文/葉棣柏 沈麗宮

采用外標(biāo)一點(diǎn)法、外標(biāo)曲線法、內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法、內(nèi)標(biāo)曲線法對島津的Solution工作站進(jìn)行驗(yàn)證// 比較手動計(jì)算與工作站計(jì)算的差別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用一點(diǎn)法測定時(shí)，手動計(jì)算與工作站計(jì)算有差別，需進(jìn)行修正，采用曲線法進(jìn)行計(jì)算時(shí)，手動計(jì)算與工作站計(jì)算一致，可直接計(jì)算。

隨著現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的發(fā)展，色譜法由于其準(zhǔn)確度、精密度好，逐漸替代了傳統(tǒng)的容量分析法和光譜法，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、石油化工、生命科學(xué)等領(lǐng)域。色譜法除了準(zhǔn)確度高、精密度好外，還有很多優(yōu)點(diǎn)，如：分離效率高；分析速度快；樣品用量少；靈敏度高；易于自動化等。色譜法的自動化主要通過色譜工作站來完成，色譜工作站是一種輔助色譜儀器采樣、收集色譜檢測器當(dāng)中的電壓信號數(shù)據(jù)分析處理的工作站輔助軟件。

色譜分析中，采用計(jì)算機(jī)技術(shù)的色譜工作站普遍提高了分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，基本消除了人為誤差，對于分離不理想的色譜峰還可以進(jìn)行優(yōu)化處理，彌補(bǔ)分離過程的不足。色譜工作站的自動化計(jì)算可以減輕數(shù)據(jù)分析的工作量，通過輸入標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度，建立數(shù)據(jù)處理的方法，當(dāng)輸入樣品的體積、稱重、稀釋倍數(shù)時(shí)，就可以得到最終的結(jié)果，特別是對于批量處理，更為方便。

實(shí)驗(yàn)部分

儀器與試劑

1.儀器

LC-2010高效液相色譜儀（島津公司），帶紫外檢測器；

GC-2010氣相色譜儀（島津公司），帶FID檢測器、頂空進(jìn)樣器；

AL204電子天平（梅特勒公司）。

2.試劑

甲硝唑片、甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品；

紫草油、紫草素標(biāo)準(zhǔn)品；

維生素E、維生素E標(biāo)準(zhǔn)品；

異三十烷、環(huán)己烷、紫草素、乙醇、異丙醇、甲醇，均為色譜純。

Solution工作站的驗(yàn)證

1.外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)一點(diǎn)法）

采用甲硝唑片的含量測定進(jìn)行驗(yàn)證，測定方法如下：采用高效液相色譜法，C18色譜柱，以甲醇：水（20:80）為流動相，檢測波長為320 nm。取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于甲硝唑0.25 g），置50 mL量瓶中，加50%甲醇適量，振搖使甲硝唑溶解，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取甲硝唑?qū)φ掌愤m量，精密稱定，加流動相溶解定量稀釋制成每1 mL中約含0.25 mg的溶液，同法測定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

2.外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）

采用紫草油中紫草素的測定方法進(jìn)行驗(yàn)證，測定方法如下：采用RP-HPLC法進(jìn)行測定，以C18為色譜柱，以甲醇-水（85:15）；檢測波長為516 nm。取本品0.5 g，精密加入無水乙醇10 mL，采用空氣恒溫?fù)u床振搖提取，并設(shè)置提取溫度為40℃，提取轉(zhuǎn)速為200 r/min，提取時(shí)間為10 min，取上清液作為供試品溶液，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取紫草素標(biāo)準(zhǔn)品，配制成4 μg/mL～0 μg/mL 的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，同法測定，按外標(biāo)曲線法以峰面積計(jì)算，即得。

3.內(nèi)標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)一點(diǎn)法）

采用維生素E的含量測定進(jìn)行驗(yàn)證，測定方法如下：采用氣相色譜法，HP-1色譜柱，氫火焰離子化檢測器，設(shè)置柱溫為265℃。取正三十二烷適量，加正己烷溶解并稀釋成每1 mL中含1.0 mg的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。另取維生素E對照品約20 mg，精密稱定，置棕色具塞瓶中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液10 mL，密塞，振搖使溶解，作為對照品溶液，取1～3 μL注入氣相色譜儀，計(jì)算校正因子。取本品約20 mg，精密稱定，置棕色具塞瓶中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液10 mL，密塞，振搖使溶解，作為供試品溶液，取1～3 μL注入氣相色譜儀，測定，計(jì)算，即得。

