林明德，陳 剛，馬 騫，王忠良，張健東，謝瑞濤,2，湯保貴，黃建盛，周 暉，施 鋼，潘傳豪，ERIC Amenyogbe，鄧文鑫,3

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雜交石斑魚和母本褐點(diǎn)石斑魚轉(zhuǎn)錄組測序及差異表達(dá)基因分析

林明德1，陳 剛1，馬 騫1，王忠良1，張健東1，謝瑞濤1,2，湯保貴1，黃建盛1，周 暉1，施 鋼1，潘傳豪1，ERIC Amenyogbe1，鄧文鑫1,3

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 廣東恒興飼料實(shí)業(yè)股份有限公司 / 3. 廣東粵海飼料集團(tuán)公司，廣東 湛江 524000）

【】篩選褐點(diǎn)石斑魚（）及其雜交子一代（♀×♂，F(xiàn)1）的差異表達(dá)基因，探討褐點(diǎn)石斑魚及F1代之間的生長差異性?！尽坎捎肐llumina HiSeq 2000測序平臺(tái)對(duì)同齡的褐點(diǎn)石斑魚及其雜交F1的腦、肝臟和肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，通過edgeR軟件包篩選差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO（Gene Ontology）功能注釋和KOG注釋，最后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。【】測序的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制和組裝共得到54 610條unigenes。組裝的unigenes共有28 832條unigenes得到注釋，共獲得20 234條差異表達(dá)基因，其中有10 218條上調(diào)，10 016條下調(diào)。GO功能注釋顯示共34 061條unigenes聚類到涉及生物過程、分子功能和細(xì)胞組分的53個(gè)功能類別，其中被較多基因聚類到的功能類別為細(xì)胞過程、結(jié)合、單一生物過程、代謝過程和催化活性等。KOG注釋發(fā)現(xiàn)，42 753 unigenes被注釋到25個(gè)功能類別中，其中較多涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、基因功能預(yù)測、翻譯后修飾，蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和分子伴侶、轉(zhuǎn)錄等。進(jìn)一步篩選到一批和生長相關(guān)的差異表達(dá)基因，如、、、、等，這些差異表達(dá)基因在F1中的表達(dá)水平均高于其親本褐點(diǎn)石斑魚，與雜交F1相較于褐點(diǎn)石斑魚生長快速的性狀相符?！尽垦芯客瓿闪藢?duì)褐點(diǎn)石斑魚及其雜交F1的轉(zhuǎn)錄組測序、組裝，獲得了測序數(shù)據(jù)在不同數(shù)據(jù)庫的功能注釋信息，同時(shí)篩選了一批生長相關(guān)差異表達(dá)基因，這些基因在F1中的表達(dá)水平均高于其親本褐點(diǎn)石斑魚，與現(xiàn)實(shí)生長性狀相符。

褐點(diǎn)石斑魚；雜交石斑魚；轉(zhuǎn)錄組測序；比較分析；生長相關(guān)基因

石斑魚隸屬于鱸形目（Perciformes），鮨科（Serranidae），石斑魚屬（），是我國沿海地區(qū)重要的養(yǎng)殖品種，該魚營養(yǎng)價(jià)值高，味道鮮美[1]。然而，近些年來，石斑魚的種質(zhì)資源退化，養(yǎng)殖病害頻發(fā)，極大地限制了石斑魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[2]。目前，在石斑魚育種中，應(yīng)用雜交技術(shù)培育得一些優(yōu)良的雜交品種。James等[3]研究表明褐點(diǎn)石斑魚（♀）×清水石斑魚（♂）雜交子一代（下稱F1）即表現(xiàn)出了比其母本褐點(diǎn)石斑魚更快速的生長特性。然而，對(duì)于這種生長差異性的機(jī)制尚未明確。高通量轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-sequencing，RNA-seq）技術(shù)的發(fā)展，為探究這種生長差異性的分子機(jī)制提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具[4]。

