張雪妍，秦小明,2,3,4，高加龍,2,3,4，林海生,2,3,4，章超樺,2,3,4，黃艷球

?

牡蠣酶解工藝優(yōu)化及其酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠睪酮分泌的影響

張雪妍1，秦小明1,2,3,4，高加龍1,2,3,4，林海生1,2,3,4，章超樺1,2,3,4，黃艷球1

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 / 2. 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室室/ 3. 廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 4. 國(guó)家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江），廣東 湛江 524088）

【】?jī)?yōu)化太平洋牡蠣（）酶解工藝條件，并研究酶解產(chǎn)物及其超濾組分對(duì)體外培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖及睪酮分泌的影響。以多肽得率為參考標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)木瓜蛋白酶酶解牡蠣的加酶量、初始pH、酶解時(shí)間、酶解溫度進(jìn)行單因素及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化；通過MTT法及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)不同濃度牡蠣酶解產(chǎn)物及其超濾組分對(duì)TM3小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖及睪酮分泌的影響。木瓜蛋白酶最佳酶解條件為加酶量3 000 U/g，初始pH 6. 5，酶解溫度62.5 ℃，酶解時(shí)間4.5 h，在此條件下其多肽質(zhì)量濃度為14.95 mg/mL；牡蠣酶解液及其超濾組分在 0.25~1.00 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與空白對(duì)照組相比，能夠顯著增加TM3細(xì)胞的增殖活性（＜0.05），且具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性。其中，< 5 ku 和5~10 ku超濾組分細(xì)胞增殖活性及促進(jìn)睪酮分泌活性均最強(qiáng)。牡蠣酶解產(chǎn)物及其超濾組分可有效增強(qiáng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖活性并促進(jìn)其分泌睪酮。

牡蠣；酶解產(chǎn)物；小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞；增殖活性；睪酮

男性的雄激素主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌[1]，而睪酮作為最主要的雄激素，可以通過劑量依賴的方式促進(jìn)精子的產(chǎn)生，并改善肌肉質(zhì)量和增強(qiáng)體力，在維持男性健康方面發(fā)揮著重要作用[2-4]。但是睪丸間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而減少，睪酮分泌量也隨之減少，從而導(dǎo)致肌肉萎縮及骨質(zhì)疏松等疾病發(fā)生[5]。最近研究表明，人工合成品睪酮替代物可以起到類睪酮作用，能夠改善老年男性的肌肉量減少和骨質(zhì)減少等癥狀[6-7]。

太平洋牡蠣（），也稱長(zhǎng)牡蠣，俗稱生蠔、海蠣子等，是一種廣溫、廣鹽的內(nèi)灣雙殼貝類[8]。20世紀(jì)80年代初從日本引入我國(guó)，由于該品種產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、形態(tài)肥滿等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)北方大面積養(yǎng)殖[9]，已逐步成為我國(guó)乃至全球牡蠣養(yǎng)殖的首選品種。太平洋牡蠣隸屬于瓣鰓綱（lammelibranchia）牡蠣目（Osteroida）牡蠣科（Ostreidae）巨蠣屬（）[10]，肉質(zhì)鮮美，含有豐富糖原、蛋白質(zhì)、氨基酸、?；撬?、脂肪酸、維生素和無機(jī)鹽[11]，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，被冠以“海洋牛奶”“根之源”之美稱[12]。牡蠣已被我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)為藥食兩用材料[13]。牡蠣還具有廣泛的生理活性，其提取物具有增強(qiáng)機(jī)體免疫[14]、抗氧化[15]、抗疲勞[16]、抗菌[17]、降血糖[18]、降血壓[19]、醒酒護(hù)肝[20]等多種生物活性，此外有增強(qiáng)男性性功能的潛在藥用價(jià)值[21]。研究表明，小分子牡蠣多肽可增加小鼠血清中膽固醇和性激素含量，提高小鼠的交配能力、性腺器官重量和臟器系數(shù)以及精子質(zhì)量[22]。羅齊軍等[23]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充牡蠣多肽可以使大鼠血睪酮含量增加，從而改善長(zhǎng)期大負(fù)荷訓(xùn)練導(dǎo)致的低血睪酮。上述研究均只證明了牡蠣提取物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)大鼠或小鼠睪酮分泌有促進(jìn)作用，但相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及其分子機(jī)制目前尚未有研究報(bào)道。

