王凱麗,高彥釗,李 姍,張夢璐,吳智豪,劉連濤,孫紅春,李存東,張永江

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/河北省作物生長調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 保定 071001)

氣孔是高等植物與外界進(jìn)行CO2和水汽傳輸?shù)闹饕ǖ篮驼{(diào)節(jié)器官,調(diào)節(jié)著植物的碳同化和水分散失的平衡關(guān)系。Hetherington等[1]指出,氣孔孔隙面積雖只占葉片表面積的5%左右,但從氣孔蒸發(fā)的水分高達(dá)70%。影響氣孔活動的環(huán)境因素包括光照、CO2濃度、空氣濕度以及土壤水分狀況等[2]。在非生物脅迫中,干旱脅迫對植物的危害較大,氣孔調(diào)節(jié)是植物抵御干旱脅迫和適應(yīng)環(huán)境的機(jī)制之一[3]。植物通過控制氣孔的開閉程度和數(shù)目調(diào)節(jié)葉片的蒸騰速率。不同種類植物氣孔在應(yīng)對不同程度干旱時(shí)表現(xiàn)不同。中度土壤干旱條件下,玉米葉片氣孔密度增大,氣孔長度和寬度都變小,且寬度的變幅大于氣孔長度的變幅[4]。燕麥(Avena sativaL.)在輕度干旱下(土壤相對含水量60%)氣孔開啟程度比正常水分條件大,證明燕麥具有典型耐旱作物結(jié)構(gòu)特征[5]。除了引起氣孔形態(tài)和運(yùn)動變化外,干旱會導(dǎo)致氣孔導(dǎo)度下降,進(jìn)入葉片內(nèi)部的CO2濃度降低,進(jìn)而帶來光合速率降低[6-7]。葉綠素?zé)晒鈪?shù)已被廣泛用于脅迫生理中,但干旱下植物葉片熒光參數(shù)的表現(xiàn)不同。干旱降低了棉花葉片PS Ⅱ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、光化學(xué)量子效率(φPSⅡ),非光化學(xué)猝滅系數(shù)(NPQ)升高[8],但也有試驗(yàn)證明干旱不會降低ETR和φPSⅡ[9-10]。

棉花(Gossypium hirsutumL.)是中國乃至全世界最為重要的經(jīng)濟(jì)作物,其產(chǎn)區(qū)多為干旱或半干旱地區(qū),水分供應(yīng)不足是棉花生產(chǎn)的主要障礙因素之一。關(guān)于土壤干旱下棉花光合生理特性的研究已有較多報(bào)道[11-12],但關(guān)于模擬短期干旱下棉花氣孔形態(tài)和運(yùn)動表現(xiàn)及其光合特征研究并不多見。本研究采用PEG-6000模擬短期干旱,研究不同脅迫天數(shù)、干旱程度下棉花葉片氣孔形態(tài)和密度、光合參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)等指標(biāo)變化,以進(jìn)一步明確棉花氣孔對干旱的響應(yīng)特征,了解氣孔調(diào)節(jié)的真實(shí)行為,為提高水分利用效率奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)為室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn),在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)農(nóng)學(xué)院智能溫室(保定)內(nèi)進(jìn)行。溫室溫光條件為,白天25℃(照光),夜間20℃(不照光)。供試棉花品種為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉‘國欣9號'。種子用75%的酒精消毒滅菌后用蒸餾水浸種,25℃催芽至露白,選取露白一致的種子先種在蛭石中,待棉花幼苗長至2葉一心時(shí)(播種后21 d),挑選生長一致健壯的幼苗移至1/4 Hoagland營養(yǎng)液中,3 d更換一次營養(yǎng)液,長至3葉一心(播種后31 d)時(shí)使用1/2 Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),4葉一心時(shí)(播種后35 d)使用全Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),待5葉一心時(shí)(播種后51 d)開始模擬干旱脅迫處理。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,在營養(yǎng)液中加入PEG-6000的濃度分別為：0(對照)、1.5%、3.0%和4.5%。每處理60株。