近幾年在水生生物魚類中已經(jīng)開展較多的比較轉(zhuǎn)錄組研究，Sun等[5]通過比較轉(zhuǎn)錄組分析了雜交石斑魚（♀?×♂）較之母本褐點(diǎn)石斑魚和父本鞍帶石斑魚（）生長快速的分子機(jī)制。Wang等[6]通過鞍帶石斑魚注射溶藻弧菌和注射TSB的轉(zhuǎn)錄組差異的轉(zhuǎn)錄組測序研究了鞍帶石斑魚的免疫應(yīng)答機(jī)制。Liu等[7]通過轉(zhuǎn)錄組研究了鞍帶石斑魚感染巨型細(xì)胞病毒和石斑魚虹彩病毒之間基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)的相似性和差異性。Gao等[8]研究了云紋石斑魚（）低鹽脅迫下的肝臟中全局基因表達(dá)的變化。Kelli等[9]使用轉(zhuǎn)錄組分析了點(diǎn)帶石斑魚（）變態(tài)發(fā)育前中后的消化過程，發(fā)現(xiàn)了一大批攝食和消化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本。Fan等[10]研究赤點(diǎn)石斑魚（）未成熟和成熟雄性和雌性成體中兩種組織的轉(zhuǎn)錄組，探索雄性和雌性香港石斑魚之間的下丘腦和垂體的基因表達(dá)模式。上述石斑魚的轉(zhuǎn)錄組研究，極大地豐富了石斑魚的遺傳資源，但目前針對(duì)兩種石斑魚比較轉(zhuǎn)錄組分析的研究報(bào)道較為鮮見。本研究采用Illumina HiSeq 2 000測序平臺(tái)對(duì)雜交石斑魚和褐點(diǎn)石斑魚的腦、肝臟和肌肉組織的混合樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選與生長相關(guān)的差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和分析，探討母本褐點(diǎn)石斑魚及其F1的生長差異性的分子基礎(chǔ)，以期為石斑魚的雜交育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

F1的母本褐點(diǎn)石斑魚（5齡）為廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院魚類種子工程與養(yǎng)殖團(tuán)隊(duì)繁育的第3代群體，父本清水石斑魚（5齡）從海南省俊泓實(shí)業(yè)有限公司購進(jìn)，于2016年6月在東海島基地進(jìn)行同批次繁育，繁育的育苗先后在露天的水泥池培養(yǎng)40 d，之后轉(zhuǎn)移到室內(nèi)水泥池培養(yǎng)5個(gè)月，每天投喂3次并清理殘餌糞便，更換天然海水。養(yǎng)殖水體pH為8.0~8.2，鹽度為25~28，溶氧＞5 mg/L，光照為自然光。

采樣前24 h停止投喂，雜交石斑魚和褐點(diǎn)石斑魚分別取8尾測量體質(zhì)量、體長（全長）并記錄，F(xiàn)1平均體長（22.7 ± 1.23）cm，平均體質(zhì)量（233.7 ± 8.96）g，褐點(diǎn)石斑魚平均體長（18.2 ± 0.45）cm，平均體質(zhì)量（181.7 ± 4.5）g。使用丁香酚麻醉后解剖，取F1和褐點(diǎn)石斑魚的腦、肝臟和肌肉組織，放入加有1 mL RNA保護(hù)液（SIGMA，Germany）的離心管中，于4℃冰箱冷藏24 h后，轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱長期保存。

1.2 組織總RNA的抽提和測序文庫構(gòu)建

從超低溫冰箱中分別取出褐點(diǎn)石斑魚及其雜交F1的腦、肝臟和肌肉組織各8個(gè)，使用MagZol Reagent（廣州美基生物科技有限公司）試劑盒進(jìn)行抽提?？俁NA的濃度通過Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀（Thermo Scientific, USA）進(jìn)行測量，RNA完整性則通過Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies, CA，USA）進(jìn)行檢測，RNA分子完整數(shù)（RNA integrity number，RIN）在7~10為合格。檢測合格的樣品保存在-80℃超低溫冰箱備用。

質(zhì)量檢測合格的RNA樣品將用于cDNA測序文庫的構(gòu)建，褐點(diǎn)石斑魚肌肉（HM）、肝臟（HL）、腦（HB），以及雜交F1代肌肉（SM）、肝臟（SL）、腦（SB）樣品組分別各由8例合格樣品混合建庫。文庫的構(gòu)建按照TruSeq DNA Library Prep Kit（Illumina，USA）的說明書進(jìn)行。用帶有Oligo（dT）的磁珠分離出真核生物的mRNA。添加破碎緩沖液fragmentation buffer將mRNA打斷成短的片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I 合成第二條cDNA鏈。在經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加poly（A）并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。建好的測序文庫在Illumina HiSeq 2000平臺(tái)進(jìn)行測序。測序工作委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序、數(shù)據(jù)質(zhì)量控制和組裝

