鄭 哲，吳宣瑾，焦 鈺，黃榮蓮，杜曉東, 2

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馬氏珠母貝基因的克隆及組織表達(dá)

鄭 哲1，吳宣瑾1，焦 鈺1，黃榮蓮1，杜曉東1, 2

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088）

【】克隆馬氏珠母貝（）抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase，TRACP) 基因，分析該基因在不同組織中的表達(dá)模式?！尽坑肦ACE技術(shù)克隆得馬氏珠母貝基因（），用實(shí)時熒光定量PCR分析該基因在外套膜、閉殼肌、足、性腺、珍珠囊、肝胰腺和鰓中的表達(dá)?！尽炕蜷L度為2 034 bp，開放式閱讀框972 bp，編碼323個氨基酸，5′UTR長度為27 bp，3′UTR長度為1 035 bp。預(yù)測PmTRACP分子質(zhì)量約為36.39 ku，理論等電點(diǎn)為5.97。該基因含有一個鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶樣磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域。PmTRACP與其他物種TRACP的同源性為48% ~ 65%，與長牡蠣（）TRACP的同源性最高，同時D32、D70、Y73、N108、H203、H212、H237、H239等8個氨基酸活性位點(diǎn)和N114糖基化位點(diǎn)在不同物種TRACP中高度保守。PmTRACP與長牡蠣TRACP的親緣關(guān)系最近。在馬氏珠母貝各個組織均有表達(dá)，且在肝胰腺和珍珠囊中高表達(dá)。

馬氏珠母貝; 抗酒石酸酸性磷酸酶; 基因克隆；基因表達(dá)；實(shí)時熒光定量PCR

抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase，TRACP）是酸性磷酸酶的第5型同工酶，對酒石酸不敏感，是一種在活性部位含雙核金屬離子絡(luò)合物的金屬酶，廣泛存在于動物、植物、真菌等細(xì)胞中[1]。TRACP可根據(jù)其最適pH從其他磷酸酶中分離，同時由于活性域中酪氨酸Fe3+的一個電荷轉(zhuǎn)移而出現(xiàn)典型的紫色特征，故亦被稱為紫色酸性磷酸酶（Purple acid phosphatases，PAPs）[2]。該家族成員均含5個保守結(jié)構(gòu)域，其中7個劃線的氨基酸殘基為不變氨基酸，存在于酶活性部位的二價金屬離子協(xié)調(diào)中心[3-4]。在脊椎動物中，位于破骨細(xì)胞微粒體的TRACP與其他酶一起參與骨基質(zhì)固體礦化物降解，從而參與骨穩(wěn)態(tài)的動態(tài)調(diào)控[5-6]，是測定骨吸收和破骨細(xì)胞活性的標(biāo)志物[7-8]。

軟體動物分泌的貝殼、珍珠與脊椎動物骨骼類似，均通過機(jī)體礦化組織細(xì)胞分泌的基質(zhì)蛋白控制生物礦化而形成，其TRACP是否有類似脊椎動物的功能尚待研究。Zang等[9]在淡水腹足類光滑雙臍螺（）成體外套膜組織中檢測到TRACP表達(dá)，并將其作為區(qū)分胚胎貝殼形成組織與成體外套膜組織的細(xì)胞標(biāo)志物。馬氏珠母貝（）亦稱合浦珠母貝（），隸屬于珍珠貝屬，是海水育珠重要貝種，亦是研究生物礦化的重要模型。Wang等[3]發(fā)現(xiàn)馬氏珠母貝基因參與由脂多糖（Lipopolysaccharides, LPS）引發(fā)的非特異性免疫及植核育珠過程的免疫反應(yīng)。因此，進(jìn)一步研究功能，探究其與生物礦化關(guān)系可為馬氏珠母貝育珠研究提供基礎(chǔ)資料。本研究克隆并分析馬氏珠母貝的TRACP基因，并用熒光定量 PCR 技術(shù)檢測該基因在馬氏珠母貝各組織中的表達(dá)量，為進(jìn)一步研究馬氏珠母貝抗酒石酸酸性磷酸酶的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

