范曉娜 姚健楠 葛 洋 安廣宇 李 鷹*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100020; 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院腫瘤科，北京 100020 )

食管癌(esophageal cancer，EC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其病死率位居全球消化道腫瘤相關(guān)病死率的第6位[1]。根據(jù)病理分型，食管癌可以分為食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)和食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[2]。在亞洲地區(qū)，食管鱗癌為主要的病理類型，約占食管癌診斷的90%以上[3-4]。目前雖然在內(nèi)窺鏡檢查/手術(shù)，化學(xué)藥物治療和放射治療中已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展，但食管鱗癌的5年存活率仍然很低，僅為15%～25%[5]。因此，尋找食管鱗癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物，對(duì)于食管鱗癌的治療尤為重要。

雙皮質(zhì)素樣激酶1(doublecortin-like kinase 1，DCLK1)是一種微管相關(guān)蛋白激酶，屬于蛋白激酶超家族和雙皮質(zhì)素家族的成員[6]。目前被認(rèn)為是結(jié)腸癌和胰腺癌中特異性的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物[7-9]。在許多研究[10-11]中已經(jīng)報(bào)道了DCLK1的高表達(dá)，如結(jié)腸癌，胰腺癌[12-13]和食管腺癌[14]。近年來，DCLK1作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)引起了廣泛的關(guān)注。靶向DCLK1的小分子激酶抑制劑已被證明可有效對(duì)抗體內(nèi)胃腸腫瘤[15]。重要的是，DCLK1也被證明是某些腫瘤的潛在診斷和預(yù)后因素[16-18]。然而，作為一個(gè)重要的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物及潛在的臨床治療靶點(diǎn)，DCLK1在人類食管鱗癌中的潛在作用知之甚少。本研究初步證明了DCLK1在人食管鱗癌中的潛在生物學(xué)作用，這可為人類食管鱗癌中分子靶向治療的開發(fā)和應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

RPMI 1640培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清和嘌呤霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；載體lentiCRISPR v2來自于中國(guó)醫(yī)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)菌stbl3為本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2購(gòu)自美國(guó)Addgene公司；BsmBI限制酶購(gòu)買自New England Biolabs公司；Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；RNA抽提試劑Trizol和LipofectamineTM3000 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量 RT-PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，引物合成和測(cè)序均由上海生工公司完成；RIPA蛋白裂解液、蛋白抑制劑、PMSF和5×蛋白上樣緩沖液均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PVDF膜和辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；DCLK1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，其余一抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或抗鼠IgG二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人食管鱗癌細(xì)胞系(Kyse410、Kyse450、Kyse510和Kyse70)和HEK293T細(xì)胞均來自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院。所有食管鱗癌細(xì)胞用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和1%(體積分?jǐn)?shù))青-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，HEK293T細(xì)胞用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和1%(體積分?jǐn)?shù))青-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃ 和5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液傳代。

1.3 構(gòu)建DCLK1-sgRNA表達(dá)載體

特異性靶向DCLK1的sgRNA序列如下：Oligo1：5′-CACCGGAGTAGAGAGCTGACTACCA-3′，Oligo2：5′-AAACTGGTAGTCAGCTCTCTACTCC-3′。使用BsmBI限制酶消化lentiCRISPR v2載體，并與含有雙鏈sgRNA的黏性末端連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化stbl3感受態(tài)細(xì)菌，并在含有氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上篩選，挑取單克隆測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 構(gòu)建穩(wěn)定敲除DCLK1的食管鱗癌細(xì)胞系

使用Lipofectamine 3000將上述構(gòu)建的DCLK1-sgRNA表達(dá)質(zhì)粒和lentiCRISPR v2空載質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后48 h和72 h收取上清液，并用0.45 μm過濾器過濾病毒。用病毒感染食管鱗癌細(xì)胞，并用2 μg/mL嘌呤霉素篩選以獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系。擴(kuò)增細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 總RNA提取和qRT-PCR檢測(cè)

Trizol法提取食管鱗癌細(xì)胞總RNA，根據(jù)PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5s，-20 ℃保存。使用GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR，體系為20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，通過2-ΔΔCT方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。所需引物序列如下：DCLK1-F: 5′-CGGTCCACATGCAATAAAAA-3′，DCLK1-R: 5′-GATATCACCGATGCCATCAAG-3′；GAPDH-F: 5′-AATCCCATCACCATCTTCCA-3′，GAPDH-R: 5′-TGGACTCCACGACGTACTCA-3′。

1.6 蛋白提取和Western blotting法檢測(cè)

待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且密度達(dá)到80%～90%左右時(shí)，棄去原有培養(yǎng)基，用4 ℃預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)緩沖液清洗2次，并吸盡培養(yǎng)瓶中殘留的PBS。吸干后加入新配制的細(xì)胞裂解液(1 mL RIPA+10 μL PMSF+10 μL蛋白酶抑制劑)提取細(xì)胞總蛋白，并通過BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉中封閉1 h后，孵育一抗并4 ℃過夜。用TBST洗膜3次，每次5 min，室溫孵育二抗1 h，TBST洗膜3次，最后凝膠成像系統(tǒng)曝光并分析結(jié)果。

