河岸帶內(nèi)生煙曲霉的香豆素類抗氧化產(chǎn)物提高擬南芥抗?jié)澈δ芰ρ芯?/h1>
2019-06-16 10:57:26劉士平薛艷紅
微生物學(xué)雜志 2019年6期
高 媛, 曹 飛， 李 輝， 劉士平， 薛艷紅
(三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002)
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、植物材料 煙曲霉SG-17(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCCM2015286)分離自疏花水柏枝根部，4 ℃石蠟保藏[23]；野生型擬南芥種子(Col-0)由三峽大學(xué)生物技術(shù)中心沈祥陵博士提供。
1.1.2 培養(yǎng)條件 SG-17菌種在PDA培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)5 d后，接種到SDA液體培養(yǎng)搖瓶中(200 mL/500 mL)，28 ℃、140 r/min培養(yǎng)14 d后，提取分離。PDA及SDA培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[23]介紹的方法進(jìn)行配制。將擬南芥種子放入鋪有濕潤(rùn)濾紙片的平皿中，4 ℃冰箱春化3 d，然后均勻點(diǎn)在被花寶溶液(3 g/L)浸濕的滅菌土壤(營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石= 1∶1)里，封上保鮮膜，放入植物培養(yǎng)室(20～22 ℃，16 h/8 h晝夜交替，光照強(qiáng)度為120～150 μmol·m-2·s-1)，3～5 d后摘掉保鮮膜，生長(zhǎng)4周后獲得實(shí)驗(yàn)苗。
1.1.3 儀器與試劑 電子天平(BS-224s，德國(guó)賽多利斯)；不銹鋼智能型立式滅菌鍋(YM30F，上海三申醫(yī)療器械有限公司)；干燥箱/培養(yǎng)箱(PH-030A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；雙人凈化工作臺(tái)(SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備廠)；臺(tái)式恒溫振蕩培養(yǎng)箱(ZQZY-85BN，上海知楚儀器有限公司)；薄層色譜展開(kāi)缸(上海信誼儀器廠有限公司)；三用紫外分析儀(ZF-6，上海嘉鵬科技有限公司)；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(752(N)，上海佑科)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(BC-R203，上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司)；核磁共振波譜儀(400 MHz，德國(guó)Bruker公司)；PCR儀(MyCycler，美國(guó)BIO-RAD公司)；凝膠成像系統(tǒng)(GDS-8000，美國(guó)UVP公司)；水平電泳儀(DYCP-31DN，北京市六一儀器廠)；離心機(jī)(LD4-2A，北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；電熱恒溫水槽(DK-8A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；超低溫冷凍冰箱(DW86L386，Haier)； 微量移液槍(Eppendoff，德國(guó))；qRT-PCR儀(CFX96TMOptics Module)。丙二醛(MDA)測(cè)試盒和超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所，ADHELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于科諾迪生物公司，EASYspin 植物RNA快速提取試劑盒(艾德萊生物公司)。SYBRII購(gòu)自TakaRa公司，1st-Strand cDNA合成試劑盒(GenStar 公司)。
1.2 方法
1.2.1 抗氧化活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析 將在SDA培養(yǎng)14 d的SG-17進(jìn)行真空抽濾，收集發(fā)酵液，等體積乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，42 ℃、0.1 MPa下旋蒸為發(fā)酵液酯相初提物，薄層層析分離發(fā)酵液酯相初提物(展開(kāi)劑為V(石油醚)∶V(丙酮)=1∶1)，經(jīng)抗氧化活性跟蹤，確定活性最強(qiáng)片段，將其進(jìn)行半制備HPLC制備，色譜分離純化條件,流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(水)= 60∶40，流速3.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，分析柱為Cosmosil MS-II RP-C18色譜柱。將得到的單體化合物冷凍干燥后用二甲基亞砜(DMSO)溶解，核磁共振(600 MHz，DMSO-d6)鑒定其結(jié)構(gòu)。單體的抗氧化活性采用總抗氧化能力(T-AOC法，南京建成生物工程研究所)進(jìn)行測(cè)定[23]。