馬氏珠母貝取自廣東省湛江市徐聞養(yǎng)殖基地，為規(guī)格一致的健康2齡貝。取馬氏珠母貝外套膜邊緣區(qū)（Mantle edge，ME）、外套膜套膜區(qū)（Mantle pallium，MP）、中央膜區(qū)（Mantle central，MC）、足（Foot，F(xiàn)）、肝胰腺（Hepatopancreas，HE）、性腺（Gonad，GO）、閉殼?。ˋdductor muscle，A）和鰓（Gill，GI），用液氮速凍后，于-80℃冰箱保存。DH5α感受態(tài)細(xì)胞，由廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室保存。

Trizol購自Invitrogen公司，Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H)、Reconbinant Rnase Inhibitor、DNA 分子標(biāo)記、pMD19-T 載體等購自TaKaRa公司；RACE 試劑盒購自Clontech公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，瓊脂糖H購自上海生工生物工程有限公司，SYBR?Select Master Mix購自Applied Biosystems公司。

1.2 總RNA的提取以及cDNA的合成

用 Trizol法提取馬氏珠母貝各組織的總RNA，通過10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證完整性，運(yùn)用 Nano Drop ND1000 紫外分光光度計(jì)分析濃度及純度。參照SMARTerTM RACE cDNA Amplification kit的說明書操作獲得 5′ RACE和 3′ RACE 模板；參照Reverse Transcriptase M-MLV（RNaseH）說明書合成實(shí)時熒光定量cDNA模板。

1.3 PmTRACP基因全長序列獲得

根據(jù)馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的unigene序列設(shè)計(jì)基因特異性引物，擴(kuò)增其中間片段，連接到PMD19-T載體并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，送上海生工生物工程有限公司測序，驗(yàn)證正確后，按照clontech的SMARTTM RACE cDNA amplification kit說明書以及參考本實(shí)驗(yàn)室王志新等的方法[10]進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，得5′和 3′末端序列，通過10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，分離純化的目的基因片段連接到PMD19-T載體后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆測序，將測序后的序列與已知的片段拼接獲得cDNA全長，所用基因特異性引物見表1。

表1 PmTRACP基因克隆及 qRT-PCR所用引物

1.4 基因生物信息學(xué)分析

對測序結(jié)果用VecScreen（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/tools/vecscreen/）去除載體序列，并用 DNAMAN 軟件拼接，獲得TRACP的cDNA全長序列，并預(yù)測基因的ORF和氨基酸序列；分子質(zhì)量和等電點(diǎn)的預(yù)測在expasy中（http://web.expasy. org/compute_pi/）進(jìn)行；通過SignalP 4.1 (http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽。運(yùn)用SMART（http://www.ebi.ac.uk/ interpro/）預(yù)測其結(jié)構(gòu)域。運(yùn)用 Cluster W（http：//www.genome.jp/tools/ clustalw/）結(jié)合NCBI在線Blastp（https://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行同源性分析；用Mega 6軟件構(gòu)建生物系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 PmTRACP基因組織差異表達(dá)

用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測在馬氏珠母貝各組織中的表達(dá)情況。以 cDNA第1鏈為模板，以作內(nèi)參基因，反應(yīng)體系（10 μL）：10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，cDNA 0.5 μL，SYBR? Select Master Mix 5 μL，滅菌的ddH2O 3.7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃下預(yù)變性2 min，95 ℃下變性 15 s，60 ℃下退火1 min，40循環(huán)，添加 1個溶解曲線。每個樣品進(jìn)行重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用 2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。用基因表達(dá)量作為目的基因表達(dá)量的校對基準(zhǔn)。運(yùn)用SPSS 18.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），并用Duncan’s多重比較對均值進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 PmTRACP基因的克隆與特征分析