本研究以太平洋牡蠣為原料，以多肽得率為指標(biāo)對(duì)牡蠣的酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，利用體外促進(jìn)小鼠睪酮分泌評(píng)價(jià)進(jìn)行活性追蹤，通過酶解、超濾等手段對(duì)活性成分進(jìn)行有效富集，探究牡蠣酶解產(chǎn)物及其超濾組分對(duì)TM3雄性小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖及分泌睪酮的影響，為研發(fā)促進(jìn)男性睪酮分泌及生殖健康保健功能食品提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮太平洋牡蠣購(gòu)于日本東京筑地市場(chǎng)（牡蠣酶解工藝優(yōu)化及樣品制備均在日本東京海洋大學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成），木瓜蛋白酶（酶活力5×104U/g）購(gòu)于廣西南寧龐博生物有限公司，DMED/F12 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，馬血清、青/鏈霉素雙抗購(gòu)自HyClone公司，噻唑蘭（MTT）購(gòu)自Genview公司，小鼠睪酮ELISA試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞（TM3）購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 儀器與設(shè)備

7780型高速落地冷凍離心機(jī)購(gòu)自日本久保田商事株式會(huì)社，UV-1800型蛋白微量測(cè)定用分光光度計(jì)購(gòu)自日本東京島津科學(xué)株式會(huì)社，F(xiàn)-52型精密pH計(jì)購(gòu)自日本帝國(guó)理化株式會(huì)社，F(xiàn)DU-2000型真空冷凍干燥儀購(gòu)自東京理化器械株式會(huì)社，超濾裝置及其超濾膜購(gòu)自美國(guó)Milipore 公司，CKX41型倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus，SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化有限公司，F(xiàn)orma 370型CO2恒溫箱、Multiskan FC型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，5810R型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 木瓜蛋白酶酶解牡蠣單因素條件選擇 選用木瓜蛋白酶[24]，以多肽得率為指標(biāo)，考察不同加酶量(1 000、2 000、3 000、5 000、7 000 U/g)、pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、酶解溫度（50、55、60、65、70 ℃）、酶解時(shí)間（2、3、4、5、6 h）對(duì)多肽得率的影響。

1.3.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以加酶量、pH、酶解溫度、酶解時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化酶解條件。通過直觀分析，得到最佳酶解條件。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平參見表1。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平

1.3.3 多肽含量的測(cè)定 根據(jù)魯偉等[25]蛋白水解液中多肽含量的測(cè)定方法，基于三氯乙酸在酸性條件下與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而凝聚沉淀的原理，通過雙縮脲法測(cè)定經(jīng)三氯乙酸沉淀后上清液在540 nm下光密度值，對(duì)照牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線（= 0.052 4- 0.000 4，2 = 0.999 6），得樣品溶液中多肽濃度。

1.3.4 牡蠣酶解產(chǎn)物的制備流程 取新鮮牡蠣肉，經(jīng)洗凈、瀝干，然后按料水質(zhì)量體積比1∶3（g/mL）比例[26]加入預(yù)冷的蒸餾水，高速勻漿，加入木瓜蛋白酶，以正交實(shí)驗(yàn)得到的優(yōu)化條件酶解牡蠣，酶解液沸水浴滅活10 min，冷卻至室溫，最后以8 000 r/min 離心20 min取上清液，部分留作下一步超濾分級(jí)，部分濃縮后冷凍干燥備用。

1.3.5 超濾分級(jí) 利用超濾攪拌裝置及5、10 ku超濾膜對(duì)酶解液進(jìn)行分級(jí)處理，進(jìn)口壓力控制在344.7 kPa，得到<5、5~10和>10 ku 3個(gè)超濾組分，收集各個(gè)組分，冷凍干燥備用。