1.2.2 擬南芥水淹脅迫及生理參數(shù)測(cè)定 用不同濃度的NFA(1、10、100 μg/mL)和正對(duì)照水楊酸(SA， 1、10 μg/mL)處理4 h后，全淹法水淹4 d，正常生長(zhǎng)2周后統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)狀況，每盆6株苗，每個(gè)處理3次重復(fù)，生長(zhǎng)條件同1.1.2。硫代巴比妥酸法(TBA)測(cè)定體內(nèi) MDA的含量[25]，氮藍(lán)四唑還原法測(cè)定SOD的含量[25]，雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定ADH的含量[25]，具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。
1.2.3 基因表達(dá)分析 將濃度為1 μg/mL的NFA分別處理擬南芥幼苗1、2、4、6 h，水淹4 d后將大小均一的3～4片葉，用蒸餾水清洗凈、吸水紙吸干后置于液氮中，用EASYspin 植物RNA快
表1 引物序列
速提取試劑盒提取RNA，合成cDNA，具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)所用引物(上海生物工程公司合成)序列見(jiàn)表1。將合成的cDNA母液稀釋5倍，取1 μL加入10 μL SYBII、F和R引物各0.5 μL、ddH2O 8 μL配置成20 μL試驗(yàn)液，加入到96孔板中，封上MicroAmp透明膠膜，以Actin 作為內(nèi)標(biāo)，于qRT-PCR儀中擴(kuò)增30～40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[26]。
1.2.4 數(shù)據(jù)處理 本研究使用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 20.0，采用單因素方差分析(oneway ANOVA)和最小顯著性差異法(LSD)進(jìn)行顯著性分析，用graphpad prism 5軟件作圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 抗氧化活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)解析
前期我們報(bào)道了內(nèi)生煙曲霉SG-17的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)其主效成分與綠原酸有類似的波譜特征[23]。為進(jìn)一步測(cè)定該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，通過(guò)抗氧化活性追蹤和HPLC分析與制備，收集到一淺黃色固體化合物，其總抗氧化活性(T-AOC)高達(dá)131.94 U/mL，是同等濃度下維生素C的18倍。
將該物質(zhì)冷凍干燥后用DMSO溶解，經(jīng)核磁共振分析獲得以下波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6) δH6.64 (d，J=9.8 Hz，1H，H-1)，5.60 (d，J=9.8 Hz，1H，H-2)，7.19 (d，J=8.3 Hz，2H，H-2′/6′)，6.77 (d，J=8.3 Hz，2H，H-3′/5′)，8.10 (s，1H，-CHO)，9.83 (brs，1H，NH);13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6) δC118.2(CH，C-1)，111.3 (CH，C-2)，126.5 (qC，C-1′)，130.1 (CH，C-2′/6′)，116.0 (CH，C-3′/5′)，156.8 (qC，C-4′)，160.5 (CH，-CHO)。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，與文獻(xiàn)報(bào)道的(Z)-N-(4-羥基苯乙烯基)甲酰胺(NFA)一致[27]，證實(shí)了該物質(zhì)與綠原酸同屬香豆素物質(zhì)，分子式為C9H9NO2(圖1)。
圖1 NFA的結(jié)構(gòu)鑒定