用RACE技術(shù)克隆的基因cDNA全長為2 034 bp，開放閱讀框972 bp，編碼323個氨基酸，5′ UTR長度為27 bp，3′ UTR長度為1 035 bp。預(yù)測蛋白分子質(zhì)量為36.39 ku，理論等電點(diǎn)為5.97，分析發(fā)現(xiàn)，含有一由21個氨基酸組成的信號肽序列，該基因含有一個鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶樣磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域（圖1）。

2.2 PmTRACP的同源性比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析

多序列比對分析發(fā)現(xiàn)，PmTRACP與其他物種TRACP的同源性較低，為47% ~ 65%，但D32、D70、Y73、N108、H203、H212、H237、H239等8個氨基酸活性位點(diǎn)在不同物種的TRACP中高度保守，同時N114糖基化位點(diǎn)在各物種間亦極為保守（圖 2）。構(gòu)建的PmTRACP與其他物種TRACP系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖 3）表明，PmTRACP與哺乳類和魚類的TRACP相距較遠(yuǎn)，與雙殼貝類的TRACP聚為一支，且與長牡蠣的TRACP親緣關(guān)系最近。

經(jīng)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)PmTRACP與數(shù)據(jù)庫中人的TRACP（SMTL ID: 1war.1）相似度最高，為40%，以其為模型獲得PmTRACP的三維結(jié)構(gòu)見圖4。此外，對太平洋牡蠣（）的TRACP進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，并與之相比較，發(fā)現(xiàn)PmTRACP與太平洋牡蠣TRACP結(jié)構(gòu)高度相似，空間結(jié)構(gòu)的高度保守性暗示各物種該蛋白分子功能相似。

粗體表示翻譯起始和終止密碼子; 星號表示終止密碼; 下劃線表示推測的信號肽序列; 陰影部分表示鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶樣磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域; 方框表示推測的多聚腺苷酸化信號

*標(biāo)記的氨基酸為活性位點(diǎn); #標(biāo)記的氨基酸為N糖基化位點(diǎn); 百分比值代表PmTRACP和其他物種TRACP之間的序列同一性

圖3 鄰接法構(gòu)建的TRACP家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 馬氏珠母貝(A)、太平洋長牡蠣(B)及組合后(C) TRACP蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)

2.3 PmTRACP在不同組織中的表達(dá)分布

圖5可見，基因在馬氏珠母貝的外套膜中央?yún)^(qū)、外套膜邊緣區(qū)、閉殼肌、足、性腺、珍珠囊、肝胰腺和鰓中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在明顯差異，肝胰腺中的表達(dá)量最高，其次是珍珠囊和性腺。

MC, 外套膜中央?yún)^(qū); ME, 外套膜邊緣區(qū); A, 閉殼肌; F, 足; GO, 性腺; PS, 珍珠囊; HE, 肝胰腺; GI, 鰓; *, P < 0.05

3 討論

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)是酸性磷酸酶家族中的金屬蛋白酶，在骨骼的形成和骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本研究克隆得全長序列。分析發(fā)現(xiàn)，其N端含有一個由21氨基酸組成的信號肽。人類中，TRACP含有一個信號肽，成熟肽于血液中分泌并發(fā)揮重要作用[11-12]，因此PmTRACP可能亦于血液中分泌并發(fā)揮功能。另外，PmTRACP氨基酸序列在第25 ~ 240氨基酸處含有一個鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶樣磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域存在于各種磷酸酯酶中，且含有較多保守的金屬螯合殘基[13]。經(jīng)比對，PmTRACP與其同物種TRACP的同源性為48% ~ 65%，但各物種TRACP在關(guān)鍵的8個氨基酸活性位點(diǎn)（D32、D70、Y73、N108、H203、H212、H237、H239）[14]和N114糖基化位點(diǎn)上高度保守，提示其催化功能的保守性。PmTRACP與長牡蠣的TRACP親緣關(guān)系最近，且三級結(jié)構(gòu)高度相似。以上結(jié)果進(jìn)一步證明，PmTRACP屬于TRACP家族的一員，且功能有保守性。

