潘曉雪，胡明瑜，蔣曉英，白文欽，官 玲，吳 紅，雷開榮

（重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心/逆境農(nóng)業(yè)研究重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401329）

磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)信號(hào)通路是植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的一種重要的胞內(nèi)信使系統(tǒng)，在植物生長發(fā)育和對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[1]。磷脂酰肌醇信號(hào)調(diào)控是通過一系列肌醇激酶和肌醇磷酸酶來實(shí)現(xiàn)的，其中多磷酸激酶是磷脂酰肌醇信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵酶。多磷酸激酶是一類磷酸肌醇6-/3-雙激酶，它能夠在6位和3位磷酸化Ins (1,4, 5) P3生成Ins (1, 4, 5) P4并進(jìn)一步生成Ins (1, 4, 5)P5。多磷酸激酶最早在酵母中被發(fā)現(xiàn)并稱為IPK2(inositol polyphosphate kinase)，但其在哺乳動(dòng)物中通常又叫做IPMK (inositol polyphosphate multkinase)[2-4]。最早通過同源性比對(duì)從擬南芥中鑒定出來兩個(gè)多磷酸肌醇激酶，分別命名為AtIPK2α和AtIPK2β，生化分析實(shí)驗(yàn)證明AtIPK2α和AtIPK2β都具有多磷酸肌醇激酶家族代表性的6-/3-雙激酶催化活性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)AtIPK2β很可能也參與植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控[5-6]，此后多磷酸肌醇激酶基因陸續(xù)從水稻、馬鈴薯和鹽芥中克隆出來[7-9]。AtIPK2β不僅可以互補(bǔ)酵母scipk2突變體在正常條件下生長緩慢的缺陷，而且還能提高其在鹽、滲透以及高溫條件下的生長耐受力，暗示AtIPK2β很可能還參與逆境應(yīng)答過程[6,10]。與野生型相比，異源表達(dá)AtIPK2β的轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)鹽、干旱以及氧化脅迫表現(xiàn)出明顯的耐受性，轉(zhuǎn)AtIPK2β基因煙草能夠通過減少鈉離子積累，增加脯氨酸含量和過氧化氫酶活性，并表達(dá)應(yīng)激相關(guān)基因以提高煙草的耐脅迫能力[10]。OsIPK2在水稻多種組織中都有表達(dá)，而且同樣能夠互補(bǔ)酵母scipk2突變體的生長缺陷[7]。鹽芥是一種新型耐鹽模式植物, 序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)鹽芥TsIPK2與AtIPK2β具有較高的同源性，也能夠互補(bǔ)脅迫處理下酵母scipk2突變體的生長缺陷表型。過量表達(dá)TsIPK2可以增加轉(zhuǎn)基因油菜對(duì)鹽、干旱和氧化脅迫的耐受性[9]。過量表達(dá)鹽芥TsIPK2的大豆株系比受體品種具有更高的耐鹽脅迫能力[11]。以上這些研究表明參與逆境應(yīng)答很可能是植物IPK2基因一個(gè)較為普遍的功能。

水稻是我國主要的糧食作物，隨著人口增加和鹽漬化土地面積的不斷擴(kuò)大，培育耐逆水稻品種已成為當(dāng)務(wù)之急，在此基礎(chǔ)上，本研究將鹽芥TsIPK2基因通過農(nóng)桿菌浸染愈傷法在水稻中進(jìn)行過量表達(dá)，利用NaCl模擬鹽脅迫環(huán)境，研究TsIPK2基因在植物耐鹽脅迫中的作用，以期揭示TsIPK2基因的耐逆機(jī)制，豐富TsIPK2基因的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料粳稻‘秀水03’ (WT)由本中心保存；上海植生所張洪霞研究員提供過量表達(dá)TsIPK2(Gen-Bank登錄號(hào)為EF110977)基因載體(pCAMBIA1301-TsIPK2)[9]。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)TsIPK2基因水稻株系的獲得及分子檢測(cè)