2.2 NFA可有效協(xié)助擬南芥抵抗水淹脅迫
前期研究表明，SG-17的抗氧化活性粗提物可以有效協(xié)助水稻抵抗干旱脅迫[24]。由于該菌的宿主疏花水柏枝經(jīng)常生活在一種淹水的環(huán)境中，為了證實(shí)SG-17的代謝產(chǎn)物是否能提高植物的耐淹能力，本研究以擬南芥為試驗(yàn)材料，用不同濃度的NFA進(jìn)行處理，評(píng)價(jià)其對(duì)水淹的效果。首先比較了擬南芥在全淹1、2、4、6 d的生長(zhǎng)狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在水淹4 d的條件下，擬南芥可以正常生長(zhǎng)，但其長(zhǎng)勢(shì)與株高明顯弱于正常生長(zhǎng)的幼苗，故選擇4 d的全淹條件來(lái)評(píng)價(jià)NFA對(duì)水淹的影響。
圖2 NFA對(duì)擬南芥耐水淹能力的影響
將擬南芥的幼苗噴灑不同濃度的NFA后再進(jìn)行水淹處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于對(duì)照(圖2)。濃度為1 μg/mL時(shí)，添加了NFA的幼苗生長(zhǎng)優(yōu)于對(duì)照(圖2A、B)，NFA為100 μg/mL下(圖2D)，水淹后的幼苗生長(zhǎng)接近正常生長(zhǎng)水平(圖2E)。需要指出的是，在相同濃度下，NFA的效果均優(yōu)于正對(duì)照水楊酸(圖2B、C和圖2G、H)，說(shuō)明NFA有效地提高了擬南芥耐水淹的能力。
2.3 NFA對(duì)擬南芥水淹生理的影響
當(dāng)植物在遭受水淹等逆境脅迫時(shí)，由于ROS的影響，使得MDA、SOD、ADH等物質(zhì)的含量常出現(xiàn)變化，因此這些參數(shù)是評(píng)價(jià)逆境脅迫程度或逆境抵抗能力的重要指標(biāo)[24]。為了研究NFA對(duì)擬南芥水淹的生理影響，本研究測(cè)定了NFA在處理不同時(shí)間后MDA、SOD和ADH的含量變化。結(jié)果表明，隨著水淹時(shí)間的延長(zhǎng)，擬南芥體內(nèi)MDA、SOD和ADH的含量均發(fā)生顯著性下降(P<0.01)，在水淹4 d時(shí)，MDA含量下降了51.83%，SOD含量下降了42.92%，ADH含量下降了11.76%(圖3)。但是在擬南芥的正常生長(zhǎng)條件下，用濃度為1 μg/mL的NFA處理一段時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)除了ADH下降外，MDA、SOD含量均明顯上升，其中NFA作用4 h時(shí)達(dá)到最大，分別增加了55.43%和15.79% (圖4)，顯示NFA可以影響植物體的氧化脅迫水平。
擬南芥在水淹后上述抗氧化指標(biāo)也顯著增加，MDA、SOD、ADH的增量分別達(dá)到64.55%、88.07%和4.48%(圖5)。值得一提的是，NFA在淹水后對(duì)上述抗氧化指標(biāo)的影響明顯高于淹水前，特別是SOD，淹水前只提高了15.79%，淹水后卻達(dá)到88.07%，增量差異接近5倍(圖5)，接近正常生長(zhǎng)(水淹前)水平，說(shuō)明NFA的處理可以有效緩解淹水脅迫。同時(shí)，擬南芥在正常生長(zhǎng)時(shí)NFA會(huì)使ADH呈下降趨勢(shì)，而在淹水脅迫4 d后，ADH的含量會(huì)明顯增加(圖5)，減緩了因水淹造成的ADH的下降(圖3)，提示NFA參與擬南芥淹水后的ROS代謝和氧化脅迫過(guò)程。
圖3 水淹環(huán)境下擬南芥體內(nèi)MDA、SOD和ADH的含量
圖4 NFA處理后擬南芥體內(nèi)MDA、SOD和ADH的含量
圖5 NFA對(duì)水淹下擬南芥體內(nèi)MDA、SOD和ADH含量的影響
圖6 水淹條件下Atrbohs家族的表達(dá)分析
2.4 NFA對(duì)擬南芥Atrbohs基因家族的表達(dá)分析
NADPH氧化酶是ROS產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，影響著植物的水淹脅迫能力[10]。在水稻中的研究表明，SG-4的提取物可以提高NADPH氧化酶的酶活從而提高其抗旱能力[24]。有研究表明，擬南芥的atrbohD和atrbohF突變體，對(duì)低氧脅迫都非常敏感[28]。為明確NFA是否影響擬南芥NADPH氧化酶的表達(dá)，本研究采用qRT-PCR方法分析了不同水淹條件下NFA對(duì)Atrbohs基因家族AtrbohA～AtrbohJ的表達(dá)影響。結(jié)果顯示，淹水4 d后AtrbohD和AtrbohF基因的表達(dá)發(fā)生顯著下調(diào)(P<0.01)，而其他基因變化趨勢(shì)不明顯(圖6)，提示這兩個(gè)基因可能是擬南芥參與水淹脅迫代謝的主要NADPH氧化酶，這與文獻(xiàn)報(bào)道的AtrbohD和AtrbohF基因調(diào)節(jié)擬南芥的低氧耐受能力一致[28]。
