令利軍 張 璽 鄭生岳 史苗霞 馮娟娟 焦正龍 李子彬

（1 西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 甘肅蘭州 730070 2 甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)技術(shù)系 甘肅蘭州 730020）

0 引言

植物內(nèi)生菌（Endophyte）通常是指存在于高等植物組織和器官內(nèi)的真菌、細(xì)菌及酵母菌。其在植物體內(nèi)具有相對(duì)穩(wěn)定的生存空間， 可以在植物體內(nèi)獨(dú)立的繁殖和傳遞。 近年來(lái)研究結(jié)果表明內(nèi)生菌在植物體內(nèi)具有生物防治的生態(tài)位， 具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、抗病蟲害、加強(qiáng)宿主的抗逆境等功能?；谝陨涎芯炕A(chǔ)， 植物內(nèi)生菌作為當(dāng)前生物防治資源的優(yōu)良材料， 已經(jīng)逐漸成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)， 從植物中分離出的內(nèi)生菌是獲得天然產(chǎn)物及開發(fā)新藥物的潛在資源［2-3］。

哈密瓜（Cucumis melo var. saccharinus）隸屬于葫蘆科，又稱雪瓜、貢瓜等，是一類優(yōu)良的甜瓜品種［5］。 為了解哈密瓜內(nèi)生菌的生物多樣性，并對(duì)其內(nèi)生菌進(jìn)行分離鑒定， 從而進(jìn)一步研究?jī)?nèi)生菌與宿主的關(guān)系及為內(nèi)生菌的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)［4］。

1 哈密瓜內(nèi)生菌分離與純化的實(shí)驗(yàn)流程及教學(xué)活動(dòng)組織

1.1 哈密瓜內(nèi)生菌分離與純化的實(shí)驗(yàn)流程 樣品的制備→表面消毒→內(nèi)生分離、 純化→形態(tài)觀察→分析結(jié)果→種屬確定［1］。

1.2 教學(xué)活動(dòng)組織 中職教育的最終目標(biāo)是培養(yǎng)應(yīng)用技能型人才， 實(shí)踐能力是最為重要的環(huán)節(jié)之一。實(shí)踐教學(xué)對(duì)學(xué)生技能的培養(yǎng)有著深遠(yuǎn)意義，通過(guò)實(shí)驗(yàn)教學(xué)， 學(xué)生親自動(dòng)手實(shí)踐不斷加深理論知識(shí)，并將掌握的理論知識(shí)升華為操作技能。此次教學(xué)設(shè)計(jì)可將班級(jí)學(xué)生按小組形式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每小組6～8 人，組長(zhǎng)負(fù)責(zé)制［10-11］。 由這6～8 人共同查閱文獻(xiàn)，確定實(shí)驗(yàn)方案，其中2 名學(xué)生準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料和儀器；1 名學(xué)生做好實(shí)驗(yàn)的記錄工作；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每一步驟均由2 名學(xué)生輪流合作完成。 實(shí)驗(yàn)全程由教師參與指導(dǎo)。

2 哈密瓜內(nèi)生菌分離與純化教學(xué)實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 材料與試劑 冷藏條件下的哈密瓜（4℃）；NA、PDA 和YPD 培養(yǎng)基［4］。

2.2 儀器與設(shè)備 電子天平（HTP-312）；生化培養(yǎng) 箱（Blue Pard）；超 凈 工 作 臺(tái)（BSC-1300ΙΙA2）；電 熱 鼓 風(fēng) 干 燥 箱 （GZX-9030MBE）； 柜 型 冰 柜（FCD-196SE）；壓力蒸汽滅菌鍋（DSX-280B）；超聲波清洗器（KQ5200B）。

2.3 方法

1）樣品的采集與制備。選取生長(zhǎng)狀況良好，表面無(wú)機(jī)械損傷，成熟的瓜作為樣品，并放置4℃冷藏。

2）表面消毒。 第1 步，取樣。 在超凈工作臺(tái)里分別在哈密瓜的不同部位（皮層，淺層，深層）取1 cm2的組織塊若干，將組織塊消毒處理。 用無(wú)菌水沖洗3 遍，第3 遍的無(wú)菌水涂布于培養(yǎng)基，作為消毒對(duì)照。

第2 步，制備菌懸液。在超凈工作臺(tái)里用滅過(guò)菌的研缽將組織塊搗碎、研磨。 按需加入無(wú)菌水，按比例分別制備稀釋倍數(shù)為10-3、10-4、10-5的菌懸 液 備 用［6］。

第3 步，涂布。在超凈工作臺(tái)里將備用菌懸液分別在NA、PDA 和YPD 培養(yǎng)基進(jìn)行涂布， 淺層、皮層和深層的菌懸液各涂布于3 種培養(yǎng)基， 進(jìn)行編號(hào)。 NA 培養(yǎng)基在37℃下培養(yǎng)1～2 d，PDA 和YPD 培養(yǎng)基在28℃下培養(yǎng)3～5 d。

第4 步，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并觀察菌落形態(tài)特征。

第5 步，參考《酵母菌特征與鑒定手冊(cè)》、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《真菌鑒定手冊(cè)》，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，生長(zhǎng)速度，邊緣形態(tài)，顏色和大小，是否透明等方面，進(jìn)行確定。