測序得到的原始數(shù)據(jù)為raw reads，經(jīng)過初步過濾后為clean reads，進(jìn)一步去除含接頭（adaptor）、N的比例大于10%以及低質(zhì)量的（質(zhì)量值≤20的堿基數(shù)占整個(gè)read的40％以上）reads，最終得到高質(zhì)量的干凈讀長（clean reads）。使用短reads組裝軟件Trinity-v2.7.0做轉(zhuǎn)錄組從頭組裝[11-12]。組裝得到的序列稱為unigene。

1.4 基因功能注釋

組裝得到的unigenes通過blast程序（e-value≤10-5）注釋到SwissProt，NCBI non-redundant protein（Nr），KEGG 和KOG數(shù)據(jù)庫。利用Blast2GO v2.5將通過Nr數(shù)據(jù)庫注釋的unigenes進(jìn)行Gene Ontology（GO）注釋[13-14]。

1.5 基因表達(dá)量統(tǒng)計(jì)和差異表達(dá)分析

unigenes表達(dá)量的計(jì)算使用 RPKM 法（Reads Per kb per Million mapped reads）進(jìn)行[15]，樣品間差異統(tǒng)計(jì)使用FDR 與 log2Fold Change（log2FC）來篩選，篩選條件為false discovery rate（FDR）<0.05 且|log2FC|>1。

1.6 差異表達(dá)基因的富集分析

得到差異表達(dá)基因之后，對(duì)差異表達(dá)基因做GO功能分析和KEGG通路分析。GO富集分析通過topGO R數(shù)據(jù)包基于Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)進(jìn)行，KEGG通路分析通過KOBAS version 2.0完成[16]。以-value≤0.05為閾值，滿足此條件的GO term和Pathway定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO term和Pathway。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性，隨機(jī)選取12個(gè)表達(dá)量較高的差異表基因，設(shè)計(jì)引物，以β-肌動(dòng)蛋白（beta-actin）作為內(nèi)參，對(duì)褐點(diǎn)石斑魚及其雜交F1進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。提取褐點(diǎn)石斑魚及其雜交F1的腦、肝臟和肌肉組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板進(jìn)行熒光定量PCR，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)具體操作按照全式金TransStart?Tip Green qPCR SuperMix說明書（北京全式金生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行，采用三步法在LightCycler96熒光定量PCR儀進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品檢測3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 20.0進(jìn)行分析，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，并將相對(duì)表達(dá)量和轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果和分析

2.1 RNA抽提、轉(zhuǎn)錄組測序和組裝

F1和褐點(diǎn)石斑魚各組織的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制如表1所示。用于轉(zhuǎn)錄組測序的RNA數(shù)量和質(zhì)量檢測，各組織的RIN值均符合標(biāo)準(zhǔn)，說明RNA的完整性較好，滿足建庫測序的要求。通過過濾分別得到7 581 722 449，6 330 804 586，8 175 941 387，6 343 265 141，6 229 084 451，7 197 785 696 bp的clean reads。這些干凈讀長的20和30分別在96%和89.88%以上，GC含量在40%~60%之間，說明石斑魚轉(zhuǎn)錄組測序的質(zhì)量較好。

表1 測序數(shù)據(jù)控制

注：20指質(zhì)量值大于或等于20 的堿基所占的百分比；30指質(zhì)量值大于或等于30 的堿基所占的百分比；GC 含量為測序數(shù)據(jù)中G 和C 兩種堿基所占總堿基的百分比

Note：20refers to the percentage of bases with a mass value greater than or equal to 20;30refers to the percentage of bases with a mass value greater than or equal to 30; GC content is the percentage of the total base of the bases of G and C in the sequencing data.