1.3.6 MTT法檢測(cè)牡蠣酶解產(chǎn)物及其超濾組分對(duì)TM3細(xì)胞體外增殖的影響 TM3細(xì)胞在D-MEM/F-12培養(yǎng)基（體積分?jǐn)?shù)92.5%）中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有體積分?jǐn)?shù)5%馬血清和體積分?jǐn)?shù)2.5%優(yōu)質(zhì)胎牛血清，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（體積分?jǐn)?shù)5% CO2，濕度95%）。在96孔培養(yǎng)板上每孔加6 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行種板，培養(yǎng)12 h后，將細(xì)胞用不同質(zhì)量濃度（0、0.125、 0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL）的酶解產(chǎn)物及其超濾組分（<5、5~10和>10 ku)）進(jìn)行處理，并分別培養(yǎng)12和24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用磷酸緩沖液PBS配置5g/L MTT溶液，每孔加入20 μL MTT溶液，并在培養(yǎng)板溫育4 h。小心吸走上清液，向每孔中加入100 μL DMSO，然后搖動(dòng)10 min。用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)量上清液的光密度值[27]。

1.3.7 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)睪酮含量 TM3細(xì)胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度（0.25、0.50、1.00 mg/mL）牡蠣酶解產(chǎn)物及其超濾組分（<5、5~10和>10 ku）干預(yù)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 000 r/min離心20 min取上清液，根據(jù)小鼠ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中睪酮含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016、Origin 2017、SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，用LSD多重比較進(jìn)行差異顯著性分析（= 0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜蛋白酶酶解條件的確定

2.1.1 加酶量對(duì)酶解效果的影響 在pH 6.5，酶解溫度60.0 ℃，酶解 5.0 h的條件下，考察不同加酶量對(duì)多肽得率的影響，如圖 1 所示。多肽濃度隨著加酶量的增加而逐漸上升，當(dāng)加酶量超過 3 000 U/g后，多肽濃度無顯著性變化（> 0.05）。這是因?yàn)槊附獬跏茧A段底物和蛋白酶濃度較大，酶解速度較快；隨著反應(yīng)的進(jìn)行，底物濃度逐漸減小，酶活力不斷下降，酶解液中蛋白與酶的接觸面積減少，酶解速度降低[28]。因此在加酶量超過3 000 U/g后，多肽得率不會(huì)隨著加酶量的增加而增加，反而由于肽段開始被分解而出現(xiàn)多肽濃度緩慢降低的情況。為避免水解過度導(dǎo)致不必要的肽損失及節(jié)約成本等考慮，選取加酶量為3 000 U/g。

2.1.2 初始pH對(duì)酶解效果的影響 在加酶量3 000 U/g，酶解溫度60.0 ℃，酶解5.0 h的條件下，考察不同初始pH對(duì)多肽得率的影響，如圖 2 所示，pH 6.5 時(shí)，多肽濃度最高，且與pH 5.0、5.5和7.0具有顯著差異（< 0.05）。由于牡蠣勻漿在添加木瓜蛋白酶后，初始pH值更接近于pH 6.5，且木瓜蛋白酶在pH 6.5時(shí)對(duì)牡蠣具有理想的酶解效果[24]，故選擇6.5為初始pH。

凡有一個(gè)相同標(biāo)記字母即為差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

凡有一個(gè)相同標(biāo)記字母即為差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

2.1.3 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響 在pH 6.5，加酶量3 000 U/g，酶解 5.0 h的條件下，不同酶解溫度對(duì)多肽得率的影響如圖 3 所示。隨著溫度的升高，多肽濃度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在60 ℃時(shí)達(dá)到最大值，超過此溫度后多肽濃度顯著降低（< 0.05），這是由于蛋白酶在高溫條件下會(huì)變性失活，失去其切斷肽鏈的作用。由于高溫條件對(duì)樣品生物活性和木瓜蛋白酶酶活力的不利影響，選用 60 ℃作為酶解溫度。周燕芳等[29]在通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化木瓜蛋白酶酶解海產(chǎn)小雜魚時(shí)，其肽回收率和水解度在酶解溫度60 ℃時(shí)均最高，酶解效果最好，該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說明木瓜蛋白酶在60 ℃時(shí)酶解活性最強(qiáng)。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響 在pH 6.5，加酶量3 000 U/g，酶解溫度60 ℃，考察不同酶解時(shí)間對(duì)多肽得率的影響，如圖 4 所示。多肽濃度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，多肽濃度在酶解時(shí)間4.0~6.0 h間，多肽濃度無顯著性變化（> 0.05），是由于酶解初始階段底物濃度和蛋白酶濃度較大，酶解速度快；隨著反應(yīng)進(jìn)行，底物濃度減小，酶活力下降，酶解速度降低。因此為了避免水解過度導(dǎo)致肽損失及節(jié)約時(shí)間成本考慮，選取酶解時(shí)間4.0 h為宜。