3）樣品的分離。 待培養(yǎng)基中長(zhǎng)出肉眼可見的菌落時(shí)，根據(jù)菌落的顏色差異及形態(tài)特征，挑取不同的菌落接于新的培養(yǎng)基上，進(jìn)行編號(hào)，NA 培養(yǎng)基在37℃下培養(yǎng)1～2 d，PDA 培養(yǎng)基和YPD 培養(yǎng)基在28℃下培養(yǎng)3～5 d， 觀察菌落的生長(zhǎng)速度和形態(tài)特征，記錄觀察結(jié)果。

4）樣品的純化。 根據(jù)菌落形態(tài)特征選取合適的培養(yǎng)基，重復(fù)劃線操作，直至純化為單菌落，并進(jìn)行編號(hào)，NA 培養(yǎng)基在37℃下培養(yǎng)1～2 d，PDA培養(yǎng)基和YPD 培養(yǎng)基在28℃下培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落形態(tài)特征，記錄觀察結(jié)果。

5）菌種的保藏。采用甘油保存法：將要保存的菌種接種于LB 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即肉眼能看見培養(yǎng)體系內(nèi)渾濁即可。 將甘油稀釋至濃度為30%。 在無(wú)菌條件下將菌液與30%濃度甘油1∶1 等體積混合于離心管中， 甘油的最終濃度為15%。 可于-80℃冰箱內(nèi)保存2 年。

3 結(jié)果與分析

內(nèi)生菌分離的結(jié)果：實(shí)驗(yàn)中均利用菌懸液涂布法，對(duì)哈密瓜的皮層、淺層、深層的內(nèi)生菌進(jìn)行分離，分別在皮層分離出菌落形態(tài)不同的4 株，在淺層分離出菌落形態(tài)不同的2 株，在深層分離出菌落形態(tài)不同的2 株。 分離出的8 株內(nèi)生菌中，細(xì)菌有6 株，占總菌數(shù)的75%；酵母有2 株，占總菌數(shù)的25%（表1、圖1，圖1 見封四）。

表1 哈密瓜內(nèi)生菌菌落形態(tài)特征

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論

整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后由教師組織學(xué)生按小組討論， 再由組長(zhǎng)將討論結(jié)果整合后向全班學(xué)生做匯報(bào)。 討論主要圍繞以下2 個(gè)方面進(jìn)行：第一，圍繞實(shí)驗(yàn)所獲得的菌種， 引導(dǎo)學(xué)生討論植物中存在哪幾類內(nèi)生菌， 這些內(nèi)生菌與植物宿主的關(guān)系及這些內(nèi)生菌有哪些應(yīng)用價(jià)值；第二，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不佳的小組， 由小組成員共同分析討論是哪個(gè)環(huán)節(jié)出了問題，如何改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案，最后由教師總結(jié)評(píng)價(jià)并給出標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)方案以供學(xué)生參考。

哈密瓜內(nèi)生菌的分離過(guò)程中， 要對(duì)哈密瓜的表面和組織塊滅菌，并做好實(shí)驗(yàn)對(duì)照，即用第3 遍沖洗消毒后組織塊無(wú)菌水進(jìn)行涂布。 在滅菌時(shí)不但要將表面的細(xì)菌殺死， 還要確保不能傷到內(nèi)部的細(xì)菌，整個(gè)實(shí)驗(yàn)在無(wú)菌的條件下進(jìn)行。

本實(shí)驗(yàn)表明，哈密瓜皮層、淺層和深層組織中均存在內(nèi)生菌，且內(nèi)生菌具有一定的多樣性。內(nèi)生菌由于與宿主植物長(zhǎng)期共處， 進(jìn)而形成了一種復(fù)雜、特殊的關(guān)系，它們有的是互利共生關(guān)系，而有的是無(wú)害或微害寄生關(guān)系，2 種關(guān)系可隨多種因素變化而相互轉(zhuǎn)化［12］。 內(nèi)生菌在生物制藥方面具有較大的應(yīng)用前景， 利用內(nèi)生菌生產(chǎn)生防菌劑代替化學(xué)農(nóng)藥等［13］。

5 學(xué)生收獲

5.1 專業(yè)素養(yǎng)方面 學(xué)生通過(guò)實(shí)驗(yàn)，對(duì)內(nèi)生菌的相關(guān)知識(shí)產(chǎn)生了濃厚的興趣， 初步掌握了內(nèi)生菌分離與純化的操作步驟及關(guān)鍵環(huán)節(jié)和注意事項(xiàng)，能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析討論， 能找出實(shí)驗(yàn)失敗的原因及解決問題的方法［8］。

學(xué)生對(duì)使用滅菌鍋、 超凈工作臺(tái)等實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備操作嫻熟， 掌握了如何制備培養(yǎng)基和菌懸液方法，提高了學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的觀察，數(shù)據(jù)分析處理等專業(yè)素養(yǎng)。

5.2 情感態(tài)度價(jià)值觀方面 培養(yǎng)學(xué)生自主學(xué)習(xí)新知識(shí)、新技術(shù)；能通過(guò)各種媒體資源收集所需信息； 能獨(dú)立制定工作計(jì)劃并實(shí)施； 能獨(dú)立進(jìn)行調(diào)查、對(duì)比、分析；具有團(tuán)隊(duì)協(xié)作、創(chuàng)新能力及持之以恒的精神等［7］。