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)愈傷轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株，幼苗生長旺盛后，取葉片提取基因組DNA，并使用TsIPK2基因開放閱讀框(open reading frame,ORF)的特異性引物(正向引物: 5′- ATGCTCAAG GTCCCTGAACAC-3′； 反向引物: 5′-CTAGTGCC CGTTTTCAAGCTG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)目的條帶, 篩選出基因組中有TsIPK2基因整合的水稻植株，獲得T1代種子。利用Trizol試劑(Invitrogen)參照說明書提取T1代轉(zhuǎn)基因幼苗RNA，按照說明書取2～3 μg RNA用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)進(jìn)行cDNA的第一鏈合成, 反轉(zhuǎn)錄后用TsIPK2基因ORF區(qū)特異性引物(正向引物: 5′-CGGATGTGTCGGAAGAATACT-3′，反向引物: 5′-GCGAAATCCACCAGCTTTAC-3′)進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增, 選用水稻ubiquitin 1(OsRub1)基因(正向引物: 5′-GACAATGTGAAAGCCAAGATC-3′，反向引物: 5′-GACTCAACCTCAAGGGTAATG-3′)作為內(nèi)參基因，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果，驗(yàn)證TsIPK2基因是否能在水稻中正常表達(dá)。鑒定的陽性植株幼苗移栽到試驗(yàn)田中繼續(xù)生長以收獲T2代種子，自交純化后得到T3代植株用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 水稻種子萌發(fā)的測(cè)定 挑選T3代籽粒飽滿、大小一致的轉(zhuǎn)基因株系(Line 2和Line 3)和秀水03 (WT)種子，種子在50℃烘箱中干燥2天，打破休眠。然后將種子用0.1%(w/v)的HgCl消毒10 min，然后用蒸餾水沖洗干凈。將種子放入培養(yǎng)皿(皿底墊兩層濾紙) 中，每個(gè)培養(yǎng)皿中放50粒種子，采用NaCl單鹽溶液進(jìn)行處理，設(shè)置0、50、100、150、200 mmol/L 5個(gè)體積濃度梯度，處理組分別加入10 mL NaCl水溶液，對(duì)照組加入等量的蒸餾水，將培養(yǎng)皿放置在30℃的黑暗條件下萌發(fā)，至第10天記錄種子發(fā)芽率(以芽長達(dá)到種子長度一半，根長達(dá)到種子長度作為種子發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn))，三次重復(fù)，每一重復(fù)隨機(jī)取30粒測(cè)量芽長、主根長，計(jì)算平均值。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因水稻植株的耐鹽性分析 將種子按上述方法進(jìn)行消毒并用蒸餾水沖洗干凈，然后在37℃培養(yǎng)箱中浸種催芽2天，將露白種子直接播于96孔PCR板上，將PCR板置于塑料盒中，在26℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)生長，光照強(qiáng)度2500 lx、光照14 h。待苗長至3葉期時(shí)剔除弱苗，選取均勻一致的幼苗用0、50、100、150、200 mmol/L的NaCl處理，每3天換1次營養(yǎng)液，處理2周后選取葉片測(cè)定各項(xiàng)生理生化指標(biāo)，每個(gè)處理重復(fù)3次。在南京建成生物工程公司購買脯氨酸、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)檢測(cè)試劑盒，各生理指標(biāo)的測(cè)定均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.4 脅迫處理下TsIPK2基因的表達(dá)分析 取脅迫處理前后的樣品，方法同上。基因特異性引物(表1)設(shè)計(jì)由Primer 5.0完成，PCR在定量PCR儀(Applied Biosystems 7500，F(xiàn)oster City，USA)上進(jìn)行，用 SYBR Green I dye (Takara Bio Inc.，Otsu，Japan)進(jìn)行分析。qRT-PCR反應(yīng)條件為：初始變形95℃，30 min；然后95℃，5 min，58℃，34 min，重復(fù)上述兩步40次；融解階段為95℃，15 min，60℃，60 min，95℃，15 min。水稻ubiquitin 1(OsRub1)(GenBank登錄號(hào)：AF184729)基因作為內(nèi)參。qRTPCR的樣品包括3次生物重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)、表及文字處理采用Office 2007軟件，其中部分?jǐn)?shù)據(jù)用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用OriginPro8繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)

在本研究中，再生植株DNA使用TsIPK2基因的特異性引物擴(kuò)增。轉(zhuǎn)TsIPK2基因水稻的3個(gè)株系中均擴(kuò)增出一條約882 bp的特異性帶，在野生型植株中未檢測(cè)到相同的條帶(圖1A)，表明TsIPK2基因已成功整合到水稻基因組中。然后提取植株RNA，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)(圖1B)，結(jié)果顯示TsIPK2基因能夠在水稻中正常表達(dá)。