為了證實(shí)NFA是否影響AtrbohD和AtrbohF的表達(dá)，用1 μg/mL的NFA處理擬南芥后進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AtrbohD基因的表達(dá)顯著上升(P<0.01)，作用4 h時(shí)最為顯著，提高了近3倍(圖7A)。可NFA對(duì)AtrbohF的表達(dá)發(fā)生了抑制，作用4 h時(shí)下調(diào)率達(dá)到88.6%(圖7B)。相應(yīng)地，在水淹脅迫處理后，NFA使得AtrbohD基因的表達(dá)發(fā)生輕微上調(diào)(圖7C)，可AtrbohF的表達(dá)卻得到部分程度的恢復(fù)，在不添加NFA的淹水條件下，降低65.4%，添加NFA后只下降了19.9%(圖7D)，說(shuō)明NFA可能通過(guò)影響AtrbohD和AtrbohF的表達(dá)來(lái)提高擬南芥的抗水淹脅迫能力。
圖7 NFA作用下AtrbohD和 AtrbohF在水淹前后的表達(dá)
3 討 論
近年來(lái)有很多關(guān)于內(nèi)生菌協(xié)助宿主提高生境適應(yīng)性的報(bào)道[18]，但是關(guān)于對(duì)植物抗水淹能力的報(bào)道卻比較少見(jiàn)。本研究從化學(xué)生態(tài)學(xué)的角度，報(bào)道了一種河岸帶植物疏花水柏枝的內(nèi)生煙曲霉SG-17，可以通過(guò)產(chǎn)生一種香豆素類抗氧化產(chǎn)物NFA，影響擬南芥的抗氧化代謝并提高其抗水淹脅迫的能力，豐富了在水淹脅迫下植物與體內(nèi)內(nèi)生菌的共生關(guān)系理論，為提高植物的生態(tài)適應(yīng)性及抗?jié)澈δ芰Φ於嘶A(chǔ)。
NFA可能通過(guò)調(diào)節(jié)AtrbohD和AtrbohF的表達(dá)來(lái)提高植物的抗淹水能力，但兩者的作用方式可能并不相同。水淹會(huì)導(dǎo)致AtrbohD的表達(dá)下調(diào)，但這種下調(diào)趨勢(shì)將受到NFA的抑制(圖6和圖7)。而AtrbohF的表達(dá)更為復(fù)雜，雖然水淹和NFA處理都會(huì)導(dǎo)致其下調(diào)(圖6和圖7)，但并不能說(shuō)明NFA是促進(jìn)水淹脅迫的，因?yàn)樘幚淼臅r(shí)間有差異，淹水處理采用的是0～6 d，而NFA處理是0～6 h。從圖6可以看出，AtrbohF基因在水淹1 d時(shí)表達(dá)顯著上升，而添加NFA則會(huì)顯著抑制其表達(dá)(圖7)。上述結(jié)果說(shuō)明AtrbohD和AtrbohF基因?qū)χ参锟顾偷淖饔猛緩娇赡懿灰粯?，可能與水淹的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，但不管是哪種途徑，NFA都可以抵消由水淹脅迫導(dǎo)致的基因表達(dá)變化，從而提高擬南芥對(duì)水淹的耐受能力。
Atrbohs是一種直接產(chǎn)生ROS的NADPH氧化酶基因家族[7]。本研究卻發(fā)現(xiàn)近乎于悖論的地方：內(nèi)生菌的香豆素類似物NFA，一方面作為抗氧化劑可以降低ROS的含量，另一方面卻提高體內(nèi)NADPH 氧化酶的活性來(lái)增加ROS的含量。究其原因，可能是由于ROS對(duì)植物抗水澇脅迫的雙重調(diào)節(jié)能力所致，這在某種程度上反映了內(nèi)生真菌可以雙向調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的氧化平衡，從而提高植物的抗水分脅迫能力，即一方面可以促進(jìn)ROS 的產(chǎn)生以提高對(duì)脅迫的響應(yīng)，另一方面可以清除ROS 降低氧化脅迫水平，從而使得植物體的氧化水平趨于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。
有文獻(xiàn)報(bào)道，MDA、SOD、ADH等生理參數(shù)的變化與植物品種、抗脅迫能力及脅迫強(qiáng)度有關(guān)[25]。MDA是氧化損傷的產(chǎn)物，一般在脅迫初期含量會(huì)增加，但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，含量呈下降趨勢(shì)[25]，添加NFA可以有效抑制這種下降趨勢(shì)(圖3)。正常生長(zhǎng)中，添加NFA后會(huì)導(dǎo)致ADH含量下降(圖4)，可是水淹后NFA顯著提高了ADH的含量(圖5)。另外，在正常生長(zhǎng)下，NFA有輕微的促進(jìn)擬南芥生長(zhǎng)的能力(圖2E、F)，但是相關(guān)生理參數(shù)和基因表達(dá)分析表明，NFA對(duì)擬南芥水淹脅迫后的影響更為明顯，說(shuō)明NFA更傾向于作為一種抗脅迫物質(zhì)而不是促生物質(zhì)在發(fā)揮作用。
