高飛，胡澤斌，游延軍，蒲小聰，陳蕊，黃杰

脆性 X 綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是引起遺傳性智力低下和孤獨(dú)癥譜系障礙最常見(jiàn)的單基因病[1]，95% 以上的脆性 X 綜合征患者是由于FMR1 基因 5' 非編碼區(qū) CGG 重復(fù)序列擴(kuò)增導(dǎo)致 Fmrp 表達(dá)沉默所致[2]，CGG 重復(fù)在人群中具有高度多態(tài)性，正常型的重復(fù)次數(shù)為 6～44，F(xiàn)MR1基因表達(dá)正常，無(wú)明顯臨床表現(xiàn)。中間型的重復(fù)次數(shù)為 45～54，子代可擴(kuò)增為前突變，無(wú)明顯臨床表現(xiàn)。CGG 重復(fù)數(shù)突變至 55～200 的個(gè)體稱(chēng)為前突變攜帶者（premutation，PM），全突變（full mutation，F(xiàn)M）重復(fù) 次數(shù)大于 200[3]，臨床表現(xiàn)明顯。1995年至今，我國(guó)共對(duì) 12 676 例智力低下患兒進(jìn)行了脆性 X 綜合征的篩查，查出患兒共計(jì) 804 例，以此計(jì)算出脆性 X 綜合征在我國(guó)智力低下患兒中的患病率約為 6.3%[4]。2006年國(guó)內(nèi)共對(duì) 850 例孤獨(dú)癥譜系障礙患兒進(jìn)行篩查，檢出 19 例脆性 X 綜合征患兒，估算出脆性 X 綜合征在孤獨(dú)癥譜系障礙中的患病率約為 2.2%[5]。

目前，國(guó)內(nèi)外許多廠家已開(kāi)發(fā)脆性 X 綜合征檢測(cè)試劑盒，用以檢測(cè)患者的FMR1 基因 CGG 突變型別，由于方法不同[6]，其特異性和靈敏度存在差別。因此，有必要研制脆性 X 定性參考品使檢測(cè)規(guī)范化。

1 材料與方法

1.1 材料

核酸提取試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；脆性 X 參考品研制所需的細(xì)胞系包含的基因型別：中間型（CGG 重復(fù) 45～54）、前突變型（CGG 重復(fù) 55～200）、全突變型（CGG 重復(fù) ＞ 200）、嵌合型（前突變與全突變嵌合存在）、嵌合型（野生與前突變嵌合存在）、罕見(jiàn)FMR1 基因缺失型及 6 個(gè)野生型（正常人樣本）均購(gòu)自中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；陰性參考品研制所需原料為收集其他病原體感染的細(xì)胞；參考品驗(yàn)證所需試劑盒購(gòu)自廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司和北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 參考品原料的制備 當(dāng)天采集患者 5～10 ml 新鮮血液樣品，使用一次性枸櫞酸鈉抗凝采血管保存，低溫保存運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。在無(wú)菌環(huán)境中，提取患者的外周血單核淋巴細(xì)胞，加入病毒液制備完全轉(zhuǎn)化液，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化與細(xì)胞培養(yǎng)、凍存。建立細(xì)胞系后進(jìn)行種子細(xì)胞系擴(kuò)大培養(yǎng)。用核酸提取試劑盒對(duì)各型別細(xì)胞系進(jìn)行 DNA 抽提，用 NanoDorp 測(cè)定OD260/OD280和OD260/OD230值和瓊脂糖凝膠電泳膠檢驗(yàn) DNA 的完整性，NanoDropTMOne 對(duì) DNA 進(jìn)行精確 定量。陽(yáng)性參考品為：中間型、前突變型、全突變型、嵌合型（前突變與全突變嵌合存在）、嵌合型（野生與前突變嵌合存在），陰性參考品原料的來(lái)源為收集其他非人源性大腸桿菌，提取核酸，與罕見(jiàn)FMR1 基因缺失型及 6 個(gè)野生型組成陰性參考品。

1.2.2 參考品原料的驗(yàn)證 由中國(guó)食品藥品檢定研究院體外診斷試劑所非傳染病診斷試劑室對(duì)參考品所包含的陽(yáng)性及陰性樣本的 DNA 進(jìn)行濃度測(cè)定。同時(shí)，將全部樣本送中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行毛細(xì)管電泳及 DNA 片段分析。

1.2.3 參考品盤(pán)的制備 將 21 個(gè)樣本的基因組 DNA 溶液稀釋至 50 ng/μl 的濃度，然后將稀釋后的 DNA 溶液分裝在 0.5 ml 的凍存管中。每套參考品盤(pán)包含 21 個(gè)樣本，其中，陽(yáng)性樣本包括：2 種中間型樣本（CGG 重復(fù) 45～54）、4 種前突變型（CGG 重復(fù) 55～200）、4 種全突變型（CGG 重復(fù) ＞ 200）、1 種嵌合型（前突變與全突變嵌合存在）、1 種嵌合型（野生與前突變嵌合存在），陰性樣本 包括：1 種罕見(jiàn)FMR1 基因缺失型及 6 種野生型樣本、 2 種非人源樣本（大腸桿菌核酸樣本）。參考品盤(pán)放置于 -80 ℃ 保存。

1.2.4 參考品盤(pán)的分裝后驗(yàn)證 采用由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司提供的 AmplideXTMFMR1 PCR/CE Reagents 檢測(cè)試劑盒對(duì)分裝參考品進(jìn)行驗(yàn)證。檢測(cè)結(jié)果與樣本信息 一致。