目前，關(guān)于的組織分布相關(guān)研究主要集中在哺乳動物中[1, 15-16]，而在低等動物，尤其是雙殼貝類研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，在馬氏珠母貝的外套膜中央?yún)^(qū)、外套膜邊緣區(qū)、閉殼肌、足、性腺、珍珠囊、肝胰腺和鰓中均有表達(dá)，但在肝胰腺和珍珠囊中的表達(dá)量顯著性高于其他組織。肝胰腺為軟體動物主要的免疫器官，也是消化、吸收和代謝最旺盛的器官，在肝胰腺中的表達(dá)量最高，提示該基因可能參與馬氏珠母貝的免疫反應(yīng)。Wang等[3]檢測馬氏珠母貝TRACP家族的另一成員pm-PAP，發(fā)現(xiàn)基因也在肝胰腺、鰓和血細(xì)胞等免疫防御組織中表達(dá)。在脊椎動物中，PAP也參與機(jī)體的免疫反應(yīng)[17]。此外，也可能該酶在該器官合成后運(yùn)輸?shù)狡渌课粎⑴c生命活動。在人體中，TRACP可參與骨骼形成和調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)，同時也是骨吸收和破骨細(xì)胞活性的良好標(biāo)志物[18]，珍珠的形成過程與骨的形成過程均為典型的生物礦化過程[19]。而珍珠囊是珍珠形成的組織，在馬氏珠母貝珍珠囊中有較高的表達(dá)量，暗示該基因可能參與珍珠形成過程。而是否通過負(fù)調(diào)控機(jī)制參與馬氏珠母貝珍珠的形成尚需進(jìn)一步研究。以上結(jié)果可為進(jìn)一步研究馬氏珠母貝抗酒石酸酸性磷酸酶的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

[1] HALLEEN J M, ALATALO S L, SUOMINEN H, et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption[J]. J Bone Miner Res, 2010, 15(7): 1337-1345.

[2] OHASHI T, MIURA T, IGARASHI Y, et al. Monoclonal antibody specific to tartrate-resistant acid phosphatase 5b and use thereof: USPatent 7,074,903[P]. 2006-07-11.

[3] WANG Q H, JIAO Y, DU X D, et al. Molecular characterization and expression analysis of purple acid phosphatase gene from pearl oyster[J]. Genetics and Molecular Research: GMR, 2015, 14(1): 552-562.

[4] FLANAGAN J U, CASSADY A I, SCHENK G, et al. Identification and molecular modeling of a novel, plant-like, human purple acid phosphatase[J]. Gene, 2006, 377: 12-20.

[5] Halleen J M, R?is?nen S R, Alatalo S L, et al. Potential function for the ROS-generating activity of TRACP[J]. Bone Miner Res, 2010, 18(10): 1908-1911.

[6] MORI Y, KASAI H, OSE A, et al. Modeling and simulation of bone mineral density in Japanese osteoporosis patients treated with zoledronic acid using tartrate-resistant acid phosphatase 5b, a bone resorption marker[J]. Osteoporosis International, 2018, 29(5): 1155-1163.

[7] 張新菊, 李融. 骨代謝標(biāo)志物相關(guān)研究進(jìn)展[J]. 山東醫(yī)藥, 2014, 54(16): 93-95.

[8] 黃干, 伍賢平. 抗酒石酸酸性磷酸酶與骨吸收[J]. 臨床與病理雜志, 1998, 18(1): 4-6.

[9] MARXEN J C, WITTEN P E, FINKE D, et al. A light- and electron-microscopic study of enzymes in the embryonic shell-forming tissue of the freshwater snail,[J]. Invertebrate Biology, 2003,

122(4): 313-25.

[10] 王志新, 梁海鷹, 杜曉東, 等. 馬氏珠母貝熱休克蛋白基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 33(6): 14-23.