凡有一個(gè)相同標(biāo)記字母即為差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

凡有一個(gè)相同標(biāo)記字母即為差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

2.1.5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表2所示，根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果極差值可確定各個(gè)因素影響酶解效果的主次關(guān)系，即：加酶量＞pH＞酶解時(shí)間＞酶解溫度。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果值可得出最佳酶解條件為2232,即加酶量3 000 U/g，pH 6.5，酶解溫度62.5 ℃，酶解時(shí)間 4.5 h，在此條件下，牡蠣酶解液多肽含量最高。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，此條件下酶解得到的多肽質(zhì)量濃度為 14.95 mg/mL。

2.2 牡蠣酶解產(chǎn)物及其超濾組分對(duì)TM3細(xì)胞體外增殖的影響

TM3細(xì)胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度（0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL）的牡蠣酶解產(chǎn)物及其超濾組分（<5、5~10和>10 ku）干預(yù)12 h及24 h后，細(xì)胞活性如圖5、6所示。如圖5所示，在12 h作用時(shí)間內(nèi)，隨著牡蠣酶解產(chǎn)物及其超濾組分的作用濃度逐漸增加，TM3細(xì)胞的細(xì)胞活性也逐漸增強(qiáng)，與空白對(duì)照組相比，除牡蠣酶解產(chǎn)物在質(zhì)量濃度0.125 mg/mL的組分外，其余組分細(xì)胞活性均顯著增強(qiáng)（＜0.05），且牡蠣酶解產(chǎn)物及其超濾組分四個(gè)組分增強(qiáng)細(xì)胞活性均表現(xiàn)為濃度依賴性（＜0.05）。如圖6所示，在24 h作用時(shí)間內(nèi)，酶解產(chǎn)物及其超濾組分對(duì)TM3細(xì)胞的細(xì)胞活性隨著樣品濃度的增加，呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，這是由于隨著作用于細(xì)胞的樣品濃度增高，時(shí)間增長(zhǎng)，樣品對(duì)于細(xì)胞的作用會(huì)從促進(jìn)逐漸轉(zhuǎn)為抑制。但各質(zhì)量濃度組分（0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL）相較于空白對(duì)照組，細(xì)胞活性均顯著增強(qiáng)（＜0.05）。說明酶產(chǎn)物及其超濾組分對(duì)TM3細(xì)胞具有細(xì)胞增殖活性，除＞10 k超濾組分在1 mg/mL質(zhì)量濃度下對(duì)TM3細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)，其余組分的最佳作用質(zhì)量濃度均為0.500 mg/mL。KIM等[22]研究了海馬酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響，海馬酶解產(chǎn)物在0.2、0.5和1.0 mg/mL質(zhì)量濃度下作用于TM3細(xì)胞24 h 后，均顯著增強(qiáng)了細(xì)胞活力，且其最佳作用濃度在0.5~1.0 mg/mL之間。該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，說明水產(chǎn)品蛋白酶解產(chǎn)物的生物活性物質(zhì)質(zhì)量濃度在0.5~1.0 mg/mL區(qū)間對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞均具有較好的增殖活性。與海馬酶解產(chǎn)物相比，在0.5 和1.0 mg/mL 質(zhì)量濃度作用下，牡蠣酶解產(chǎn)物促進(jìn)TM3 增殖活性的效果優(yōu)于海馬酶解產(chǎn)物。

表2 牡蠣酶解工藝優(yōu)化L9 (34)正交試驗(yàn)直觀分析

同組別不同樣品濃度間凡有一個(gè)相同標(biāo)記字母即為差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

同組別不同樣品濃度間凡有一個(gè)相同標(biāo)記字母即為差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

