沈增貴，鄧紅玉，林學祥

1.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院 設備器材科，廣東 廣州510515；2.南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 康復科，廣東 廣州 510000；3.中國科學院深圳先進技術(shù)研究院 生物醫(yī)學與健康工程研究所，廣東 深圳518055

引言

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體（抗原）技術(shù)，它是利用抗原、抗體特異性結(jié)合的特點，可以準確快速地檢測待測物（抗原）的含量[1]。免疫熒光技術(shù)的原理是在硝酸纖維素膜的測試區(qū)（T）包被BSA與抗原的偶聯(lián)物，標記墊上含有預先包被的熒光標記抗體。檢測時，首先用處理試劑將樣本中的抗原與標記墊上的熒光標記抗體發(fā)生結(jié)合，形成免疫復合物，復合物在層析作用下沿著硝酸纖維素膜向前擴散至包被有另一種單克隆抗體的檢測區(qū)，從而形成雙抗體夾心復合物，而游離的熒光抗體則附著在質(zhì)控區(qū)[2]。當檢測卡插入干式熒光免疫分析儀后，分析儀自動掃描檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光強度，通過兩種熒光強度的比值計算待測樣本中的抗原含量。免疫熒光分析技術(shù)具有靈敏度高、特異性強等特點，在床旁即時檢測（Point-of-Care Testing，POCT）領(lǐng)域上應用廣泛，比如定量檢測血清、血漿、全血樣本中C-反應蛋白、糖化血紅蛋白、甲胎蛋白、降鈣素原等物質(zhì)的含量。免疫熒光耗材保存要求低、操作簡便，適合中小醫(yī)療單位推廣使用[3-4]。

光學模塊是免疫熒光分析儀的核心模塊。當前免疫熒光光學模塊，大多包括激光光源、二向分色片、透鏡、濾光片、光電轉(zhuǎn)換器件等[5]。光學器件較多，成本高，安裝與維護復雜，對使用環(huán)境有一定的要求。另外，大多光學模塊采用“電機-皮帶”或者“電機-齒輪”的動力與傳動機構(gòu)[6]。多個運動機構(gòu)的組合，不僅增加了設備的體積與重量，機構(gòu)間的間隙還容易帶來誤差。復雜的光路、運動機構(gòu)設計使設備在野戰(zhàn)、救災、移動醫(yī)療等領(lǐng)域作用受限[7]。因此，需要提出一種新的設計方式，簡化光路與運動部件，同時具有測試卡插入檢測功能、廢片自動拋棄功能，且性能參數(shù)達到行業(yè)標準。

1 硬件部分

硬件部分采用上下位機的結(jié)構(gòu)。上位機負責GUI顯示、IC模塊通訊以及連接打印機；下位機主要完成測試功能，可連接多個通道，包括控制各個通道的光源恒流電路、電機控制以及光強檢測。整機結(jié)構(gòu)框架如圖1所示。

圖1 整機結(jié)構(gòu)框圖

（1）上位機，即控制板，采用工控板為平臺。操作系統(tǒng)、應用軟件以及數(shù)據(jù)庫運行在該平臺上。應用軟件用于與客戶交互，接收操作指令，分解測試步驟，并將測試步驟通過串口下發(fā)到下位機；獲取下位機返回的測試數(shù)據(jù)后，應用軟件計算出檢測結(jié)果；可以通過打印機打印，也可以存儲在本地數(shù)據(jù)庫，或者通過網(wǎng)口上傳到LIST系統(tǒng)。

（2）下位機，即測試板，使用80C51作為MCU，通過RS232與上位機通訊。下位機檢測到微動開關(guān)信號后，發(fā)送命令通知上位機啟動檢測程序；獲得上位機的檢測參數(shù)后，下位機通過調(diào)整數(shù)字變阻器來調(diào)整光源亮度，通過電機控制與AD采樣時序的配合，實現(xiàn)整個測試卡的掃描，并將掃描結(jié)果返回上位機處理；下位機還具有開機復位、廢片拋樣以及光路異常報警功能。