內(nèi)生菌SG-17的天然宿主是疏花水柏枝，但是由于它本身就是一個(gè)耐淹物種，而且其組培和再生體系比較復(fù)雜，難以獲得不帶內(nèi)生菌的無(wú)菌苗，故本研究未能對(duì)NFA是否有助于天然宿主提高抗水淹能力展開(kāi)探討，在后期的研究中需要進(jìn)一步完善。本研究中所有生理參數(shù)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)都提示NFA通過(guò)影響ROS的合成來(lái)發(fā)揮作用，未來(lái)的研究將集中在NFA對(duì)植物不同部位ROS的瞬時(shí)定量開(kāi)展研究，同時(shí)對(duì)NADPH氧化酶的抑制劑及相關(guān)突變體進(jìn)行探討，以期進(jìn)一步揭示NFA提高植物耐淹的分子機(jī)制。
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1.1.3 儀器與試劑 電子天平(BS-224s，德國(guó)賽多利斯)；不銹鋼智能型立式滅菌鍋(YM30F，上海三申醫(yī)療器械有限公司)；干燥箱/培養(yǎng)箱(PH-030A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；雙人凈化工作臺(tái)(SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備廠)；臺(tái)式恒溫振蕩培養(yǎng)箱(ZQZY-85BN，上海知楚儀器有限公司)；薄層色譜展開(kāi)缸(上海信誼儀器廠有限公司)；三用紫外分析儀(ZF-6，上海嘉鵬科技有限公司)；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(752(N)，上海佑科)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(BC-R203，上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司)；核磁共振波譜儀(400 MHz，德國(guó)Bruker公司)；PCR儀(MyCycler，美國(guó)BIO-RAD公司)；凝膠成像系統(tǒng)(GDS-8000，美國(guó)UVP公司)；水平電泳儀(DYCP-31DN，北京市六一儀器廠)；離心機(jī)(LD4-2A，北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；電熱恒溫水槽(DK-8A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；超低溫冷凍冰箱(DW86L386，Haier)； 微量移液槍(Eppendoff，德國(guó))；qRT-PCR儀(CFX96TMOptics Module)。丙二醛(MDA)測(cè)試盒和超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所，ADHELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于科諾迪生物公司，EASYspin 植物RNA快速提取試劑盒(艾德萊生物公司)。SYBRII購(gòu)自TakaRa公司，1st-Strand cDNA合成試劑盒(GenStar 公司)。
1.2 方法
1.2.1 抗氧化活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析 將在SDA培養(yǎng)14 d的SG-17進(jìn)行真空抽濾，收集發(fā)酵液，等體積乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，42 ℃、0.1 MPa下旋蒸為發(fā)酵液酯相初提物，薄層層析分離發(fā)酵液酯相初提物(展開(kāi)劑為V(石油醚)∶V(丙酮)=1∶1)，經(jīng)抗氧化活性跟蹤，確定活性最強(qiáng)片段，將其進(jìn)行半制備HPLC制備，色譜分離純化條件,流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(水)= 60∶40，流速3.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，分析柱為Cosmosil MS-II RP-C18色譜柱。將得到的單體化合物冷凍干燥后用二甲基亞砜(DMSO)溶解，核磁共振(600 MHz，DMSO-d6)鑒定其結(jié)構(gòu)。單體的抗氧化活性采用總抗氧化能力(T-AOC法，南京建成生物工程研究所)進(jìn)行測(cè)定[23]。