12 h與24 h細(xì)胞活性相比較，在0.125~1.000 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同組分的24 h細(xì)胞活性在相同濃度下均高于其12 h細(xì)胞活性（＜0.05），說明牡蠣酶解產(chǎn)物及其超濾組分對(duì)TM3細(xì)胞增殖活性具有時(shí)間依賴性。比較12 h及24 h不同組分的細(xì)胞活性增殖情況，超濾組分（<5、5~10和>10 ku）的細(xì)胞增殖活性明顯強(qiáng)于牡蠣酶解產(chǎn)物組（＜0.05），說明經(jīng)過超濾分級(jí)，促進(jìn)TM3細(xì)胞增殖的有效活性成分得到了富集。

在12 h作用范圍內(nèi)，>10 ku超濾組分對(duì)TM3細(xì)胞增殖活性最顯著，且具有顯著的濃度差異（＜0.05）。到24 h作用后，<5、5~10 ku超濾組分的增殖效果更明顯，且最佳有效作用質(zhì)量濃度（0.500 mg/mL）較>10 ku組分（1.000 mg/mL）更低。綜合分析，>10 ku組分只是培養(yǎng)前期促進(jìn)細(xì)胞增殖速度較快，24 h作用后增殖效果不及<5、5~10 ku 超濾組分（＜0.05），故<5、5~10 ku 超濾組分對(duì)TM3細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)睪酮含量

根據(jù)MTT法測(cè)得作用24 h細(xì)胞活性試驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)顯著性差異分析，得出0.25、0.50、1.00 mg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度作用下TM3細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性顯著高于其他質(zhì)量濃度（＜0.05），故將這3個(gè)濃度的牡蠣酶解產(chǎn)物作用于TM3細(xì)胞24 h后，測(cè)TM3細(xì)胞分泌睪酮含量，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）得出結(jié)果如圖7所示。與空白對(duì)照組相比，＜5 ku和5~10 ku超濾組分在0.25、0.50 和1.00 mg/mL質(zhì)量濃度條件下，睪酮分泌均顯著高于空白對(duì)照組（＜0.05），且具有濃度依賴性（＜0.05），說明＜5 ku和5~10 ku超濾組分可以有效促進(jìn)TM3細(xì)胞分泌睪酮。＞10 ku超濾組分及牡蠣酶解產(chǎn)物組雖在0.25、1.00 mg/mL條件下與空白對(duì)照無顯著性差異（> 0.05），但在0.50 mg/mL條件下，睪酮含量顯著高于空白對(duì)照組（＜0.05）。說明牡蠣酶解液及＞10 ku超濾組分在0.50 mg/mL條件下，能有效促進(jìn)TM3細(xì)胞分泌睪酮。3個(gè)組分相比較，<5 ku和5~10 ku 超濾組分對(duì)促進(jìn)TM3細(xì)胞分泌睪酮活性較強(qiáng)。

KIM等[27]研究海馬酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的影響，發(fā)現(xiàn)海馬酶解產(chǎn)物對(duì)促進(jìn)小鼠間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮具有濃度依賴性，說明海洋資源中潛在的生物活性物質(zhì)可以通過酶法水解得到釋放，通過酶解海洋生物制備活性物質(zhì)具有較高的研究意義。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[22]已表明牡蠣酶解產(chǎn)物可顯著提高小鼠血清睪酮水平，而本研究通過對(duì)TM3細(xì)胞體外培養(yǎng)，測(cè)定牡蠣酶解產(chǎn)物對(duì)TM3細(xì)胞作用下對(duì)其分泌睪酮的影響，對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物提高小鼠血清睪酮水平提供了機(jī)制的初步探究和實(shí)驗(yàn)支持，因此牡蠣酶解產(chǎn)物提高小鼠血清睪酮水平可能是通過作用于小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)其增殖及睪酮分泌而來實(shí)現(xiàn)其功能作用。

同組別不同樣品濃度間凡有一個(gè)相同標(biāo)記字母即為差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

4 結(jié)論

1）通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)分析，確定木瓜蛋白酶的最佳酶解條件為加酶量3 000 U/g、pH 6.5、酶解溫度62.5 ℃、酶解時(shí)間 4.5 h，在此條件下太平洋牡蠣酶解得到的多肽質(zhì)量濃度為14.95 mg/mL。

2）牡蠣酶解液及其超濾組分在0.25 ~ 1.00 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，能夠顯著增加TM3細(xì)胞的增殖活性，且具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性；牡蠣酶解液及其超濾組分能夠顯著提高TM3細(xì)胞分泌睪酮，尤其是＜5 ku和5~10 ku兩個(gè)超濾組分。因此牡蠣酶解液及其超濾組分能有效增強(qiáng)TM3細(xì)胞增殖活性并促進(jìn)其分泌睪酮。

[1] BARQAWI A, CRAWFORD E D. Testosterone replace- ment therapy and the risk of prostate cancer. Is there a link?[J]. International Journal of Impotence Research, 2006, 18(4): 323.