1.2.5 不同公司對(duì)參考品盤(pán)的驗(yàn)證 選擇 4 家脆性 X 綜合征檢測(cè)試劑盒檢測(cè)、生產(chǎn)或代理機(jī)構(gòu)對(duì)本參考品進(jìn)行驗(yàn)證。此 4 家單位生產(chǎn)的試劑的檢測(cè)方法包括：PCR-熒光法、DNA 片段分析法、毛細(xì)管電泳法等。驗(yàn)證的項(xiàng)目包括以下幾個(gè)方面：①準(zhǔn)確性（陽(yáng)性符合率）：檢測(cè)試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)脆性 X 不同型別國(guó)家參考品；②特異性：檢測(cè) 9 份陰性參考品。

1.2.6 參考品穩(wěn)定性驗(yàn)證 將參考品反復(fù)凍融 3 次后，采用廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司提供的脆性 X 綜合征FMR1 基因檢測(cè)試劑盒（熒光 PCR 毛細(xì)管電泳法）進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 參考品原料的驗(yàn)證結(jié)果

將參考品所包含的陽(yáng)性及陰性 DNA 樣本送中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行毛細(xì)管電泳及 DNA 片段分析。用 GeneMapper 軟件進(jìn)行結(jié)果分析，分析結(jié)果顯示全部陽(yáng)性樣本及 1 種罕見(jiàn)FMR1 基因缺失型及 6 種野生 型樣本的堿基序列與樣本 CGG 重復(fù)數(shù)一致。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn) 圖1、表1。

2.2 參考品盤(pán)的分裝后驗(yàn)證結(jié)果

圖1 樣本毛細(xì)管電泳驗(yàn)證結(jié)果

表1 樣本基因片段分析驗(yàn)證結(jié)果

圖2 AmplideXTM FMR1 PCR/CE Reagents 檢測(cè)試劑盒對(duì)分裝參考品的驗(yàn)證結(jié)果

采用北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司提供的 AmplideXTMFMR1 PCR/CE Reagents 檢測(cè)試劑盒對(duì)分裝參考品進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果顯示參考品盤(pán)中的 P1、P2 樣本為脆性 X 綜合征FMR1 基因中間型樣本 CGG 重復(fù)數(shù)分別為 46/Y、54/Y，P3～P6 為脆性 X 綜合征FMR1 基因前突變型樣本，CGG 重復(fù)數(shù)分別為：30/69、29/155、56/Y、100/Y，P7～P10 為脆性 X 綜合征FMR1 基因全突變型樣 本，CGG 重復(fù)數(shù)分別為：30/ ＞ 200、29/ ＞ 200、＞ 200/Y、＞ 200/Y，P11 為脆性 X 綜合征FMR1 基因前突變和全突變嵌合型樣本，CGG 重復(fù)數(shù)為：86 ＞ 200/Y，P12 為脆性 X 綜合征FMR1 基因野生和全突變嵌合型樣本，CGG 重復(fù)數(shù)為：13 ＞ 200/Y，N1～N6 為FMR1 基因野生型樣本，CGG 重復(fù)數(shù)分別為：29/29、31/36、29/30、30/34、30/Y、36/Y，N7～N8 為非人源性基因組 DNA 樣本，N9 為FMR1 基因缺失樣本，驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 不同公司對(duì)參考品盤(pán)的驗(yàn)證

4 家脆性 X 綜合征檢測(cè)試劑盒檢測(cè)、生產(chǎn)或代理機(jī)構(gòu)用其自行生產(chǎn)或代理的脆性 X 綜合征檢測(cè)試劑盒對(duì)本參考品進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果表明參考品的組成成分合格，驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 4 家公司對(duì)本參考品盤(pán)驗(yàn)證結(jié)果

表3 參考品的穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果

2.4 參考品的穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果

將參考品反復(fù)凍融 3 次后，采用北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司提供的 AmplideXTMFMR1 PCR/CE Reagents 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果表明反復(fù)凍融對(duì)本參考品的穩(wěn)定性沒(méi)有影響，如表3所示。

3 討論

目前脆性 X 的基因診斷技術(shù)主要有 PCR、Southern blot、DNA 片段分析、BSP-測(cè)序等方法，已廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外各大醫(yī)院和臨檢機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床診斷。然而目前在脆性 XFMR1 基因檢測(cè)中，無(wú)論中間型、前突變還是全突變脆性 X 突變型別，國(guó)內(nèi)外都缺乏統(tǒng)一認(rèn)可的國(guó)家參考品。脆性 X 綜合征國(guó)家參考品涵蓋了國(guó)內(nèi)常見(jiàn)脆性 X 突變型別和國(guó)內(nèi)已發(fā)現(xiàn)但頻率低于 1% 的部分低頻型別樣本。通過(guò)對(duì)脆性 X 綜合征國(guó)家參考品的驗(yàn)證，結(jié)果表明參考品性質(zhì)穩(wěn)定，可以為臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量評(píng)價(jià)提供可靠的參考物質(zhì)，可用于國(guó)內(nèi)大多數(shù)試劑盒的性能評(píng)價(jià)要求。因此，該參考品盤(pán)能基本滿足不同試劑盒的評(píng)價(jià)。根據(jù)美國(guó)國(guó)家脆性 X 基金會(huì)的研究，脆性 XFMR1 基因型別包含：野生型、中間型、前突變型、全突變型和嵌合型，本研究建立了包含全部 5 種不同型別的脆性 X 綜合征國(guó)家參考品，為臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量評(píng)價(jià)及相關(guān)試劑盒的研發(fā)提供了可靠的質(zhì)控物質(zhì)。