使用短reads組裝軟件Trinity-v2.8.4做de novo組裝后，共得到54 610條unigenes，GC含量為46.666 5%，N50為2 718，平均長度為1 357，總數(shù)據(jù)量達(dá)到74 119 587 bp。

2.2 功能注釋

通過blast程序（值≤10-5）對(duì)組裝得到的54 610條ungenes進(jìn)行Nr、Swissprot、KOG和KEGG四大數(shù)據(jù)庫功能注釋，共有28 832條unigenes注釋到Nr（99.90%），Swissprot（81.50%），KOG（65.46%）和KEGG（59.11%）數(shù)據(jù)庫。

從圖1可知，使用blast對(duì)組裝得到的54 610條ungenes進(jìn)行功能注釋，共有28 832條unigenes注釋到Nr（99.90%），Swissprot（81.50%），KOG（65.46%）和KEGG（59.11%）數(shù)據(jù)庫。將54 610條unigenes進(jìn)行GO分析，共有34 061條unigenes在生物過程、細(xì)胞組分和分子功能的3個(gè)大類別的53個(gè)功能分支中得到注釋。在生物過程方面，較多的unigenes聚類到細(xì)胞過程（cellular process）、單一生物過程（single-organism process）、代謝過程（metabolic process）和生物調(diào)控（biological regulation）等。對(duì)于細(xì)胞組分，細(xì)胞（cell），細(xì)胞分（cell part）、生物膜（membrane）、生物膜部分（membrane part）和細(xì)胞器（organelle）等聚類的unigenes較多。在分子功能方面，結(jié)合（binding）和催化活性（catalytic activity）是聚類較多unigenes的功能類別。

將得到的unigenes進(jìn)行KEGG分析，共有7 452條差異表達(dá)基因得到功能注釋，被分配到217個(gè)代謝通路中。涉及基因數(shù)量較多的通路是神經(jīng)活性配體-受體相互作用、內(nèi)吞作用、MAPK信號(hào)通路、粘著斑、鈣信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控等（表2）。

2.3 差異表達(dá)基因的篩選

根據(jù)FDR < 0.05且|log2FC|>1的標(biāo)準(zhǔn)，在褐點(diǎn)石斑魚和雜交F1的各組織篩選到的差異表達(dá)基因結(jié)果如圖2所示。相較于褐點(diǎn)石斑魚，雜交F1腦組織（HB vs SB）共有6 437條差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因3 250條、下調(diào)基因3 187條。肝臟組織（HL vs SL）共有7 380條差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因4 018條、下調(diào)基因3 362條。肌肉組織（HM vs SM）共有6 417條差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因2 950條、下調(diào)基因3 467條。

圖1 GO功能分類

表2 雜交子一代和褐點(diǎn)石斑魚的KEGG通路分析（前20）

圖2 褐點(diǎn)石斑魚和雜交F1之間差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)

2.4 差異表達(dá)基因的功能富集分析

將褐點(diǎn)石斑魚和雜交F1的腦、肝臟和肌肉組織的差異表達(dá)基因比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫中，結(jié)果如圖3所示，共有7 452條差異表達(dá)基因比對(duì)到217條通路中。Rich Factor 指差異表達(dá)的基因中位于該 pathway 條目的基因數(shù)目與所有基因中位于該 pathway 條目的基因總數(shù)的比值，Rich Factor越大，表示富集的程度越高。-Value是多重假設(shè)檢驗(yàn)校正之后的-value，取值范圍為0到1，越接近于零，表示富集越顯著。圖3是選取-Value從小到大排序前 20 的pathway來作圖的。其中，腦組織有19條顯著富集通路（＜0.05），包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、細(xì)胞粘附分子、視黃醇代謝和細(xì)胞周期和IgA生成的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)；肝臟組織有42條顯著富集通路，包括通過細(xì)胞色素P450的異生素代謝、視黃醇代謝、亞油酸代謝、甘油酯代謝、脂肪酸降解等；肌肉中有25條顯著富集通路，前5條顯著富集通路為核糖體發(fā)生、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA聚合酶、DNA復(fù)制和嘧啶代謝信號(hào)通路（＜0.05）