1.2.2 擬南芥水淹脅迫及生理參數(shù)測(cè)定 用不同濃度的NFA(1、10、100 μg/mL)和正對(duì)照水楊酸(SA， 1、10 μg/mL)處理4 h后，全淹法水淹4 d，正常生長(zhǎng)2周后統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)狀況，每盆6株苗，每個(gè)處理3次重復(fù)，生長(zhǎng)條件同1.1.2。硫代巴比妥酸法(TBA)測(cè)定體內(nèi) MDA的含量[25]，氮藍(lán)四唑還原法測(cè)定SOD的含量[25]，雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定ADH的含量[25]，具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。
1.2.3 基因表達(dá)分析 將濃度為1 μg/mL的NFA分別處理擬南芥幼苗1、2、4、6 h，水淹4 d后將大小均一的3～4片葉，用蒸餾水清洗凈、吸水紙吸干后置于液氮中，用EASYspin 植物RNA快
表1 引物序列
速提取試劑盒提取RNA，合成cDNA，具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)所用引物(上海生物工程公司合成)序列見(jiàn)表1。將合成的cDNA母液稀釋5倍，取1 μL加入10 μL SYBII、F和R引物各0.5 μL、ddH2O 8 μL配置成20 μL試驗(yàn)液，加入到96孔板中，封上MicroAmp透明膠膜，以Actin 作為內(nèi)標(biāo)，于qRT-PCR儀中擴(kuò)增30～40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[26]。
1.2.4 數(shù)據(jù)處理 本研究使用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 20.0，采用單因素方差分析(oneway ANOVA)和最小顯著性差異法(LSD)進(jìn)行顯著性分析，用graphpad prism 5軟件作圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 抗氧化活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)解析
前期我們報(bào)道了內(nèi)生煙曲霉SG-17的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)其主效成分與綠原酸有類似的波譜特征[23]。為進(jìn)一步測(cè)定該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，通過(guò)抗氧化活性追蹤和HPLC分析與制備，收集到一淺黃色固體化合物，其總抗氧化活性(T-AOC)高達(dá)131.94 U/mL，是同等濃度下維生素C的18倍。
將該物質(zhì)冷凍干燥后用DMSO溶解，經(jīng)核磁共振分析獲得以下波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6) δH6.64 (d，J=9.8 Hz，1H，H-1)，5.60 (d，J=9.8 Hz，1H，H-2)，7.19 (d，J=8.3 Hz，2H，H-2′/6′)，6.77 (d，J=8.3 Hz，2H，H-3′/5′)，8.10 (s，1H，-CHO)，9.83 (brs，1H，NH);13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6) δC118.2(CH，C-1)，111.3 (CH，C-2)，126.5 (qC，C-1′)，130.1 (CH，C-2′/6′)，116.0 (CH，C-3′/5′)，156.8 (qC，C-4′)，160.5 (CH，-CHO)。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，與文獻(xiàn)報(bào)道的(Z)-N-(4-羥基苯乙烯基)甲酰胺(NFA)一致[27]，證實(shí)了該物質(zhì)與綠原酸同屬香豆素物質(zhì)，分子式為C9H9NO2(圖1)。
圖1 NFA的結(jié)構(gòu)鑒定
2.2 NFA可有效協(xié)助擬南芥抵抗水淹脅迫
前期研究表明，SG-17的抗氧化活性粗提物可以有效協(xié)助水稻抵抗干旱脅迫[24]。由于該菌的宿主疏花水柏枝經(jīng)常生活在一種淹水的環(huán)境中，為了證實(shí)SG-17的代謝產(chǎn)物是否能提高植物的耐淹能力，本研究以擬南芥為試驗(yàn)材料，用不同濃度的NFA進(jìn)行處理，評(píng)價(jià)其對(duì)水淹的效果。首先比較了擬南芥在全淹1、2、4、6 d的生長(zhǎng)狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在水淹4 d的條件下，擬南芥可以正常生長(zhǎng)，但其長(zhǎng)勢(shì)與株高明顯弱于正常生長(zhǎng)的幼苗，故選擇4 d的全淹條件來(lái)評(píng)價(jià)NFA對(duì)水淹的影響。
圖2 NFA對(duì)擬南芥耐水淹能力的影響