[2] BHASIN S. Proof of the effect of testosterone on skeletal muscle[J]. Journal of Endocrinology, 2001, 170(1): 27-38.

[3] NIGRO N, CHRIST-CRAIN M. Testosterone treatment in the aging male: myth or reality[J]. Swiss Med Wkly, 2002, 142: w13539

[4] HORSTMAN A M, DILLON E L, URBAN R J, et al. The role of androgens and estrogens on healthy aging and longevity[J]. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences, 2012, 67(11): 1140-1152.

[5] MATSUMOTO A M. Andropause clinical implications of the decline in serum testosterone levels with aging in men[J]. J Gerontol A Biol Sci Med Sci, 2002, 57(2):M76.

[6] STEIDLE C, SCHWARTZ S, JACOBY K, et al. Aa2500 testosterone gel normalizes androgen levels in aging males with improvements in body composition and sexual function[J]. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2003, 88(6):2673-2681.

[7] O′SHAUGHNESSY P J, FOWLER P A. Endocrinology of the mammalian fetal testis[J]. Reproduction, 2011, 141(1): 37-46.

[8] 周玉蘭, 閆守泉, 牛艷茹, 等. 太平洋牡蠣基因SNPs開發(fā)及其與溫度相關(guān)性分析[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 37(3): 14-22.

[9] 于瑞海. 太平洋牡蠣育苗及養(yǎng)殖現(xiàn)狀[N]. 中國(guó)漁業(yè)報(bào), 2014-08-04(B3).

[10] 蔡英亞, 張英, 魏若飛. 貝類學(xué)概論[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1994: 211-212.

[11] 代春美, 廖曉宇, 葉祖光. 海洋中藥牡蠣的化學(xué)成分、藥理活性及開發(fā)應(yīng)用[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2016, 28(03): 471-474; 437.

[12] 葉知秋. 海鮮食療養(yǎng)生法[M]. 長(zhǎng)春: 吉林科學(xué)出版社, 2004.

[13] 陳必鏈, 王紹釗, 吳松剛. 牡蠣水提取氨基酸的研究[J]. 適用技術(shù)市場(chǎng), 1998(4): 25-26.

[14] 李婉, 曹文紅, 章超樺, 等. 牡蠣酶解產(chǎn)物的組成特點(diǎn)及其體外免疫活性[J]. 食品工業(yè)科技, 2017, 38(16): 35-42.

[15] HAO G, CAO W, HAO J, et al.antioxidant activity and in vivo anti-fatigue effects of oyster (Gmelin) peptides prepared using neutral proteinase[J]. Food Science & Technology Research, 2013, 19(4): 623-631.

[16] 吉宏武, 苗建銀, 邵海艷, 等. 近江牡蠣肉水解物的營(yíng)養(yǎng)成分及抗疲勞作用研究[J]. 食品科技, 2010, 35(2): 70-73.

[17] 王春波, 蘭曉明, 王洪江，等. 牡蠣軟體中抗菌蛋白的制備及活性研究[J]. 海洋與湖沼, 2010, 41(1): 33-38.

[18] 鄧燕群. 牡蠣活性肽及其復(fù)合物降血糖作用的研究[D]. 廈門: 汕頭大學(xué), 2015.

[19] 邱娟, 沈建東, 翁凌, 等. 利用牡蠣制備ACE抑制肽的工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 165-172.

[20] 侯麗, 汪秋寬, 何云海, 等. 牡蠣多糖提取及其對(duì)小鼠急性酒精肝損傷的保護(hù)作用[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(22): 356-358; 370.