1.7 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

將DCLK1敲除組(DCLK1-KO)和對(duì)照(Control)細(xì)胞懸液分別接種在6孔板中。當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)到約80%～90%時(shí)，使用200 μL移液槍頭垂直底面劃線，PBS洗去劃下細(xì)胞，然后將細(xì)胞在不含胎牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分別在0、6、24、48 h以4倍放大率拍攝圖像。使用Image J軟件測(cè)量相同位置處的劃痕的空白區(qū)域。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)

Matrigel以1∶8稀釋并鋪于Transwell小室底部的上室面，置于37 ℃培養(yǎng)箱2 h，隨后，將不含血清的DCLK1-KO和Control組的細(xì)胞懸液分別接種到上室中(105/孔)，將含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基加入到每個(gè)孔的底部。培養(yǎng)24 h后，取出小室，棄去孔中培養(yǎng)基，甲醇固定20 min，0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))結(jié)晶紫染色20 min，干燥后，于10×放大倍數(shù)下各選5個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.9 TCGA食管鱗狀細(xì)胞癌數(shù)據(jù)

通過UCSC癌癥基因組瀏覽器(http://xena.ucsc.edu)下載癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atla，TCGA)數(shù)據(jù)集中的196名食管癌患者(2017-10-13版)的臨床和基因表達(dá)信息。Corrplot函數(shù)(R package corrplot)用于證實(shí)DCLK1和其他基因的表達(dá)水平之間的相關(guān)性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建穩(wěn)定敲除DCLK1的食管鱗癌細(xì)胞系

利用qRT-PCR和Western blotting分別檢測(cè)4種食管鱗癌細(xì)胞系(Kyse450、Kyse70、Kyse410、Kyse510)中DCLK1的基礎(chǔ)表達(dá)水平。兩項(xiàng)結(jié)果顯示，Kyse450和Kyse70細(xì)胞系中DCLK1的mRNA和蛋白水平均高于Kyse510和Kyse410(圖1)。因此，Kyse450和Kyse70兩株細(xì)胞用于進(jìn)行DCLK1敲除實(shí)驗(yàn)的研究。質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果證實(shí)sgRNA成功插入DCLK1-sgRNA表達(dá)載體中(圖1C)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Western blotting驗(yàn)證DCLK1敲除效果，結(jié)果顯示，與對(duì)照組(Control)相比，Kyse450-KO和Kyse70-KO細(xì)胞中DCLK1蛋白明顯減少(圖1D)。

圖1 構(gòu)建DCLK1敲除的食管鱗癌細(xì)胞系Fig.1 Construction of DCLK1 knockout esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) cell lines

A: DCLK1 mRNA expression in four ESCC cell lines (Kyse410， Kyse450， Kyse510， Kyse70);B: DCLK1 protein expression in four ESCC cell lines;C: Sequencing results of DCLK1-sgRNA expression vector;D: Western blotting analysis ofDCLK1 knockout effect in Kyse450 and Kyse70 cells.***P<0.001.DCLK1：doublecortin-like kinase 1；DCLK1-KO:DCLK1 knockout.

2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DCLK1敲除對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響

在Kyse450細(xì)胞中，DCLK1-KO組細(xì)胞在6、24 h和48 h的劃痕愈合速率分別為15.20%、38.30%和54.60%，對(duì)照組的愈合率為46.60%、77.70%和100.00%。Kyse70細(xì)胞的DCLK1-KO組在6 h，24 h和48 h的劃痕愈合速率分別為2.90%、5.50%和9.30%，相應(yīng)的對(duì)照組愈合率為10.50%、17.00%和28.60%。兩種細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，與對(duì)照組相比，DCLK1-KO組細(xì)胞劃痕愈合率均明顯降低(t=22.742，P<0.01;t=22.901，P<0.01;t=30.267，P<0.01)(t=14.113，P<0.01;t=14.880，P<0.01;t=21.875，P<0.01)(圖2)。

2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DCLK1敲除對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

在無Matrigel膠的小室中，Kyse450和Kyse70細(xì)胞的DCLK1-KO組穿出的細(xì)胞數(shù)分別為180.00±16.97和205.50±10.61，均明顯少于相應(yīng)的對(duì)照組穿出細(xì)胞數(shù)515.50±27.58和437.50±17.68，DCLK1敲除可顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞的遷移能力(t=14.653，P<0.01;t=15.915，P<0.01)(圖3A)，這與劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Kyse450和Kyse70細(xì)胞的DCLK1-KO組細(xì)胞侵襲數(shù)分別為158.50±12.02和121.00±12.73，顯著低于相應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞侵襲數(shù)345.00±15.56和416.00±9.89，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.416，P<0.01;t=25.873，P<0.01)(圖3B)。

圖2 DCLK1敲除對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響Fig.2 Effect of DCLK1 knockout on migration ability of esophageal squamous carcinoma (ESCC) cells

圖3 DCLK1敲除對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig.3 Effect of DCLK1 knockout on migration and invasion ability of esophageal squamous carcinoma (ESCC) cells

A: effect ofDCLK1 knockout on migration ability of esophageal squamous carcinoma cells；B: effect ofDCLK1 knockout on invasion ability of esophageal squamous carcinoma cells.**P<0.01.DCLK1：doublecortin-like kinase 1；DCLK1-KO：DCLK1 knockout.