將擬南芥的幼苗噴灑不同濃度的NFA后再進(jìn)行水淹處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于對(duì)照(圖2)。濃度為1 μg/mL時(shí)，添加了NFA的幼苗生長(zhǎng)優(yōu)于對(duì)照(圖2A、B)，NFA為100 μg/mL下(圖2D)，水淹后的幼苗生長(zhǎng)接近正常生長(zhǎng)水平(圖2E)。需要指出的是，在相同濃度下，NFA的效果均優(yōu)于正對(duì)照水楊酸(圖2B、C和圖2G、H)，說(shuō)明NFA有效地提高了擬南芥耐水淹的能力。
2.3 NFA對(duì)擬南芥水淹生理的影響
當(dāng)植物在遭受水淹等逆境脅迫時(shí)，由于ROS的影響，使得MDA、SOD、ADH等物質(zhì)的含量常出現(xiàn)變化，因此這些參數(shù)是評(píng)價(jià)逆境脅迫程度或逆境抵抗能力的重要指標(biāo)[24]。為了研究NFA對(duì)擬南芥水淹的生理影響，本研究測(cè)定了NFA在處理不同時(shí)間后MDA、SOD和ADH的含量變化。結(jié)果表明，隨著水淹時(shí)間的延長(zhǎng)，擬南芥體內(nèi)MDA、SOD和ADH的含量均發(fā)生顯著性下降(P<0.01)，在水淹4 d時(shí)，MDA含量下降了51.83%，SOD含量下降了42.92%，ADH含量下降了11.76%(圖3)。但是在擬南芥的正常生長(zhǎng)條件下，用濃度為1 μg/mL的NFA處理一段時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)除了ADH下降外，MDA、SOD含量均明顯上升，其中NFA作用4 h時(shí)達(dá)到最大，分別增加了55.43%和15.79% (圖4)，顯示NFA可以影響植物體的氧化脅迫水平。
擬南芥在水淹后上述抗氧化指標(biāo)也顯著增加，MDA、SOD、ADH的增量分別達(dá)到64.55%、88.07%和4.48%(圖5)。值得一提的是，NFA在淹水后對(duì)上述抗氧化指標(biāo)的影響明顯高于淹水前，特別是SOD，淹水前只提高了15.79%，淹水后卻達(dá)到88.07%，增量差異接近5倍(圖5)，接近正常生長(zhǎng)(水淹前)水平，說(shuō)明NFA的處理可以有效緩解淹水脅迫。同時(shí)，擬南芥在正常生長(zhǎng)時(shí)NFA會(huì)使ADH呈下降趨勢(shì)，而在淹水脅迫4 d后，ADH的含量會(huì)明顯增加(圖5)，減緩了因水淹造成的ADH的下降(圖3)，提示NFA參與擬南芥淹水后的ROS代謝和氧化脅迫過(guò)程。
圖3 水淹環(huán)境下擬南芥體內(nèi)MDA、SOD和ADH的含量
圖4 NFA處理后擬南芥體內(nèi)MDA、SOD和ADH的含量
圖5 NFA對(duì)水淹下擬南芥體內(nèi)MDA、SOD和ADH含量的影響
圖6 水淹條件下Atrbohs家族的表達(dá)分析
2.4 NFA對(duì)擬南芥Atrbohs基因家族的表達(dá)分析
NADPH氧化酶是ROS產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，影響著植物的水淹脅迫能力[10]。在水稻中的研究表明，SG-4的提取物可以提高NADPH氧化酶的酶活從而提高其抗旱能力[24]。有研究表明，擬南芥的atrbohD和atrbohF突變體，對(duì)低氧脅迫都非常敏感[28]。為明確NFA是否影響擬南芥NADPH氧化酶的表達(dá)，本研究采用qRT-PCR方法分析了不同水淹條件下NFA對(duì)Atrbohs基因家族AtrbohA～AtrbohJ的表達(dá)影響。結(jié)果顯示，淹水4 d后AtrbohD和AtrbohF基因的表達(dá)發(fā)生顯著下調(diào)(P<0.01)，而其他基因變化趨勢(shì)不明顯(圖6)，提示這兩個(gè)基因可能是擬南芥參與水淹脅迫代謝的主要NADPH氧化酶，這與文獻(xiàn)報(bào)道的AtrbohD和AtrbohF基因調(diào)節(jié)擬南芥的低氧耐受能力一致[28]。
為了證實(shí)NFA是否影響AtrbohD和AtrbohF的表達(dá)，用1 μg/mL的NFA處理擬南芥后進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AtrbohD基因的表達(dá)顯著上升(P<0.01)，作用4 h時(shí)最為顯著，提高了近3倍(圖7A)。可NFA對(duì)AtrbohF的表達(dá)發(fā)生了抑制，作用4 h時(shí)下調(diào)率達(dá)到88.6%(圖7B)。相應(yīng)地，在水淹脅迫處理后，NFA使得AtrbohD基因的表達(dá)發(fā)生輕微上調(diào)(圖7C)，可AtrbohF的表達(dá)卻得到部分程度的恢復(fù)，在不添加NFA的淹水條件下，降低65.4%，添加NFA后只下降了19.9%(圖7D)，說(shuō)明NFA可能通過(guò)影響AtrbohD和AtrbohF的表達(dá)來(lái)提高擬南芥的抗水淹脅迫能力。