[21] 褚波. 烏賊、牡蠣——來自海洋的良藥[J]. 家庭醫(yī)藥, 2009(2): 20.

[22] 陳悅, 李路, 閆朝陽, 等. 小分子牡蠣多肽對(duì)雄性小鼠性功能的影響[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2019, 38(1): 109-116.

[23] 羅齊軍, 魯順保, 李紅, 等. 牡蠣多肽對(duì)長(zhǎng)期大負(fù)荷訓(xùn)練大鼠血睪酮、和mRNA表達(dá)的影響[J]. 江西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2013, 37(6): 611-616.

[24] 馮丹丹, 馮金曉, 薛勇, 等. 四種蛋白酶對(duì)牡蠣的酶解效果研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(12): 189-192.

[25] 魯偉, 任國(guó)譜, 宋俊梅. 蛋白水解液中多肽含量的測(cè)定方法[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(7): 169-171.

[26] 常格. 牡蠣蛋白酶解產(chǎn)物抗疲勞作用研究及新產(chǎn)品研發(fā)[D]. 湛江: 廣東海洋大學(xué), 2016.

[27] KIM Y M, JEON Y J, HUH J S, et al. Effects of enzymatic hydrolysate from seahorse hippocampus abdominalis on testosterone secretion from TM3 leydig cells and in male mice[J]. Applied Biological Chemistry, 2016, 59(6): 869-879.

[28] 孫瑞坤, 章超樺, 曾少葵, 等. 方格星蟲酶解工藝優(yōu)化及酶解物免疫活性[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 38(3): 54-61.

[29] 周燕芳, 黃曉麗. 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解海產(chǎn)小雜魚及酶解液抗氧化性[J]. 食品工業(yè), 2018, 39(10): 99-104.

Optimization of Enzymatic Hydrolysis fromand Effects of Its Enzymatic Hydrolysate on TM3 Leydig Cells

ZHANG Xue-yan1,QIN Xiao-ming1,2,3,4, GAO Jia-long1,2,3,4, LIN Hai-sheng1,2,3,4,ZHANG Chao-hua1,2,3,4, HUANG Yan-qiu1

（1.,/ 2./ 3./ 4.,524088,）

【】To optimize the enzymolysis process conditions ofand explore the effects of enzymatic hydrolysate and its ultrafiltration fractions on cell proliferation and testosterone secretion in the TM3 leydig cells.【】Based on the peptide yield, the single factor optimization and orthogonal experiments were carried out to get the best amount of enzyme, initial pH, temperature and time of enzymatic hydrolysis for papain to hydrolyze oysters. The MTT assay and ELISA kit were used to detect the effects of the proliferation and secretion of testosterone in the TM3 cells, which were treated by different concentrations of oyster hydrolysate and its ultrafiltration fractions.【】The optimal enzymatic hydrolysis conditions for papain are as follows: enzyme addition 3 000 U/g, initial pH 6.5, temperature 62.5 ℃, and time 4.5 h. Its peptide concentration is 14.95 mg/mL. Oyster hydrolysate and its ultrafiltration fraction can significantly increase the proliferation activity of TM3 cells in a concentration range of 0.25-1.00 mg/mL when it is compared with the blank control group in a concentration- and time-dependent manner（＜0.05）. The ultrafiltration components of <5 ku and 5-10 ku significantly enhanced cell proliferation and promoted testosterone secretion.【】The oyster hydrolysate and its ultrafiltration component can effectively enhance the proliferation of mouse Leydig cells and promote the secretion of testosterone.

; enzymatic hydrolysate; leydig cells; proliferative activity; testosterone

Q954.4

A

1673-9159（2019）03-0096-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.03.013

2019-01-25

貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-49）；廣東省應(yīng)用型科技研發(fā)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2016B020235002）

張雪妍（1992－），女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail:1162742815@qq.com

秦小明（1964－），男，教授，研究方向?yàn)楹Ｑ笊镔Y源高值化利用、水產(chǎn)品?；钸\(yùn)輸。E-mail:xiaoming0502@21cn.com

張雪妍，秦小明，高加龍，等. 牡蠣酶解工藝優(yōu)化及其酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠睪酮分泌的影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（3）：96-102.

（責(zé)任編輯：劉朏）