2 光學部分

光學設計上使用非共聚焦光路方式[8]，如圖2所示。LED光源與試紙條成45°夾角放置，相互對稱，使照射到試紙條上的激發(fā)光盡量均勻。光電二極管位于試紙條正上方，檢測試紙條上被激發(fā)的熒光[9]。LED光源的出射方向上裝有激發(fā)波長濾光片以濾除干擾雜散光，光電二極管前方裝有發(fā)射波長濾光片，讓需要的熒光信號完全通過，同時最大程度地阻止激發(fā)光和各種雜散光進入檢測系統(tǒng)[10]。這種光路結(jié)構(gòu)的優(yōu)點是結(jié)構(gòu)簡單、成本低，光學器件都固定在硬件上，間隙小，抗震抗摔能力強[11]。

圖2 非共聚焦光路

在光源選擇上，采用直徑為5.5 mm的圓子彈頭LED冷光源。濾光片方面，根據(jù)熒光波長，選用中心波長在620 nm、帶寬在10 nm的帶通濾光片。采用硅光二級光作為光電傳感器，傳感器在620 nm上有一定的感光靈敏度[12]。光學模塊3D效果圖如圖3所示。

圖3 光學模塊3D效果圖

傳統(tǒng)的光學檢測法常用激光作為激發(fā)光源[13]。激光光源優(yōu)點是波長精度高、雜波少、信號強，在第值區(qū)間分辨率高；同時缺點也明顯，例如熱漂移明顯，發(fā)光效率隨著使用時間變長而變?nèi)酰枰答?補償電路來確保光強一致，并且聚焦距離大，體積大[14]。目前，越來越多熒光分析儀采用LED作為光源。本設計采用高亮度LED燈，配合前端的帶通濾光片得到單色激發(fā)光，在運動方面采用直接推桿電機，克服傳統(tǒng)的“電機+皮帶”的運動結(jié)果，有效降低機械運動帶來的測試誤差，因此能有效保證測試的精密度與準確性[15]。

3 算法部分

以C反應蛋白項目為例，先對8組定標品測試，獲得對應的測試值，然后采用擬合方程[16]。具體的方法步驟如下。

（1）使用可溯源定標品，濃度為200 mg/L，標定為#1號定標液。使用芬蘭QuikRead產(chǎn)品測試定標液五次，取平均值202.3 mg/L作為參考值。

（2）取#1號定標液100 μL，加入100 μL稀釋液稀釋，定義為#2號定標液。使用芬蘭QuikRead產(chǎn)品測試定標液五次，取平均值98.4 mg/L作為參考值。

（3）取#2號定標液100 μL，加入100μL稀釋液稀釋，定義為#3號定標液。使用芬蘭QuikRead產(chǎn)品測試定標液五次，取平均值49.5 mg/L作為參考值。

（4）取#3號定標液100 μL，加入100μL稀釋液稀釋，定義為#4號定標液。使用芬蘭QuikRead產(chǎn)品測試定標液五次，取平均值23.8 mg/L作為參考值。

（5）取#4號定標液100 μL，加入100 μL稀釋液稀釋，定義為#5號定標液。使用芬蘭QuikRead產(chǎn)品測試定標液五次，取平均值12.2 mg/L作為參考值。

（6）取#5號定標液100 μL，加入100 μL稀釋液稀釋，定義為#6號定標液。使用芬蘭QuikRead產(chǎn)品測試定標液五次，取平均值5.9 mg/L作為參考值。

（7）取#6號定標液100 μL，加入100μL稀釋液稀釋，定義為#7號定標液。使用芬蘭QuikRead產(chǎn)品測試定標液五次，取平均值2.5 mg/L作為參考值。

（8）取#7號定標液100 μL，加入100 μL稀釋液稀釋，定義為#8號定標液。使用芬蘭QuikRead產(chǎn)品測試定標液五次，取平均值1.1 mg/L作為參考值。

各定標品濃度與散射值列表，見表1。通過測試，獲取標準液的測試結(jié)果，并在二維坐標上描點（圖4）。

表1 定標品濃度與散射值列表

圖4 標準品溶液濃度與散射值關(guān)系

如果試劑測試標準物所得的濃度與散射值之間呈現(xiàn)某種線性關(guān)系，可以使用一元線性回歸模型來估算樣本的定量結(jié)果。對于所測得的原始數(shù)據(jù)，建立一元一次線性回歸模型。