1.2 測定項(xiàng)目及方法

1.2.1 葉片水勢測定

采用Model 600型植物壓力室(美國PMS公司),選取倒3葉進(jìn)行測定,每次重復(fù)5株。

1.2.2 氣孔大小和密度

利用BX53數(shù)碼顯微攝像系統(tǒng)(日本Olympus公司),待光合參數(shù)和熒光參數(shù)測定完成后1 h進(jìn)行。采用指甲油涂抹和透明膠帶相結(jié)合的方法,測定葉位為倒4葉。先將指甲油均勻涂抹在葉片背面的取材部位,使其在室溫自然晾干5～10 min(視光照、風(fēng)等因素確定),將透明塑料膠帶拉開3～4 cm,膠面朝下,粘取指甲油層,用手指抹平膠帶,使膠帶與指甲油層之間充分接觸,沒有氣泡;撕取粘有指甲油層的膠帶,將其粘貼在載玻片上,不另加蓋玻片,每個(gè)葉片隨機(jī)選取5個(gè)視野,在40倍目鏡下觀察測定氣孔密度和氣孔形態(tài)特征。1)氣孔長度和寬度(μm)：每個(gè)視野隨機(jī)選取5個(gè)氣孔,測定啞鈴形保衛(wèi)細(xì)胞長度即為氣孔長度,垂直于啞鈴形保衛(wèi)細(xì)胞的最寬值即為氣孔寬度。2)氣孔開度(μm)：每個(gè)視野隨機(jī)選取5個(gè)氣孔,測定氣孔孔徑的寬度用來表示氣孔的開張度。3)氣孔密度：測量出視野面積,計(jì)算每幅圖片上的氣孔個(gè)數(shù),取平均值,除以圖片面積,得到每個(gè)視野的平均氣孔密度(個(gè)·μm-2)。

1.2.3 葉片氣體交換參數(shù)

采用LI-6400光合儀(美國LI-COR公司),設(shè)置內(nèi)置紅藍(lán)光源光強(qiáng)為600 μmol·m-2·s-1,CO2濃度為400 μmol·mol-1,選取倒4葉中部進(jìn)行測定,獲取凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)。每次測定重復(fù)5株。本研究所有測定項(xiàng)目均分別在處理后的1 d、3 d、5 d和7 d進(jìn)行。

1.2.4 葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)

采用PAM-2500(德國Walz公司)葉綠素?zé)晒鈨x,先測定光下葉片實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量 Yield,接著暗適應(yīng)20 min,獲取最大光化學(xué)效率Fv/Fm,計(jì)算非光化學(xué)淬滅系數(shù) NPQ。測定葉片為光合測定葉,每次重復(fù)5株。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理在Microsoft Excel 2010中進(jìn)行,采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行差異顯著性統(tǒng)計(jì)分析,多重比較采用LSD法,氣孔形態(tài)指標(biāo)和光合參數(shù)圖采用Origin Pro 9軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同PEG-6000處理對棉花葉片水勢的影響

葉水勢是反映植物體內(nèi)水分狀況的靈敏的生理指標(biāo)之一。隨PEG-6000處理濃度的增加,葉水勢顯著下降,說明干旱脅迫越重,葉片水勢越低。如圖1所示,隨PEG-6000處理時(shí)間延長,各處理葉片水勢逐漸下降。1.5%濃度在PEG-6000處理后1 d和3 d與對照差異不顯著,5 d差異顯著。3.0%和4.5%濃度在處理后1 d即與對照差異顯著,其中4.5%濃度在處理后1 d、3 d、5 d和7 d分別下降17.65%、21.15%、23.43%和32.45%。表明1.5%處理的第5 d是棉花葉片水勢的臨界條件。干旱導(dǎo)致葉片水勢降低,以便更容易地從溶液中吸收水分。

圖1 不同PEG-6000濃度處理下棉花葉片水勢變化Fig.1 Change of leaf water potential under four PEG-6000 concentrations in cotton

2.2 不同PEG-6000處理對棉花氣孔形態(tài)的影響

經(jīng)不同濃度 PEG-6000處理后,棉花葉片氣孔形態(tài)發(fā)生明顯變化(圖2)。由圖2可知,隨著處理時(shí)間的延長,除對照外,其余 PEG處理的棉花氣孔長度、寬度和開度均呈下降趨勢,氣孔密度呈上升趨勢。處理后1 d,3.0%PEG處理的氣孔長度和寬度與對照差異顯著(P＜0.05)。不同處理間各氣孔指標(biāo)在處理后3 d開始差別逐漸加大。處理后第7 d,4.5%PEG處理的氣孔長度、寬度和開度比對照分別降低2.61%、4.28%和19.29%,而氣孔密度上升 16.55%(圖3)。表明在干旱初期葉片通過微閉氣孔減少蒸騰,嚴(yán)重干旱時(shí)氣孔開度的降幅高于氣孔長度和寬度。