2.2 TsIPK2在鹽脅迫下的表達(dá)分析

分別提取水稻三葉期幼苗在200 mmol/L的NaCl處理0、1、3、6、12和24 h的葉片總RNA，以水稻ubiquitin 1(OsRub1)基因作為內(nèi)參，分析在鹽脅迫下TsIPK2的表達(dá)特征。在200 mmol/L的NaCl處理下，TsIPK2的轉(zhuǎn)錄水平在處理1 h后增加，3 h后達(dá)到峰值，6 h后下降，隨著處理時(shí)間的延長，依然高于未處理時(shí)的表達(dá)水平(圖2)。這表明在鹽脅迫下TsIPK2基因在脅迫下能迅速響應(yīng)。

2.3 鹽脅迫對(duì)水稻種子發(fā)芽率的影響

隨著NaCl濃度的增加，轉(zhuǎn)基因株系和野生型發(fā)芽率都受到抑制，但野生型發(fā)芽率顯著低于轉(zhuǎn)基因株系(圖3)。在150 mmol/L NaCl的處理下，轉(zhuǎn)基因株系的發(fā)芽率均在60%以上，而野生型的發(fā)芽率在30%左右。這表明野生型水稻種子的發(fā)芽率在高濃度NaCl處理下受到更顯著的抑制(圖3)。

表 1 用于實(shí)時(shí)定量PCR分析的引物信息Table 1 Genes specific primers used for quantitative RT-PCR analysis

圖 1 轉(zhuǎn)基因水稻的PCR和RT-PCR檢測(cè)Fig. 1 PCR and RT-PCR detection in different transgenic rice lines

圖 2 TsIPK2在高鹽脅迫下的表達(dá)特征Fig. 2 Expression of TsIPK2 under salt stress

2.4 鹽脅迫對(duì)水稻種子幼根及芽生長的影響

與野生型相比，不同濃度鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻的根長和芽長均高于對(duì)照，在200 mmol/L NaCl處理下，轉(zhuǎn)基因水稻L2和L3株系的平均芽長比野生型分別高出8.2%和11.6%，平均根長比野生型分別高出17.1%和19.1%，說明轉(zhuǎn)基因水稻具有較好的生長優(yōu)勢(shì) (圖 4)。

圖 3 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的發(fā)芽率Fig. 3 Germination rate of two transgenic rice lines under salt stress

2.5 鹽脅迫對(duì)水稻生理指標(biāo)的影響

圖 4 不同鹽濃度脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻的根長和芽長Fig. 4 Root and shoot length of transgenic rice under different salt stress concentrations

2.5.1 鹽脅迫下水稻的脯氨酸和丙二醛(MDA)含量正常生長條件下，轉(zhuǎn)基因水稻葉片的脯氨酸含量略高于野生型。鹽脅迫處理14 d后，野生型和轉(zhuǎn)基因水稻葉片中的脯氨酸含量都急劇增加，但轉(zhuǎn)基因水稻積累更多游離脯氨酸。在150 mmol/L NaCl濃度下，轉(zhuǎn)基因株系L2和L3的脯氨酸含量的增幅分別是野生型的1.29倍和1.34倍；在200 mmol/L NaCl濃度下，脯氨酸在轉(zhuǎn)基因株系L2和L3中的含量分別是野生型植株的1.71和1.55倍，更有利于轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)(圖5)。

野生型和轉(zhuǎn)基因水稻的MDA含量在鹽脅迫處理前無顯著差異。隨著NaCl處理濃度的增加，所有植株MDA含量都有所增加，但轉(zhuǎn)基因水稻體內(nèi)MDA含量都低于野生型植株。在200 mmol/L NaCl濃度下，野生型水稻的MDA含量增加了2.12倍，而轉(zhuǎn)基因水稻L2和L3的MDA含量分別增加了1.33和1.05倍，野生型水稻的MDA含量明顯高于轉(zhuǎn)基因水稻 (圖 5)。