圖7 NFA作用下AtrbohD和 AtrbohF在水淹前后的表達(dá)
3 討 論
近年來(lái)有很多關(guān)于內(nèi)生菌協(xié)助宿主提高生境適應(yīng)性的報(bào)道[18]，但是關(guān)于對(duì)植物抗水淹能力的報(bào)道卻比較少見(jiàn)。本研究從化學(xué)生態(tài)學(xué)的角度，報(bào)道了一種河岸帶植物疏花水柏枝的內(nèi)生煙曲霉SG-17，可以通過(guò)產(chǎn)生一種香豆素類抗氧化產(chǎn)物NFA，影響擬南芥的抗氧化代謝并提高其抗水淹脅迫的能力，豐富了在水淹脅迫下植物與體內(nèi)內(nèi)生菌的共生關(guān)系理論，為提高植物的生態(tài)適應(yīng)性及抗?jié)澈δ芰Φ於嘶A(chǔ)。
NFA可能通過(guò)調(diào)節(jié)AtrbohD和AtrbohF的表達(dá)來(lái)提高植物的抗淹水能力，但兩者的作用方式可能并不相同。水淹會(huì)導(dǎo)致AtrbohD的表達(dá)下調(diào)，但這種下調(diào)趨勢(shì)將受到NFA的抑制(圖6和圖7)。而AtrbohF的表達(dá)更為復(fù)雜，雖然水淹和NFA處理都會(huì)導(dǎo)致其下調(diào)(圖6和圖7)，但并不能說(shuō)明NFA是促進(jìn)水淹脅迫的，因?yàn)樘幚淼臅r(shí)間有差異，淹水處理采用的是0～6 d，而NFA處理是0～6 h。從圖6可以看出，AtrbohF基因在水淹1 d時(shí)表達(dá)顯著上升，而添加NFA則會(huì)顯著抑制其表達(dá)(圖7)。上述結(jié)果說(shuō)明AtrbohD和AtrbohF基因?qū)χ参锟顾偷淖饔猛緩娇赡懿灰粯?，可能與水淹的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，但不管是哪種途徑，NFA都可以抵消由水淹脅迫導(dǎo)致的基因表達(dá)變化，從而提高擬南芥對(duì)水淹的耐受能力。
Atrbohs是一種直接產(chǎn)生ROS的NADPH氧化酶基因家族[7]。本研究卻發(fā)現(xiàn)近乎于悖論的地方：內(nèi)生菌的香豆素類似物NFA，一方面作為抗氧化劑可以降低ROS的含量，另一方面卻提高體內(nèi)NADPH 氧化酶的活性來(lái)增加ROS的含量。究其原因，可能是由于ROS對(duì)植物抗水澇脅迫的雙重調(diào)節(jié)能力所致，這在某種程度上反映了內(nèi)生真菌可以雙向調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的氧化平衡，從而提高植物的抗水分脅迫能力，即一方面可以促進(jìn)ROS 的產(chǎn)生以提高對(duì)脅迫的響應(yīng)，另一方面可以清除ROS 降低氧化脅迫水平，從而使得植物體的氧化水平趨于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。
有文獻(xiàn)報(bào)道，MDA、SOD、ADH等生理參數(shù)的變化與植物品種、抗脅迫能力及脅迫強(qiáng)度有關(guān)[25]。MDA是氧化損傷的產(chǎn)物，一般在脅迫初期含量會(huì)增加，但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，含量呈下降趨勢(shì)[25]，添加NFA可以有效抑制這種下降趨勢(shì)(圖3)。正常生長(zhǎng)中，添加NFA后會(huì)導(dǎo)致ADH含量下降(圖4)，可是水淹后NFA顯著提高了ADH的含量(圖5)。另外，在正常生長(zhǎng)下，NFA有輕微的促進(jìn)擬南芥生長(zhǎng)的能力(圖2E、F)，但是相關(guān)生理參數(shù)和基因表達(dá)分析表明，NFA對(duì)擬南芥水淹脅迫后的影響更為明顯，說(shuō)明NFA更傾向于作為一種抗脅迫物質(zhì)而不是促生物質(zhì)在發(fā)揮作用。
內(nèi)生菌SG-17的天然宿主是疏花水柏枝，但是由于它本身就是一個(gè)耐淹物種，而且其組培和再生體系比較復(fù)雜，難以獲得不帶內(nèi)生菌的無(wú)菌苗，故本研究未能對(duì)NFA是否有助于天然宿主提高抗水淹能力展開(kāi)探討，在后期的研究中需要進(jìn)一步完善。本研究中所有生理參數(shù)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)都提示NFA通過(guò)影響ROS的合成來(lái)發(fā)揮作用，未來(lái)的研究將集中在NFA對(duì)植物不同部位ROS的瞬時(shí)定量開(kāi)展研究，同時(shí)對(duì)NADPH氧化酶的抑制劑及相關(guān)突變體進(jìn)行探討，以期進(jìn)一步揭示NFA提高植物耐淹的分子機(jī)制。
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