1）：HB vs SB；2）：HL vs SL；3）：HM vs SM

圖3 通路富集分析

Fig. 3 pathway enrichment analysis

2.5 生長相關(guān)的差異表達(dá)基因分析

對(duì)褐點(diǎn)石斑魚和雜交F1之間的差異表達(dá)基因進(jìn)一步的分析結(jié)果如表3所示，雜交F1腦組織中的生長相關(guān)基因如生長激素（growth hormone，）、生長激素釋放激素前體（growth hormone-releasing hormone precursor，）、促乳素（Prolactin，）、生長催乳素前體（somatolactin precursor，）、精氨酸催產(chǎn)素（arginine vasotocin precursor，）、磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶1β型（phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase type-1 beta，）與褐點(diǎn)石斑魚相比顯著上調(diào)（＜0.05）。同樣，在肝臟組織中，蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基3C（protein phosphatase 1 regulatory subunit 3C，）、肝型脂肪酸結(jié)合蛋白（liver-type fatty acid-binding protein，）、淀粉結(jié)合域蛋白1（starch-binding domain-containing protein 1，）、Mid1-互作蛋白1（Mid1-interacting （paired box protein Pax-3，）、肌酸激酶亞型（creatine kinase S-type，）、類心肌素（Myocardin-like）和生肌決定因子（）等基因表達(dá)上調(diào)。

表3 生長相關(guān)的差異表達(dá)基因

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證

實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果（Real time-PCR）和轉(zhuǎn)錄組測序的差異表達(dá)倍數(shù)結(jié)果（RNA-Seq）如圖4所示。總體來看，在腦、肝臟和肌肉組織中12個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果均是上調(diào)表達(dá)，Real time-PCR的結(jié)果也表現(xiàn)出上調(diào)趨勢，兩種分析的方法得出的結(jié)果趨勢一致，說明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。

圖4 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的差異倍數(shù)比較

3 討論

近年來，關(guān)于虎龍斑[5]、鞍帶石斑魚[6-7]、云紋石斑魚[8]、點(diǎn)帶石斑魚[9]、赤點(diǎn)石斑魚[10]、褐點(diǎn)石斑魚[17]、黑帶石斑魚（）[18]等不同種類石斑魚的轉(zhuǎn)錄組研究已有報(bào)道。目前的研究報(bào)道主要是針對(duì)同一物種進(jìn)行研究，而基于不同石斑魚的轉(zhuǎn)錄組比較研究少有報(bào)道。為了揭示褐點(diǎn)石斑魚及其雜交F1生長差異的分子機(jī)制，本研究采用Illumina HiSeq 2000平臺(tái)對(duì)褐點(diǎn)石斑魚及其雜交F1的不同組織進(jìn)行測序，完成了對(duì)褐點(diǎn)石斑魚及其雜交F1的轉(zhuǎn)錄組測序、組裝，獲得了測序數(shù)據(jù)在不同數(shù)據(jù)庫的功能注釋信息，同時(shí)篩選了一批生長相關(guān)差異表達(dá)基因。

本研究共組裝得到54 610條unigenes，GC含量為46.666 5%，平均長度為1 357 bp，N50含量為2 718 bp，說明組裝得到的序列完整性較好，確保了轉(zhuǎn)錄組測序的準(zhǔn)確性。將unigenes與Nr、Swissprot、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，有28 832（52.796 2%）條uniegenes得到注釋，25 778條unigenes未得到注釋，這可能是因?yàn)閿?shù)據(jù)庫相關(guān)魚類的基因信息較少，石斑魚的基因組信息尚未公布，或者未得到注釋的unigenes可能是新的基因或者非編碼序列[19]。

GO注釋有助于了解石斑魚的基因及其基因產(chǎn)物的功能。褐點(diǎn)石斑魚和雜交F1在GO基因功能分類體系中共有34 061條unigenes得到功能注釋，分屬于生物過程，細(xì)胞元件和分子功能3個(gè)類別及53個(gè)二級(jí)功能類別。其中，參與細(xì)胞過程、結(jié)合、單一生物過程、代謝過程、催化過程和生物調(diào)節(jié)等功能類別的基因較多。KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn)神經(jīng)活性配體-受體相互作用、內(nèi)吞作用、MAPK信號(hào)通路、粘著斑、鈣信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控等有較多差異表達(dá)基因參與的信號(hào)通路。MAPK信號(hào)通路與生長基因密切相關(guān)，具有重要的研究價(jià)值。