[11] 虞佳音, 汪靜宇. 抗酒石酸酸性磷酸酶在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展[J]. 世界華人消化雜志, 2017, 25(23): 2133-2138.

[12] REITHMEIER A, PANIZZA E, KRUMPEL M, et al. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP/ACP5) promotes metastasis-related properties via TGFβ2/TβR and CD44 in MDA-MB-231 breast cancer cells[J]. BMC Cancer, 2017, 17(1): 650.

[13] ARAVIND L, KOONIN E V. Phosphoesterase domains associated with DNA polymerases of diverse origins[J]. Nucleic Acids Res, 1998, 26(16): 3746-52.

[14] MARCHLERBAUER A, BO Y, HAN L, et al. CDD/SPARCLE: functional classification of proteins via subfamily domain architectures[J]. Nucleic Acids Res, 2017, 45(Database issue): D200-D203.

[15] HALLEEN J M, ALATALO S L, JANCKILA A J, et al. Serum tartrate-resistant acid phosphatase 5b is a specific and sensitive marker of bone resorption[J]. Clin Chem, 2001, 47(3): 597-600.

[16] CHAO T Y, YU J C, KU C H, et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b is a useful serum marker for extensive bone metastasis in breast cancer patients[J]. Clin Cancer Res, 2005, 11(2): 544-550.

[17] KUMANOMIDOU T, NISHIO K, TAKAGI K, et al. The structural differences between a glycoprotein specific F-box protein Fbs1 and its homologous protein FBG3[J]. PLoS one, 2015, 10(10): e0140366.

[18] HANNON R A, CLOWES J A, EAGLETON A C, et al. Clinical performance of immunoreactive tartrate-resi- stant acid phosphatase isoform 5b as a marker of bone resorption[J]. Bone, 2004, 34(1): 187-94.

[19] WESTBROEK P, MARIN F. A marriage of bone and nacre[J]. Nature, 1998, 392(6679): 861.

Cloning and Tissue Expression Analysis ofGene in

ZHENG Zhe1, WU Xuan-jin1, JIAO Yu1, HUANG Rong-lian1, DU Xiao-dong1,2

(1.,,524088,; 2.,524088,)

【】 To clone the full length of tartrate resistant acid phosphatase (TRACP) gene in the pearl oysterand analyze the expression profile ofat different tissues. 【】Thegene in pearl oyster(designated as) was obtained by RACE, and quantitative real-time PCR was used to detecte the expression level ofin different tissues including the mantle, adduct muscle, foot, gonad, pearl sac, hepatopancreas and gill.【】The length ofis 2 034 bp, with an open reading frame of 972 bp that encodes 323 amino acids, 5′ untranslated region (UTR) was 27 bp, and 3′ UTR is 1 035 bp. The predicted molecular weight of PmTRACP was 36.39 ku and the theoretical isoelectric point was 5.97. PmTRACP contains a calcineurin-like phosphatase domain. Multiple sequence alignment showed that the TRACP homology betweenand other species ranged from 48% to 65%, with the highest homologyto. The 8 amino acid active sites (D32, D70, Y73, N108, H203, H212, H237, H239) and the N-glycosylation site (N114) are highly conserved in different species of TRACP. Phylogenetic analysis showed that PmTRACP was mostly close to TRACP of. Quantitative real-time PCR analysis showed thatmRNA was constitutively expressed in different tissues, with significantly high expression in the hepatopancreas and pearl sac.

; tartrate resistant acid phosphatase; quantitative real-time PCR

Q78; Q959.215+43

A

1673-9159（2019）03-0024-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.03.004

2018-11-02

國家自然科學(xué)基金(31672626)

鄭哲（1988－）女，博士，講師，研究方向?yàn)楹Ｑ笊飳W(xué)。Email：haidazhengzhe@163.com

杜曉東，男，博士，教授。Email：zjduxd@126.com

鄭哲，吳宣瑾，焦鈺，等. 馬氏珠母貝基因的克隆及組織表達(dá)[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 39(3): 24-29.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）