需偶爾將樣品顛倒混勻。樣品被消化完全后,13000×g離心3min,轉(zhuǎn)移上清液至新的1.5mL離心管中。向離心管中的消化液加入500μL Buffer IL(加一倍乙醇稀釋),渦旋混勻30s。把HiPure gDNA Micro Column 裝在2mL收集管中,將混合液和沉淀一起轉(zhuǎn)移至柱子中,10000×g離心30～60 s。加入600μL Buffer GW1至柱子中,10000×g離心30～60 s。加入600μL Buffer GW2至柱子中。10000×g離心30～60 s。重復(fù)上述操作1次,13000×g離心3min。將柱子裝在新的1.5mL離心管中。加入15～30μL預(yù)熱至55℃的Elution Buffer或Buffer TE至柱子的膜中央。放置2min,13000×g離心1min。然后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 用于種特異性檢測(cè)的花生蚜蟲COI基因引物 [4]Table 1 Species-specific COI primers [4]

表2 用于花生蚜蟲COI基因引物種特異性檢測(cè)的86個(gè)物種 [4]Table 2 Families (86 nontarget taxa, replicates and treatments for a total of 162) [4]tested for cross-reactivity against primer pairs

1.3 COI基因5'端序列的擴(kuò)增

以花生田蚜蟲類害蟲及其他節(jié)肢動(dòng)物、線蟲、軟體動(dòng)物樣本基因組為模板,采用mtDNA COI基因通用型引物F-LCO-1490(5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3')與R-HCO-700ME(5'-TCAGGGTGACCAAAAAATCA-3')[6]

進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25μL,其中模板DNA 0.5μL,5×Buffer(含Mg2+)5μL,dNTPs(2.5 mmol/L) 2μL,上游引物和下游引物(10μmol/L)各0.5μL,TaqDNA聚 合 酶(2.5U/μL) 0.2μL,ddH2O補(bǔ)加至25μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3min; 98℃ 10s,55℃ 5s,72℃ 20s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。取 6μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,加1μL 6×上樣緩沖液,以 DNA Marker DL2000 為參照,在含有GoldView(0.5μg/mL)的2%的瓊脂糖凝膠上電泳。檢測(cè)成功的樣品送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.4 花生蚜蟲特異性引物的設(shè)計(jì)及種特異性檢測(cè)

根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)六對(duì)花生蚜蟲特異性引物(表1),以花生蚜蟲為陽性對(duì)照,以在同一花生田采集的、與花生蚜同生境的節(jié)肢動(dòng)物、線蟲、軟體動(dòng)物樣本DNA為模板檢驗(yàn)六對(duì)引物的種特異性。PCR反應(yīng)體系25μL,其中模板DNA 0.5μL,5×Buffer(含Mg2+(5μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL, 上游引物和下游引物(10μmol/L)各0.5μL,Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)0.2μL,ddH2O補(bǔ)加至25μL。 PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;98℃10s,55℃5 s,72℃20 s,35 個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)方法同1.3。

圖1 mtDNA COI基因通用型引物F-LCO-1490/R-HCO-700ME對(duì)花生田蚜蟲類害蟲基因組的擴(kuò)增效果Fig.1 PCR amplification of mitochondrial DNA of aphids in peanut field using COI gene universal primers F-LCO-1490/R-HCO-700ME

圖2 引物AC_F3/ AC_R2在與花生蚜同生境節(jié)肢動(dòng)物、線蟲、軟體動(dòng)物樣本中的擴(kuò)增效果Fig.2 Amplification pattern of mitochondrial DNA of peanut aphid and other species in peanut field using AC_F3/ AC_R3 primers

圖3 引物AC_F4/ AC_R4在與花生蚜同生境節(jié)肢動(dòng)物、線蟲、軟體動(dòng)物樣本中的擴(kuò)增效果Fig.3 Amplification pattern of mitochondrial DNA of peanut aphid and other species in peanut field using AC_F4/ AC_R4 primers

圖4 引物AC_F5/ AC_R5在與花生蚜同生境節(jié)肢動(dòng)物、線蟲、軟體動(dòng)物樣本中的擴(kuò)增效果Fig.4 Amplification pattern of mitochondrial DNA of peanut aphid and other species in peanut field using AC_F5/ AC_R5 primers

圖5 引物AC_F6/ AC_R5在與花生蚜同生境節(jié)肢動(dòng)物、線蟲、軟體動(dòng)物樣本中的擴(kuò)增效果Fig.5 Amplification pattern of mitochondrial DNA of peanut aphid and other species in peanut field using AC_F6/ AC_R5 primersM： DNA marker (DL2000);