2.4 Western blotting法檢測(cè)DCLK1敲除對(duì)食管鱗癌細(xì)胞EMT的影響

兩種食管鱗癌細(xì)胞的DCLK1敲除均顯著上調(diào)了上皮指標(biāo)E-cadherin蛋白的表達(dá)(t=6.559，P<0.05;t=4.860，P<0.05)，而降低了間質(zhì)指標(biāo)如ZEB1、Snail和Slug的表達(dá)水平(t=9.204，P<0.05;t=23.781，P<0.01;t=13.892，P<0.01)，另外在Kyse450細(xì)胞中Vimentin蛋白降低(t=7.938，P<0.05)(圖4)。

2.5 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析食管鱗癌患者中DCLK1與EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)性

進(jìn)一步分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)并檢查了食管鱗癌患者中DCLK1表達(dá)與EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子之間的相關(guān)性，DCLK1表達(dá)與間質(zhì)標(biāo)志物ZEB1、ZEB2、Vimentin、FN1、CDH2、Snail、Slug和Twist1和Twist2呈正相關(guān)(紅色)，但與CDH1、CLDN4、CLDN7、MUC1和TJP3等上皮標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)(圖5)。

圖4 DCLK1敲除對(duì)食管鱗癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響Fig.4 Effect of DCLK1 knockout on epithelial-mesenchymal transition of esophageal squamous carcinoma cells

圖5 DCLK1與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)據(jù)庫(kù)分析Fig.5 Relationship between DCLK1 and epithelial-mesenchymal transition associated transcription factors

Red: positive correlation;Green: negative correlation；DCLK1：doublecortin-like kinase 1.

3 討論

在我國(guó)，食管鱗癌占比高達(dá)97%以上[4]。作為一種我國(guó)的高發(fā)腫瘤，食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究具有很大的臨床價(jià)值。近年來，靶向治療以其對(duì)癌細(xì)胞的特異性在腫瘤治療中的地位變得越來越重要。腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物DCLK1已被證實(shí)在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并且直接參與腫瘤的轉(zhuǎn)移調(diào)控。本研究初步探索了DCLK1對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)靶向敲除DCLK1后，觀察到食管鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低，提示DCLK1可能是參與食管鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要因子。

Chandrakesan等[19]的研究顯示，敲減DCLK1可減少結(jié)腸息肉、腺瘤和腺癌的數(shù)量和體積，提示DCLK1與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。此外，大量的研究[12-13]表明，敲除DCLK1不僅能夠抑制體外和體內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且顯著抑制胰腺癌細(xì)胞和腎癌細(xì)胞[20]的遷移和侵襲。這些結(jié)果證明了DCLK1在多種腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。研究[18]顯示，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在促進(jìn)食管鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。因此，筆者推測(cè)DCLK1可能通過調(diào)節(jié)EMT進(jìn)程影響食管鱗狀細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。之后，對(duì)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)印跡分析驗(yàn)證了這一假設(shè)，本研究結(jié)果顯示隨著DCLK1的敲除，間質(zhì)標(biāo)志物如Vimentin、ZEB1、Slug和Snail的表達(dá)減少，而上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)增加。此外，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，DCLK1表達(dá)與間質(zhì)標(biāo)志物ZEB1、ZEB2、Vimentin、FN1、CDH2、Snail、Slug和Twist1和Twist2呈正相關(guān)，但與CDH1、CLDN4、CLDN7、MUC1和TJP3等上皮標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)，這與本研究結(jié)果一致。這些發(fā)現(xiàn)表明DCLK1可通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)食管鱗癌腫瘤發(fā)生。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一項(xiàng)新興的基因編輯技術(shù)，以其簡(jiǎn)單、高效和多功能性在體外和體內(nèi)都獲得了廣泛的認(rèn)可，并成功應(yīng)用于編輯人類基因組[21-22]。本實(shí)驗(yàn)基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了穩(wěn)定敲除DCLK1的食管鱗癌細(xì)胞系，為進(jìn)一步探索DCLK1在食管鱗癌進(jìn)展中分子機(jī)制提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

盡管目前對(duì)DCLK1的研究逐步深入，但本研究結(jié)果初步證明了DCLK1在食管鱗癌中的生物學(xué)作用，這是第一次證明DCLK1可能作為食管鱗癌中EMT信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子，為臨床食管鱗癌治療提供了一個(gè)新的思路。另外，仍需進(jìn)一步深入探討DCLK1影響EMT進(jìn)程的分子機(jī)制。