表1 甲硝唑?qū)φ掌沸Ｕ蜃佑?jì)算結(jié)果。

表2 甲硝唑片含量計(jì)算結(jié)果。

4.內(nèi)標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）

采用紫草素中的乙醇?xì)埩魷y定進(jìn)行驗(yàn)證，測定方法如下：采用頂空氣相色譜法，DB-624色譜柱，氫火焰離子化檢測器，設(shè)置柱溫為50℃，設(shè)置頂空平衡溫度為70℃，保溫時(shí)間8 min，進(jìn)樣時(shí)間0.04 min。取異丙醇適量，加0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液稀釋成每1ml中含10 mg的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。另取乙醇對照品適量，加0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液稀釋成每1 mL中含10 mg的溶液，作為對照品儲備液。取對照品儲備液 各 0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、2 mL，分別加入1 ml內(nèi)標(biāo)溶液，加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液至10 mL，配制成濃度分別為0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/ml、0.8 mg/mL、2.0 mg/mL的溶液。稱取樣品0.5 g，精密稱定，加內(nèi)標(biāo)溶液1mL，密塞，加0.1 moL/L的氫氧化鈉溶液至10 mL，作為樣品溶液，分別測定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，即得。

結(jié)果與分析

外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)一點(diǎn)法）

1.校正因子的計(jì)算

按上述甲硝唑片含量測定的方法進(jìn)行測定，配制兩份對照品，分別進(jìn)樣5次和2次，采用外標(biāo)法，設(shè)定級別數(shù)為2，校準(zhǔn)曲線類型為直線，分別采用手動計(jì)算和工作站計(jì)算校正因子，結(jié)果見表1。

由表1可以看出，在計(jì)算校正因子時(shí)，工作站計(jì)算與手動計(jì)算結(jié)果是一致的。

2.樣品含量的計(jì)算

按上述甲硝唑片含量測定的方法進(jìn)行測定，配制兩份樣品溶液，各進(jìn)樣2次，分別采用手動計(jì)算和工作站計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

由表2可以看出，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品含量時(shí)，手動計(jì)算和工作站計(jì)算有略微的差異，這將影響到準(zhǔn)確的結(jié)果。

3.數(shù)據(jù)的修正

將數(shù)據(jù)處理方法另存，在新的數(shù)據(jù)處理方法中的校準(zhǔn)曲線類型改為“手動RF（線性）”，并在組分表中輸入由第一個(gè)數(shù)據(jù)處理方法計(jì)算出來的平均校正因子，采用此方法對樣品進(jìn)行重新計(jì)算，得出的含量值分別為：99.989%、100.078%、100.804%、100.868%，平均值為100.435%。由數(shù)據(jù)可以看出，采用修正后的方法進(jìn)行計(jì)算，與手動計(jì)算的結(jié)果一致，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

表3 紫草素對照品線性方法擬合結(jié)果。

表4 紫草油中紫草素含量計(jì)算結(jié)果。

外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）

1.線性方法的擬合

按上述紫草油中紫草素的測定方法進(jìn)行測定，配制5份對照品溶液，分別進(jìn)樣1次，采用外標(biāo)法，設(shè)定級別數(shù)為5，校準(zhǔn)曲線類型為直線，以峰面積為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，分別采用手動計(jì)算和工作站擬合線性方法，結(jié)果見表3。

表5 維生素E對照品校正因子計(jì)算結(jié)果。

表6 維生素E含量計(jì)算結(jié)果。

表7 乙醇對照品校正因子計(jì)算結(jié)果。

表8 乙醇含量計(jì)算結(jié)果。

由表3可以看出，采用手動計(jì)算和工作站計(jì)算得到的擬合曲線基本一致。

2.樣品含量的計(jì)算

按上述紫草油中紫草素的測定方法進(jìn)行測定，配制兩份樣品溶液，各進(jìn)樣2次，分別采用手動計(jì)算和工作站計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

