耿曉玲，李崇正，次旺嘎旦，谷禮民

(江陰職業(yè)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境與材料工程系，江蘇 江陰 214433)

近年來(lái)，天然植物中的活性成分被廣泛地應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域，各類(lèi)植物提取成分主打的化妝品都被逐步推向了國(guó)際市場(chǎng)，尤其是中草藥類(lèi)護(hù)膚產(chǎn)品在市場(chǎng)上廣受好評(píng)。我國(guó)植物資源豐富，植物成分提取方法簡(jiǎn)便易行，添加后制得的相應(yīng)產(chǎn)品療效顯著，毒副作用小，在國(guó)內(nèi)的化妝品研發(fā)領(lǐng)域備受關(guān)注[1-2]。

藏藥“龍膽花”，藏藥名“榜間”，為龍膽科龍膽屬多種植物的花，主要分布于西藏、甘肅等地，常以單味或復(fù)方入藥[3]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)藍(lán)花龍膽的研究報(bào)道較少，現(xiàn)有的報(bào)道主要是針對(duì)藍(lán)花龍膽中活性成分的分離鑒定等方面。李珊等[4]對(duì)藍(lán)玉簪龍膽地上部分中的黃酮苷類(lèi)化學(xué)成分進(jìn)行了分析，得到了6個(gè)黃酮苷類(lèi)化合物。楊紅澎等[5]通過(guò)色譜技術(shù)進(jìn)行分離，利用質(zhì)譜、核磁共振等波譜技術(shù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)，從藍(lán)玉簪龍膽的花中分離得到5個(gè)苷類(lèi)成分。劉菁菁等[6]研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)玉簪龍膽提取物對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)均具有一定的抗菌作用，對(duì)MRSA感染小鼠也有一定治療作用。侯穎[7]等發(fā)現(xiàn)藍(lán)玉簪顆?？稍鰪?qiáng)機(jī)體抗氧化酶的活力，調(diào)節(jié)氧化，抗氧化平衡。目前，對(duì)藍(lán)花龍膽應(yīng)用于天然護(hù)膚品領(lǐng)域的報(bào)道還沒(méi)有，本文將在藍(lán)花龍膽提取物體外抗菌的基礎(chǔ)上，將其應(yīng)用于保濕水和潤(rùn)膚乳兩種體系中，進(jìn)行龍膽提取物的配伍性測(cè)試和抗菌測(cè)試，為藍(lán)花龍膽開(kāi)發(fā)更廣闊的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 主要儀器

PHS-3C型酸度計(jì)，上海大普儀器有限公司；STSJB-120電動(dòng)攪拌器，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。SZF7-200粉碎機(jī)，天津市泰析特儀器有限公司；XMTD-8222真空干燥箱，國(guó)華電器有限公司；RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；721分光光度計(jì)，上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司；VS-840/1300超凈工作臺(tái)，蘇州長(zhǎng)留凈化科技有限公司等。

1.2 主要試劑與材料

本實(shí)驗(yàn)使用的氫氧化鈉、硼砂、無(wú)水乙醇、透明質(zhì)酸鈉、聚氧乙烯(n=20)失水山梨醇硬脂酸酯、失水山梨醇單硬脂酸酯、丙二醇、甘油等均為分析純。瓊脂、蛋白胨、牛肉浸膏等均為生化試劑，以上試劑均購(gòu)于北京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

藍(lán)花龍膽花購(gòu)于西藏山南市錯(cuò)那縣，金黃色色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉菌均為純菌株，購(gòu)于南京微生物分析檢測(cè)中心。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藍(lán)花龍膽提取物的制備工藝

將藍(lán)花龍膽進(jìn)行預(yù)處理，洗凈烘干粉碎，過(guò)40目篩分，得到粉末狀樣品。稱(chēng)取50g預(yù)處理后的龍膽花樣品，70%乙醇作為溶劑，按照液料比6∶1(mL：g)加入裝有樣品的容器中，加熱攪拌回流 4h后過(guò)濾。繼續(xù)用相同濃度的乙醇溶液洗滌，再次過(guò)濾，合并濾液，低溫離心，取上層澄清液，真空濃縮后待用。折算為干物質(zhì),將得到的濃縮物冷藏備用。

2.2 藍(lán)花龍膽提取物抗菌特性的檢測(cè)方法[8]

2.2.1 牛津杯法

供試菌株：大腸桿菌、金黃葡萄桿菌和黑曲霉菌。

用蒸餾水調(diào)整提取物的濃度，得到含量分別為1g龍膽花干品/10mL、1g龍膽花干品/5mL、1g龍膽花干品/1mL的濃縮液待用。按標(biāo)準(zhǔn)配置固體培養(yǎng)基，高壓滅菌，制平板。將活化后的大腸桿菌、金黃葡萄桿菌稀釋至濃度為1.0×10-7cfu/mL，黑曲霉菌的濃度為1.0×10-6cfu/mL，均勻涂布，將牛津杯放置于平板上。分別取200μL稀釋后的提取液樣品加入牛津杯中。分別做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)皿蓋好放置在生化培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)菌培養(yǎng)溫度 37.5℃，真菌培養(yǎng)溫度 28℃。觀察以上菌株生長(zhǎng)情況及測(cè)量抑菌圈直徑。