2.5.2 鹽脅迫對(duì)水稻SOD、POD和CAT活性的影響

鹽脅迫處理前野生型和轉(zhuǎn)基因水稻SOD酶活性無顯著差異。隨著NaCl濃度的增加，野生型和轉(zhuǎn)基因水稻SOD酶活性在鹽脅迫下顯著增加。在200 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因水稻株系L2和L3的SOD酶活性分別是野生型水稻的1.95和1.75倍，說明鹽脅迫可以提高轉(zhuǎn)基因水稻SOD酶活性，加強(qiáng)了對(duì)活性氧的清除，降低對(duì)植物體的傷害(圖6)。鹽脅迫處理前野生型和轉(zhuǎn)基因水稻POD酶活性無顯著差異。隨著NaCl濃度的增加，野生型和轉(zhuǎn)基因水稻的POD活性迅速增加，并在100 mmol/L NaCl脅迫下達(dá)到最大值，然后降低。然而，轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻之間的POD活性沒有顯著差異(圖6)。

鹽脅迫處理前野生型和轉(zhuǎn)基因水稻的CAT酶活性沒有顯著差異。不同濃度NaCl處理后，轉(zhuǎn)基因水稻CAT活性迅速增加，并在100 mmol/L NaCl脅迫下達(dá)到最大值。轉(zhuǎn)基因水稻株系L2的CAT酶活性從35.55上升至71.95 U/mg, FW，上升了1.02倍，L3的由40.91上升至68.18 U/mg, FW，上升了66.7%。然而，野生型水稻的CAT酶活性在不同的鹽脅迫下沒有顯著變化(圖6)。

圖 5 鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻脯氨酸和丙二醛含量的影響Fig. 5 Effects of salt stress on proline and MDA content in the transgenic rice

圖 6 不同濃度鹽脅迫轉(zhuǎn)基因水稻中SOD、POD和CAT的活性Fig. 6 Activities of SOD, POD and CAT in the transgenic rice under different salt stress concentrations

2.6 鹽脅迫對(duì)水稻脅迫相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了揭示轉(zhuǎn)基因型水稻的耐鹽分子機(jī)制，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析在200 mmol/L的鹽脅迫下5個(gè)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)模式。這5個(gè)脅迫相關(guān)基因分別是脯氨酸合成關(guān)鍵酶基因(OsP5CS1)、活性氧解毒酶基因(OsSOD、OsPOX1和OsCATB)以及逆境響應(yīng)蛋白(OsLEA3)。結(jié)果表明，與野生型水稻相比，OsP5CS1、OsCATB、OsSOD和OsLEA3在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)倍數(shù)顯著增加，而OsPOX1的表達(dá)倍數(shù)沒有明顯變化(圖7)。

圖 7 野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因水稻株系(L2，L3)葉片脅迫應(yīng)答基因在正常和鹽脅迫(200 mmol/L NaCl)下表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR分析Fig. 7 Quantitative real-time PCR analysis of stress responsive genes expression in the leaves of WT and transgenic plants (L2, L3) grown under H2O and stress of 200 mmol/L NaCl

3 討論與結(jié)論

土壤鹽漬化是影響植物生長發(fā)育和農(nóng)作物產(chǎn)量的最重要的環(huán)境因子之一，通過基因工程改善作物的耐鹽性已受到廣泛關(guān)注[12]。過量表達(dá)TsIPK2可以增加轉(zhuǎn)基因油菜和大豆的耐鹽脅迫能力[9,11]。因此筆者認(rèn)為鹽芥肌醇多磷酸激酶的表達(dá)可能賦予農(nóng)作物的耐脅迫能力。

在本研究中，將TsIPK2基因轉(zhuǎn)入水稻，TsIPK2在脅迫下的表達(dá)模式類似于在鹽芥中的表達(dá)，TsIPK2mRNA在鹽處理1 h后累積，在脅迫3 h后表達(dá)量達(dá)到最大值，6 h后降低，表明在水稻中TsIPK2的表達(dá)受高鹽誘導(dǎo)(圖2)。正常生長環(huán)境條件下，TsIPK2過表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻植株無顯著影響，在150 mmol/L NaCl的處理下，轉(zhuǎn)基因株系的發(fā)芽率均在60%以上，而野生型的發(fā)芽率在30%左右；在200 mmol/L NaCl處理下，轉(zhuǎn)基因水稻L2和L3株系的平均芽長比野生型分別高出8.2%和11.6%(圖3)，說明轉(zhuǎn)基因水稻具有較好的耐脅迫能力。