本研究在腦組織中篩選到、生長激素釋放激素（）、、、等生長相關(guān)的差異表達(dá)基因。GH/IGF-I軸是調(diào)節(jié)魚類生長的重要內(nèi)分泌軸[20]，、是參與該內(nèi)分泌軸的重要基因。是一種重要的神經(jīng)內(nèi)分泌因子，可以刺激腦垂體前葉釋放[21]，可以和肝細(xì)胞中的生長激素受體（Growth hormone receptor，）結(jié)合，發(fā)揮生長調(diào)控作用。由于和對(duì)魚體進(jìn)行正向調(diào)控作用，本研究中和在F1中表達(dá)水平均高于其親本褐點(diǎn)石斑魚，與雜交F1相較于褐點(diǎn)石斑魚生長快速的性狀相符。具有調(diào)節(jié)機(jī)體生長和滲透壓的作用[22]，魚類生長催乳素（）是由魚類腦垂體分泌的生長激素/催乳素家族的成員[23]，推斷與具有相似的作用。（Arginine vasotocin）是非哺乳類脊椎動(dòng)物在下丘腦合成的神經(jīng)垂體激素，調(diào)節(jié)魚類的代謝、繁殖和滲透壓等多種生理活動(dòng)[24]。本研究中合成的前體在雜交F1中表達(dá)，推測該基因可能在其快速生長中起著重要作用。此外，F(xiàn)1代的肝臟組織中、、和等蛋白質(zhì)和糖類代謝相關(guān)的基因都較褐點(diǎn)石斑魚上調(diào)。參與蛋白質(zhì)合成和糖原代謝等活動(dòng)[25]，在斑馬魚中的研究表明和肝臟的發(fā)育相關(guān)[26]，而則跟機(jī)體糖原的儲(chǔ)備相關(guān)[27]，有關(guān)馬蘇大麻哈魚的研究中被證明是激活乙酰輔酶A羧化酶的重要因子[28]。、、Myocardin-like和均是肌肉發(fā)育的相關(guān)調(diào)節(jié)基因，其中，被發(fā)現(xiàn)和T-box基因家族的T-box Protein Tbx18基因協(xié)同調(diào)節(jié)中胚層的發(fā)育[29]，與骨骼肌分化相關(guān)[30]，Myocardin-like 是促進(jìn)肌原性分化和細(xì)胞骨架組織的轉(zhuǎn)錄因子[31]，是骨骼肌發(fā)育所必須的調(diào)節(jié)因子[32]。這些肌肉發(fā)育相關(guān)的調(diào)節(jié)基因或轉(zhuǎn)錄因子在雜交F1中上調(diào)，可能參與調(diào)節(jié)了F1的快速生長。

[1] ARAI T. Diversity and conservation of coral reef fishes in the malaysian south china sea[J]. Reviews in Fish Biology & Fisheries, 2015, 25(1): 85-101.

[2] 羅鳴, 陳傅曉, 劉龍龍, 等. 我國石斑魚養(yǎng)殖疾病的研究進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2013, 32(9): 549-554.

[3] JAMES C M, AL-THOBARTI S A, RASEM B M, et al. Potential of grouper hybrid (×) for aquaculture[J]. ICLARM [International Center for Living Aquatic Resources Management] Quarterly, 1999, 22: 19-23.

[4] SAROGLIA M, LIU Z. Functional genomics in aquaculture[M]. Iowa: John Wiley & Sons, 2012.

[5] SUN Y, GUO C Y, WANG D D, et al. Transcriptome analysis reveals the molecular mechanisms underlying growth superiority in a novel grouper hybrid (♀×♂)[J]. BMC Genetics, 2016, 17(1): 24.

[6] WANG Y D, WANG Y H, HUI C F, et al. Transcriptome analysis of the effect of Vibrio alginolyticus infection on the innate immunity-related TLR5-mediated induction of cytokines in[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2016, 52: 31-43.

[7] LIU C C, HO L P, YANG C H, et al. Comparison of grouper infection with two different iridoviruses using transcriptome sequencing and multiple reference species selection[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2017, 71: 264-274.

[8] GAO Q, YUE Y, MIN M, et al. Time-series transcriptomic analysis of the kelp grouperin response to low salinity stress[J]. Animal cells and systems, 2018, 22(4): 234-242.

[9] ANDERSON K, KUO C Y, LU M W, et al. A transcriptomic investigation of digestive processes in orange-spotted grouper,, before, during, and after metamorphic development[J]. Gene, 2018, 661: 95-108.