2.2.2 MIC的測(cè)定[8]

本實(shí)驗(yàn)采用液體稀釋法測(cè)各提取物對(duì)上述菌株測(cè)定最小抑菌濃度。將各菌株接種至固體培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫培養(yǎng)24h 后, 用生理鹽水將菌落洗下。用比濁管對(duì)比稀釋后4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。以測(cè)定抑菌圈實(shí)驗(yàn)中用的 1.0mg/mL 的提取液作為原液。參考文獻(xiàn)[8]中的方法，配制相應(yīng)的菌液濃度為105cfu/m L，稀釋原液濃度，使最終濃度為：80.0%、70.0%、60.0%、30.0%、10.0%、5.0%。以相應(yīng)的溶劑做空白對(duì)照。細(xì)菌培養(yǎng)條件為，37℃搖床培養(yǎng) 24h，真菌培養(yǎng)條件為28℃搖床培養(yǎng) 24h 后。分別取 20μL 菌液涂板培養(yǎng)并于 24h 后觀察菌種生長(zhǎng)情況。

2.3 保濕水基礎(chǔ)配方

保濕水基礎(chǔ)配方見(jiàn)表1～表3。

表1 保濕水基礎(chǔ)配方A部分

表2 保濕水基礎(chǔ)配方B部分

表3 保濕水基礎(chǔ)配方C部分

2.4 保濕水配制工藝

將A部分水加入主鍋，然后將卡波姆慢慢撒入分散均勻，然后將透明質(zhì)酸鈉、丙二醇預(yù)先混合攪拌后加入水相，再將部分剩下所有原料加入水相，攪拌分散均勻，加熱至80-85℃。B部分待完全溶解均勻后開(kāi)始降溫，待溫度降到50℃時(shí)，加入B01，攪拌均勻。將C部分三個(gè)組分在不銹鋼容器中預(yù)先混合，攪拌至完全透明，待溫度降至40～45℃時(shí)，加入主鍋。加入上述全部原料后，加入一定量的藍(lán)花龍膽提取物，余量用水補(bǔ)充，攪拌均勻后出料。

2.5 潤(rùn)膚乳基礎(chǔ)配方

潤(rùn)膚乳基礎(chǔ)配方見(jiàn)表4。

表4 潤(rùn)膚乳基礎(chǔ)配方

2.6 潤(rùn)膚乳配制工藝

水相中卡波加入水中，加熱攪拌至溶解完全。水相剩余料體預(yù)混合之后加入水中，加熱至80℃。B相原料混合之后加熱到80℃，加入水相中，均質(zhì)5min。降溫至60℃加入預(yù)混合的C相，之后加入龍膽提取物相原料低速攪拌。出料待用。

2.7 檢測(cè)方法

保濕水的檢測(cè)指標(biāo)劑檢測(cè)方法參見(jiàn) GB/T2660。

潤(rùn)膚乳的檢測(cè)指標(biāo)劑檢測(cè)方法參見(jiàn) GB/T29665-2013。

2.8 抗菌物質(zhì)(龍膽花提取物)與化妝品基礎(chǔ)配方的配伍性

依據(jù)2.2.2中測(cè)得的最低抑菌濃度數(shù)據(jù)，微調(diào)后添加到保濕水和潤(rùn)膚乳的基礎(chǔ)配方中， 3個(gè)月后參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行觀察、評(píng)價(jià)。

2.9 龍膽花提取物在化妝品體系中的抗菌性能[9]

化妝品常規(guī)防腐劑體系有水劑體系和乳霜體系。其中水劑型的配方：尼泊金甲酯 0.17%,DMDM 乙內(nèi)酰尿0.2%。乳霜型的配方：尼泊金甲酯 0.2%，尼泊金丙酯 0.15%，DMDM 乙內(nèi)酰尿 0.2%。

本實(shí)驗(yàn)按照上述體系，選用尼泊金甲酯作為陽(yáng)性參照。進(jìn)行抑菌圈實(shí)驗(yàn)，具體參考2.2.1具體方法，將牛津杯改成同直徑紙片做試樣。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 牛津杯法測(cè)定龍膽提取物抗菌特性

表5 抑菌圈直徑

選取金黃色葡萄球菌(G+)、埃希氏大腸桿菌(G-)，常見(jiàn)腸道致病菌)、真菌黑曲霉為供試菌株，根據(jù)瓊脂擴(kuò)散法程度測(cè)定抑菌圈大小。在操作中，需要保證加注底層的培養(yǎng)基厚度均勻，否則容易出現(xiàn)重現(xiàn)性差等異常情況，主要是由于瓊脂層的厚度與抑菌物質(zhì)的擴(kuò)散速度密切相關(guān)，因此抑菌試驗(yàn)的每一步都需要仔細(xì)謹(jǐn)慎，嚴(yán)格按照操作規(guī)范，才可以得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。