非生物脅迫引起植物葉片或根部細(xì)胞膜脂不飽和脂肪酸的過氧化作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性的增加和抗氧化酶活性降低[13]，膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量的變化可以反映細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷程度[14]。在本研究中，隨著NaCl處理濃度的增加，野生型和轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片MDA含量都有所增加，在200 mmol/L NaCl濃度下，野生型水稻的MDA含量增加了2.12倍，而轉(zhuǎn)基因水稻L2和L3的MDA含量分別增加了1.33和1.05倍，轉(zhuǎn)基因水稻體內(nèi)MDA含量在鹽脅迫下的積累量明顯低于野生型植株(圖5)，說明轉(zhuǎn)TsIPK2基因水稻的膜脂過氧化程度較弱，細(xì)胞膜損傷較小。非生物脅迫如干旱、高溫、冷害和鹽堿等可誘發(fā)植物組織細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，但過多ROS的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞的死亡，因此植物建立抗氧化保護(hù)系統(tǒng)應(yīng)對(duì)脅迫下ROS的過多積累[15]。超氧化物歧化酶(SOD)通過Harber-weiss循環(huán)催化歧化成O2和H2O2，產(chǎn)生的H2O2主要由過氧化氫酶(CAT)與過氧化物酶(POD)清除[16]。本研究中，野生型和轉(zhuǎn)基因水稻的POD酶活性在鹽脅迫下迅速增加，并在100 mmol/L NaCl脅迫下達(dá)到最大值，但轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻中POD酶活性無顯著差異；在200 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因水稻L2和L3的SOD酶活性分別是野生型的1.95和1.75倍；在100 mmol/L NaCl脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻L2和L3的CAT酶活性達(dá)到最大值，轉(zhuǎn)基因水稻L2和L3分別上升了1.02倍和66.7%，但野生型水稻的CAT活性沒有明顯變化(圖6)。脅迫產(chǎn)生的自由基在SOD和CAT兩者協(xié)調(diào)作用下維持在較低水平，從而減少膜的損傷，提高轉(zhuǎn)基因植株的耐逆性。

植物在受到非生物脅迫后通過調(diào)節(jié)逆境響應(yīng)基因的表達(dá)，形成植物抗逆的分子機(jī)制，從而抵御非生物脅迫的影響[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在200 mmol/L的NaCl脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻的活性氧解毒酶基因(OsCATB和OsSOD)的表達(dá)倍數(shù)顯著增加，與體內(nèi)檢測(cè)到的抗氧化酶活性的結(jié)果一致(圖6、圖7)。在干旱、鹽漬等脅迫條件下，大量的游離脯氨酸作為細(xì)胞質(zhì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在植物中積累。OsP5CS1是脯氨酸合成的關(guān)鍵限速酶，OsP5CS1的表達(dá)受高鹽、干旱、冷脅迫和ABA處理的誘導(dǎo)，而不受熱處理誘導(dǎo)，在高鹽條件下，耐鹽品種中OsP5CS1的表達(dá)量比鹽敏感品種中的表達(dá)量高，從而積累更多的脯氨酸提高耐鹽性[18-20]。本研究表明，隨著鹽濃度的增加，野生型和轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片脯氨酸含量增加，在200 mmol/L NaCl濃度下，轉(zhuǎn)基因株系L2和L3中脯氨酸的含量分別是野生型植株的1.71和1.55倍(圖5)，同時(shí)轉(zhuǎn)基因水稻株系中OsP5CS1的表達(dá)量顯著高于野生型水稻(圖7)，暗示轉(zhuǎn)入的TsIPK2基因在維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡中發(fā)揮了一定作用。OsLEA3屬于LEA蛋白基因家族, 在逆境條件下能夠保護(hù)生物大分子及膜結(jié)構(gòu), 干旱、鹽和脫落酸等脅迫可誘導(dǎo)OsLEA3的表達(dá)[21]，轉(zhuǎn)TsIPK2基因水稻OsLEA3基因的表達(dá)量顯著增加有助于減輕因鹽脅迫脫水引起的離子強(qiáng)度增大對(duì)生物膜和功能蛋白的毒害，提高轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽性(圖7)。本研究結(jié)果證明TsIPK2基因可以影響轉(zhuǎn)基因水稻的脅迫耐受能力，有望通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高該基因表達(dá)水平進(jìn)而增強(qiáng)植物耐鹽能力。