[10] QIU F, QU M, ZHANG X, et al. Hypothalamus and pituitary transcriptome profiling of male and female Hong Kong grouper()[J]. Gene, 2018, 656: 73-79.

[11] GRABHERR M G, HAAS B J, YASSOUR M, et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome[J]. Nature Biotechnology, 2011, 29(7): 644- 652.

[12] HAAS B J, PAPANICOLAOU A, YASSOUR M, et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-Seq: reference generation and analysis with trinity[J]. Nature Protocols, 2013, 8(8): 1494-1512.

[13] CONESA A, G?TZ S, GARCíA GóMEZ J M, et al. Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research[J]. Bioinformatics, 2005, 21(18): 3674-3676.

[14] ISELI C, JONGENEEL C V, BUCHER P. ESTS can: A program for detecting, evaluating, and reconstructing potential coding regions in EST sequences[J]. Proceedings/. International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology; ISMB. International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, 1999, 99: 138-148.

[15] MORTAZAVI A, WILLIAMS B A, MCCUE K, et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq[J]. Nature Methods, 2008, 5(7): 621-628.

[16] Xie C, Mao X, Huang J, et al. KOBAS 2.0: a web server for annotation and identification of enriched pathways and diseases[J]. Nucleic acids research, 2011, 39(suppl_2): W316-W322.

[17] CAI Y, WANG S, GUO W, et al. Transcriptome analysis provides insights into the immune responsive pathways and genes in the head kidney of tiger grouper () fed with Spatholobus suberectus, Phellodendron amurense, or Eclipta prostrata[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2018, 73: 100-111.

[18] LU M W, NGOU F H, CHAO Y M, et al. Transcriptome characterization and gene expression ofspp in endoplasmic reticulum stress-related pathway during betanodavirus infection in vitro[J]. Bmc Genomics, 2012, 13(1): 651.

[19] HOU R, BAO Z, WANG S, et al. Transcriptome sequencing and de novo analysis for yesso scallop () using 454 GS FLX[J]. Plos One, 2011, 6(6): e21560.

[20] 汝少國, 鄭艷. 外源化學(xué)物質(zhì)對(duì)魚類生長和GH/IGF-I軸的影響[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2012(S1): 102-106.

[21] NAM B H, MOON J Y, KIM Y O, et al. Molecular and functional analyses of growth hormone-releasing hormone () from olive flounder ()[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part B Biochemistry & Molecular Biology, 2011, 159(2): 84-91.

[22] 劉金亮, 梁利群. 魚類催乳素及其在滲透壓調(diào)節(jié)中的作用[J]. 水產(chǎn)學(xué)雜志, 2011, 24(1): 50-54.

[23] RAND-WEAVER M, NOSO T, MURAMOTO K, et al. Isolation and characterization of somatolactin, a new protein related to growth hormone and prolactin from Atlantic cod () pituitary glands[J]. Biochemistry, 1991, 30(6): 1509-1515.

[24] LEE S, LIM B, LEE J, et al. Up-regulation of the arginine vasotocin precursor gene from: isolation and expression upon acute pathogen invasion [J]. Genes & Genomics, 2014, 36(4): 443-453.

[25] LEE S K, MOON J W, LEE Y W, et al. The effect of high glucose levels on the hypermethylation of protein phosphatase 1 regulatory subunit 3C () gene in colorectal cancer[J]. Journal of Genetics, 2015, 94(1): 75-85.

[26] HER G M, CHIANG C C, CHEN W Y, et al. In vivo studies of liver-type fatty acid binding protein (L-FABP) gene expression in liver of transgenic zebrafish ()[J]. Febs Letters, 2003, 538(1/2/3): 125-133.

[27] JIANG S, HELLER B, TAGLIABRACCI V S, et al. Starch binding domain-containing protein 1/genethonin 1 is a novel participant in glycogen metabolism[J]. Journal of Biological Chemistry, 2010, 285(46): 34960-34971.

[28] SUGIYAMA M, TAKENAGA F, KITANI Y, et al. Homozygous and heterozygoustransgenesis alters fatty acid composition and content in the liver of Amago salmon ()[J]. Biology Open, 2012, 1(10): 1035-1042.