從表5可以看出，龍膽花提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有一定的抑菌作用，抑菌圈大小分別為 17.9mm，12.4mm。黑曲霉的抑菌圈較小，為7.1mm，抑菌效果不顯著。

圖1 抑菌圈直徑對(duì)照?qǐng)D

比較各菌株對(duì)提取物敏感性的大小可以發(fā)現(xiàn)：金黃色葡萄球菌>大腸桿菌桿菌而龍膽花提取物對(duì)霉菌黑曲霉幾乎沒(méi)有抑菌作用。

3.2 MIC的確定

表6 各菌株的最小抑制濃度

注：“-”表示無(wú)菌生長(zhǎng)；“+”表示有菌生長(zhǎng)，“+”越多代表菌體長(zhǎng)的越密。

測(cè)得龍膽花提物最低抑菌濃度如表6，比較各樣品試管與對(duì)照試管，可以明顯看出試管內(nèi)肉湯培養(yǎng)基的渾濁度，隨著提物濃度的增加，抑菌活性也增加，龍膽花提取物對(duì)各菌株的最低抑菌濃度分別為：金黃色葡萄球菌60%，大腸桿菌為70%，對(duì)黑曲霉抑制作用很小。其中金黃色葡萄球菌對(duì)提取物最為敏感。

3.3 配伍性測(cè)試結(jié)果

按照2.7、2.8中方法進(jìn)行測(cè)試，90天后進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如下：

由表7可見(jiàn)，添加天然抗菌物質(zhì)龍膽花提取物會(huì)使化妝品顏色變化，呈現(xiàn)出微黃色，且隨著溫度的升高，顏色有所加深，但是不顯著。龍膽花提取物屬于水溶性物質(zhì)，可以應(yīng)用于水劑體系，乳液體系。 與化妝品常規(guī)體系配伍性較好，可以運(yùn)用到化妝品常規(guī)體系中。

表7 龍膽花提取物與基礎(chǔ)原料的配伍性測(cè)試

3.4 龍膽花提取物抑菌活性成分在化妝品體系中的抑菌作用

表8 抑菌成分在保濕水中的抑菌性 (抑菌圈直徑單位：mm)

表9 抑菌成分在潤(rùn)膚霜中的抑菌性 (抑菌圈直徑單位：mm)

從表8、表9可以得出以下結(jié)論：

對(duì)于本實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)化妝品基礎(chǔ)體系(水，乳)，在本實(shí)驗(yàn)操作條件下，空白培養(yǎng)基對(duì)其沒(méi)有抑菌作用，可以排除培養(yǎng)基和外界環(huán)境對(duì)抑菌效果的干擾。龍膽提取物和尼泊金甲酯陽(yáng)性對(duì)照組對(duì) 2種細(xì)菌菌均有明顯的抑制作用，后者對(duì)真菌也抑制效果較好，藍(lán)花龍膽提取物幾乎對(duì)黑曲霉無(wú)抑制。藍(lán)花龍膽提取物在保濕水、潤(rùn)膚乳中對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果較為明顯，大腸桿菌次之。兩種細(xì)菌在乳劑體系中的受抑制的效果要優(yōu)于水劑體系，藍(lán)花龍膽提取物在這兩種不同體系產(chǎn)品中的抑菌圈直徑最低都超過(guò)了7mm，說(shuō)明提取物對(duì)這兩種劑型的化妝品都有一定的抑制能力，但是與很多天然提取物一樣，龍膽提取物的抑菌效果與尼泊金甲酯相比，抑菌效果要弱得多，尤其是對(duì)黑曲霉。以上結(jié)果表明，藍(lán)花龍膽提取物可以作為防腐增效劑用于抑制化妝品中特定的微生物菌群，但是如何增強(qiáng)其抑菌活力，還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

隨著人們生活水平的提高和對(duì)化妝品認(rèn)識(shí)的加深，化妝品安全意識(shí)更加強(qiáng)烈。尋找更加安全有效的天然植物來(lái)源防腐劑越來(lái)越迫切。本文采用醇提法提取了西藏藍(lán)花龍膽中的活性物質(zhì)，以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉為供試菌株，進(jìn)行抑菌活性試驗(yàn)。結(jié)果表明龍膽花提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有一定的抑菌作用，而對(duì)真菌黑曲霉的抑菌性不顯著，其中金黃色葡萄球菌對(duì)提取物最為敏感。通過(guò)配制保濕水和潤(rùn)膚乳，進(jìn)行龍膽提取物的配伍性測(cè)試和抗菌測(cè)試，發(fā)現(xiàn)添加天然抗菌物質(zhì)龍膽花提取物會(huì)使化妝品顏色變化，呈現(xiàn)出微黃色，且隨著溫度的升高，顏色有所加深，但是不顯著。龍膽花提取物可以應(yīng)用于水劑體系，乳液體系， 與化妝品常規(guī)體系配伍性較好，可以運(yùn)用到化妝品常規(guī)體系中。