圖6 引物AC_F7/ AC_R7在與花生蚜同生境節(jié)肢動(dòng)物、線蟲、軟體動(dòng)物樣本中的擴(kuò)增效果Fig.6 Amplification pattern of mitochondrial DNA of peanut aphid and other species in peanut field using AC_F7/ AC_R7 primers

2 結(jié)果與分析

2.1 花生田蚜蟲類害蟲COI基因5'端序列的擴(kuò)增

電泳結(jié)果顯示,兩種蚜蟲類害蟲均能擴(kuò)增出一條清晰的靶標(biāo)片段(圖1)。雙向測(cè)序經(jīng)電泳檢測(cè)驗(yàn)證合格的PCR產(chǎn)物,確定此類蚜蟲為花生蚜蟲,該片段長(zhǎng)度為1450bp。

2.2 花生蚜蟲COI基因引物的設(shè)計(jì)及種特異性和靈敏性檢測(cè)

電泳檢測(cè)結(jié)果顯示,該六對(duì)特異性引物均有擴(kuò)增能力,片段大小見表1。以在同一花生田采集且與花生蚜同生境的節(jié)肢動(dòng)物門(86個(gè)物種,162個(gè)檢測(cè)樣本,見表2)、線蟲(1個(gè)物種,2個(gè)檢測(cè)樣本)、軟體動(dòng)物(1個(gè)物種,2個(gè)檢測(cè)樣本),共166個(gè)樣本DNA為模板,以設(shè)計(jì)的六對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時(shí)以花生蚜蟲基因組為陽性對(duì)照。

電泳結(jié)果顯示,引物AC_F2/AC_R2可在花生蚜蟲基因組中擴(kuò)增出條帶,片段長(zhǎng)度299bp。但此對(duì)引物在與花生蚜同生境的節(jié)肢動(dòng)物、線蟲、軟體動(dòng)物樣本中均未擴(kuò)增出條帶。其他五對(duì)引物均可在多種不同物種中擴(kuò)增出條帶 (圖2～圖6)。

3 討論與結(jié)論

Hebert 等[7]利用mtDNA COI基因中的一段序列對(duì)生物物種類別進(jìn)行分子鑒定,并將這種技術(shù)命名為DNA條形碼技術(shù)(DNA barcoding),此技術(shù)可通過對(duì)昆蟲特定基因片段的測(cè)序及對(duì)比而準(zhǔn)確確定其分類地位。針對(duì)個(gè)體較小、通過形態(tài)鑒定困難的昆蟲種類,目前DNA 條形碼技術(shù)是有效而準(zhǔn)確的分子鑒定手段[8]。

多拷貝的mtDNA COI基因,因其母系遺傳、分子量小、進(jìn)化速度快等特點(diǎn),被認(rèn)為能準(zhǔn)確對(duì)物種進(jìn)行鑒別[9]。 同時(shí),COI基因這一序列相對(duì)保守,易被通用引物擴(kuò)增。本研究利用節(jié)肢動(dòng)物mtDNA COI通用引物F-LCO-1490與R-HCO-700ME, 對(duì)花生田蚜蟲類害蟲基因組進(jìn)行了擴(kuò)增,確定了青島地區(qū)花生蚜的mtDNA COI基因序列。并根據(jù)此序列,設(shè)計(jì)多對(duì)特異引物,以在同一花生田采集的、與花生蚜同生境的節(jié)肢動(dòng)物、線蟲、軟體動(dòng)物樣本基因組為模板,對(duì)引物的種特異性進(jìn)行了檢測(cè),確定了花生蚜的種特異性引物序列。上述結(jié)果表明,種特異性引物AC_F2/AC_R2對(duì)其他物種不具有交叉反應(yīng)擴(kuò)增能力,可用于花生蚜蟲的種類鑒定,這對(duì)田間花生蚜發(fā)生預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及本地天敵對(duì)花生蚜捕食作用的檢測(cè)具有重要意義。

需要說明的是,為了節(jié)約試驗(yàn)投入成本及試驗(yàn)時(shí)間,除引物AC_F2/AC_R2之外的其他五對(duì)特異引物,在以與花生蚜同生境節(jié)肢動(dòng)物、線蟲、軟體動(dòng)物樣本中的PCR擴(kuò)增試驗(yàn)中,當(dāng)出現(xiàn)可以擴(kuò)增到條帶的樣本時(shí),便認(rèn)為此引物不具備種特異性,不再繼續(xù)其他種類樣本的引物種特異性驗(yàn)證試驗(yàn)。