[29] FARIN H F, MANSOURI A, PETRY M, et al. T-box protein tbx18 interacts with the paired box proteinin the development of the paraxial mesoderm[j]. journal of biological chemistry, 2008, 283(37): 25372-25380.

[30] JAYNES J B, JOHNSON J E, BUSKIN J N, et al. The muscle creatine kinase gene is regulated by multiple upstream elements, including a muscle-specific enhancer[J]. Molecular and Cellular Biology, 1988, 8(1): 62-70.

[31] PARMACEK M S. Myocardin-Related transcription factors: critical coactivators regulating cardiovascular development and adaptation[J]. Circulation Research, 2007, 100(5): 633-644.

[32] RUDNICKI M A, SCHNEGELSBERG P N J, STEAD R H, et al.oris required for the formation of skeletal muscle[J]. Cell, 1993, 75(7): 1351-1359.

Differentially Expressed Genes Analysis of Hybrid Grouper and Female Tiger Grouper Based on Transcriptome Sequencing

LIN Ming-de1, CHEN Gang1, MA Qian1, WANG Zhong-liang1, ZHANG Jian-dong1, XIE Rui-tao1,2, TANG Bao-gui1, HUANG Jian-sheng1, ZHOU Hui1, SHI Gang1, PAN Chuan-hao1, ERIC Amenyogbe1，DENG Wen-xin1, 3

（1.,524088, China; 2.,.3.,524000, China）

【】Significant difference in the growth of tiger grouper （）and its hybrid grouper （♀×♂）F1 was found in grouper aquaculture. To analyze the molecular mechanisms leading to the fast-growth of the hybrid grouper, this study aimed to characterize the differentially expressed genes of that have growth characters, which may provide a theoretical basis for the crossbreeding of grouper.【】The Illumina HiSeq 2000 sequencing platform was used for RNA sequencing of different tissues（the brain, liver and muscle）of tiger grouper and hybrid grouper F1 of the same age. Differentially expressed genes were screened and functional annotation were conducted. Finally, real-time quantitative-PCR was performed to verify the transcriptome data.【】The raw data of sequencing obtained a total of 54 610 unigenes after quality control and assembly. The unigenes were searched against Nr, Swissprot, KOG and KEGG databases by BlastX program（value≤10-5）, and a total of 28 832 unigenes were annotated. The edgeR software package was used for differential expression analysis among the sample. A total of 20 234 unigenes were obtained, of which 10 218 were up-regulated and 10 016 were down-regulated. The Gene Ontology（GO）functional annotation showed that a total of 34 061 differentially expressed genes were clustered into 53 functional categories involving biological processes, molecular functions, and cellular components. The functional categories clustered most of the genes involved in cellular processes, binding, single-organism process, metabolic process, and catalytic activity, etc. Cluster of Orthologous Groups of proteins （KOG）analysis showed that 42 753 unigenes were annotated into 25 functional categories, most of which were involved in signal transduction mechanisms, general function prediction only, post-translational modifications, posttranslational modification, protein turnover, chaperones and transcription. The study further screened a number of growth-related genes,,,,and, etc. In this study, the expression levels of these differentially expressed genes in F1 were higher than those of their parents, which was consistent with the rapid growth of hybrid F1 compared to tiger grouper.【】The transcriptome sequencing and assembly of tiger grouper and its hybrid F1 were completed. Functional annotation information of sequencing data in different databases was obtained. A batch of growth-related differentially expressed genes was screened, the expression level of these genes in F1 is higher than tiger grouper, which consistent with realistic growth traits.

Tiger grouper; hybrid grouper; transcriptome; comparative analysis; growth-related gene

S917.4; Q786

A

1673-9159（2019）03-0015-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.03.003

2018-11-23

2016廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目“石斑魚雜交新品種選育”(2016B020201009)

林明德（1992—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)養(yǎng)殖。E-mail :475363641@qq.com

陳剛，教授，主要從事魚類健康養(yǎng)殖和種子工程。E-mail: cheng@gdou.edu.cn

林明德，陳剛，馬騫，等. 雜交石斑魚和母本褐點(diǎn)石斑魚轉(zhuǎn)錄組測序及差異表達(dá)基因分析[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（3）：15-23.

（責(zé)任編輯：劉朏）