設在一次試驗中，取得n對數(shù)據(jù)（xi,yi）（i=1,2,…n），這n對數(shù)據(jù)（xi,yi）就是一組樣本值，根據(jù)這一組樣本值可以尋求一對系數(shù)a和b。但由于y是一個隨機變量，所以如果通過另一組試驗又可得到一對a和b的值[6]，也就是說，可以通過一組數(shù)據(jù)所得到的是系數(shù)a和b的估計值，記作通過一組試驗數(shù)據(jù)所求出的回歸方程如式 (2)。

對于每次試驗取得n對數(shù)據(jù)（xi,yi），記yi是隨機變量y對應于xi的試驗值，記是試驗值yi的回歸值。每一個試驗值yi與回歸值之間的差，可表示為兩個縱坐標之差，這個差有正有負，其絕對值為我們目的是找到一條使所有這些距離之和為最小的一條直線，即最小。但由于絕對值在處理上比較麻煩，所以代之以平方和。

上式或?qū)懗?/p>

如果散點圖上看，接近是二次曲線，則使用一元二次回歸，具體算法是將一元二次回歸轉(zhuǎn)化為二元一次回歸。

設一元二次多項式回歸方程為

然后進行二元線性函數(shù)的回歸分析，得到最后結(jié)果。

計算獲得標準曲線后，存入到IC卡中，隨試劑發(fā)送到用戶。用戶在使用前，先刷IC卡，儀器獲得標準曲線，然后將待測樣本的測試值，代入標準曲線計算，得到濃度值。

4 性能測試

使用精密度、準確性、線性相關(guān)性來對儀器的性能進行評估[17]。

4.1 精密度

精密度以變異系數(shù)CV表示。選取C反應蛋白項目作為測試項目，隨機抽取免疫熒光分析儀一臺，使用濃度為10 mg/L的可溯源質(zhì)控品按正常測試條件共測試10次[18]。按式(10)計算10次結(jié)果的變異系數(shù)CV。

精密度測試結(jié)果，見表2。計算得到儀器精密度為CV=3.9837%，滿足CV不大于5%的要求。

表2 精密度測試結(jié)果

4.2 準確性

選取C反應蛋白項目作為測試項目，隨機抽取免疫熒光分析儀一臺，分別使用濃度為20、70 mg/L的可溯源質(zhì)控品按正常測試條件共測試5次。按式(12)計算低值樣本、中值樣本的準確性。

準確性測試結(jié)果數(shù)據(jù)，見表3。

表3 準確性測試結(jié)果

4.3 線性相關(guān)性測試

選取C反應蛋白項目作為測試項目，隨機抽取免疫熒光分析儀一臺，分別使用濃度為200、103、49.6、25.6、14.4、6.7、3.1 mg/L幾種濃度梯度血清樣本檢測，其中樣本濃度經(jīng)過邁瑞B(yǎng)S-380測試確認靶值。按照式(13)計算各梯度濃度值與標稱濃度值的線性系數(shù)。

線性相關(guān)性測試數(shù)據(jù)，見表4。標稱值與實測值在測試范圍內(nèi)兩者的相關(guān)系數(shù)大于0.99（圖5）。

表4 線性系數(shù)測試結(jié)果

圖5 線性相關(guān)性結(jié)果

5 總結(jié)

一臺專業(yè)的免疫熒光分析儀具有檢測線性范圍寬、重復性好、靈敏度高、檢測速度快的優(yōu)點，本文所描述的一種低成本免疫熒光分析儀的設計方案，具有良好的抗震性能，成本低，體積小，結(jié)構(gòu)簡單。經(jīng)過測試，儀器的精密度、準確性、線性范圍等主要指標均達到行業(yè)平均水平。隨著免疫熒光技術(shù)的不斷成熟，除了在醫(yī)療領(lǐng)域廣泛應用外，還在動植物檢疫、食品安全、農(nóng)藥殘留檢測方面得到了擴展，市場也越來越大，其前景越來越好。