由表4可以看出，采用外標(biāo)曲線點(diǎn)法計(jì)算樣品含量時(shí)，手動計(jì)算和工作站計(jì)算結(jié)果是一致的。

內(nèi)標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)一點(diǎn)法）

1.校正因子的計(jì)算

按維生素E含量測定的方法進(jìn)行測定，配制兩份對照品，分別進(jìn)樣5次和2次，采用內(nèi)標(biāo)法，設(shè)定級別數(shù)為2，校準(zhǔn)曲線類型為直線，分別采用手動計(jì)算和工作站計(jì)算校正因子，結(jié)果見表5。

由表5可以看出，在計(jì)算校正因子時(shí)，工作站計(jì)算與手動計(jì)算結(jié)果基本一致的。

2.樣品含量的計(jì)算

按維生素E含量測定的方法進(jìn)行測定，配制兩份樣品溶液，各進(jìn)樣2次，分別采用手動計(jì)算和工作站計(jì)算含量，結(jié)果見表6。

由表6可以看出，采用內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品含量時(shí)，手動計(jì)算和工作站計(jì)算有略微的差異，這將影響到準(zhǔn)確的結(jié)果。

3.數(shù)據(jù)的修正

將數(shù)據(jù)處理方法另存，在新的數(shù)據(jù)處理方法中的校準(zhǔn)曲線類型改為“手動RF（線性）”，并在組分表中輸入由第一個(gè)數(shù)據(jù)處理方法計(jì)算出來的平均校正因子，采用此方法對樣品進(jìn)行重新計(jì)算，得出的含量值分別為：100.583%、99.764%、99.303%、99.524%， 平 均 值 為99.793%。由數(shù)據(jù)可以看出，采用修正后的方法進(jìn)行計(jì)算，與手動計(jì)算的結(jié)果一致，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

內(nèi)標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）

1.線性方法的擬合

按紫草素中乙醇的測定方法進(jìn)行測定，配制6份對照品溶液，分別進(jìn)樣1次，采用內(nèi)標(biāo)法，設(shè)定級別數(shù)為6，校準(zhǔn)曲線類型為直線，以對照品峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積為橫坐標(biāo)，對照品濃度/內(nèi)標(biāo)濃度為縱坐標(biāo)，分別采用手動計(jì)算和工作站擬合線性方法，結(jié)果見表7。

由表7可以看出，采用手動計(jì)算和工作站計(jì)算得到的擬合曲線基本一致。

2.樣品含量的計(jì)算

按維紫草素中的乙醇?xì)埩魷y定方法進(jìn)行測定，配制兩份樣品溶液，各進(jìn)樣2次，分別采用手動計(jì)算和工作站計(jì)算含量，結(jié)果見表8。

由表8可以看出，采用內(nèi)標(biāo)曲線點(diǎn)法計(jì)算樣品含量時(shí)，手動計(jì)算和工作站計(jì)算結(jié)果是一致的。

討論

標(biāo)準(zhǔn)一點(diǎn)法

使用外標(biāo)一點(diǎn)法及內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行計(jì)算時(shí)，采用平均校正因子進(jìn)行計(jì)算樣品含量，為消除偶然誤差，一般要稱取對照品兩份，其中一份對照品溶液進(jìn)樣5次，考察儀器的進(jìn)樣重復(fù)性，另一份對照品進(jìn)樣2次，以7針的校正因子計(jì)算平均值，計(jì)算樣品的含量。而儀器在計(jì)算時(shí)均采用斜率法進(jìn)行測定，按7針進(jìn)行線性擬合后，計(jì)算斜率和截距后進(jìn)行計(jì)算，因此有偏差。無論是外標(biāo)一點(diǎn)法還是內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法，對計(jì)算方法均需進(jìn)行校正，在得到平均校正因子后，改為手動校正因子進(jìn)行計(jì)算。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法

使用外標(biāo)曲線法和內(nèi)標(biāo)曲線法進(jìn)行計(jì)算時(shí)，采用斜率法進(jìn)行計(jì)算含量，與工作站計(jì)算方法一致，因此可直接計(jì)算。

結(jié)論

采用單點(diǎn)校正法時(shí)，需采用兩個(gè)數(shù)據(jù)處理方法，先求出平均校正因子，再選擇手動RF值進(jìn)行計(jì)算。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法時(shí)，可直接采用1個(gè)數(shù)據(jù)處理方法即可。