圖2 不同PEG-6000濃度處理1 d后棉花葉片氣孔形態(tài)變化(A、B、C和D分別對應(yīng)PEG-6000處理濃度為0、1.5%、3.0%和4.5%)Fig.2 Leaf stomatal morphology of cotton under four PEG-6000 concentrations for 1 day(A：0;B：1.5%;C：3.0%and D：4.5%)

2.3 不同PEG-6000處理對棉花光合參數(shù)的影響

隨 PEG-6000處理濃度的增加和處理時(shí)間的延長,凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr)都呈明顯下降的趨勢(圖4)。與處理后1 d相比,1.5%處理的Pn在第3 d、5 d、7 d分別下降38.37%、47.32%和44.67%,相應(yīng)地4.5%處理分別下降9.58%、11.02%和31.95%,且與對照之間均差異顯著(圖4A)。Gs也有相似變化趨勢,從第1 d開始加入PEG-6000的各處理與正常處理差異顯著,但自處理后 3 d開始,PEG-6000 1.5%、3.0%和4.5%3個(gè)處理間差異不顯著(圖4B)。干旱同樣降低了葉片的蒸騰速率,在每個(gè)測定日,加入PEG-6000各處理與正常處理差異均達(dá)顯著水平(P＜0.05)。處理后第1 d、3 d、5 d和7 d,4.5%處理相對于正常處理分別下降46.02%、50.49%、63.52%和67.48%(圖4C)。與對照相比,加入PEG-6000處理也不同程度地降低了Ci,處理后各測定日Ci均與對照差異顯著,各干旱處理間的差異小于干旱與對照之間的差異(圖4D)。

圖3 不同PEG-6000濃度處理下棉花氣孔形態(tài)指標(biāo)的變化(A-D分別為氣孔長度、寬度、開度和密度)Fig.3 Leaf stomatal length(A),width(B),aperture(C)and density(D)of cotton under four PEG-6000 concentrations

圖4 不同PEG-6000濃度處理下棉花葉片凈光合速率(Pn,A)、氣孔導(dǎo)度(Gs,B)、蒸騰速率(Tr,C)和胞間CO2濃度(Ci,D)的變化Fig.4 Leaf net photosynthetic rate(Pn,A),stomatal conductance(Gs,B),transpiration rate(Tr,C)and intercellular CO2 concentration(Ci,D)of cotton leaf under four PEG-6000 concentrations

2.4 不同PEG-6000處理對棉花葉片葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)的影響

隨干旱脅迫程度和處理天數(shù)的增加,Fv/Fm整體呈下降趨勢(圖5)。在處理后1 d,各處理間差異不顯著;處理后3 d和5 d,4.5%處理顯著低于對照,而1.5%和3.0%處理與對照差異不顯著;處理后7 d,各處理顯著低于對照,1.5%、3.0%和4.5%處理分別比對照低5.42%、5.55%和9.39%。表明短期輕度干旱脅迫不會對棉花葉片PSⅡ最大光化學(xué)效率造成顯著影響,但長期重度干旱脅迫會造成PSⅡ最大光化學(xué)效率嚴(yán)重下降。

圖5 不同PEG-6000濃度處理下棉花葉片最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)Fig.5 Leaf maximal photochemical efficiency of PSⅡ in the dark(Fv/Fm)under four PEG-6000 concentrations in cotton

由圖6A可知,經(jīng)干旱脅迫處理后棉花實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量Yield值總體呈下降趨勢,表明干旱使棉花葉片的光合電子傳遞過程受到了抑制。1.5%處理直到處理后第7 d Yield值才顯著低于對照,3.0%和4.5%處理在處理后第1 d便顯著低于對照,其中4.5%處理在處理后的第1 d、3 d、5 d和7 d分別比正常處理下降20.64%、24.81%、35.07%和19.60%。非光化學(xué)淬滅(NPQ)常用來評價(jià)植物耗散過剩激發(fā)能的能力[13]。由圖6B可以看出,隨著干旱脅迫的加重,NPQ呈上升趨勢。處理后1 d,3個(gè)干旱處理的NPQ值均顯著高于對照(P＜0.05);處理后3 d,各干旱處理NPQ值均高于對照,但處理間差異未達(dá)顯著水平;處理后5 d和7 d,4.5%處理顯著高于對照,比對照分別提高22.72%和31.82%。表明干旱導(dǎo)致棉花葉片中PSⅡ反應(yīng)中心耗散過剩光能的能力增強(qiáng),吸收的光能較多用于熱耗散。

2.5 氣孔形態(tài)指標(biāo)與光合、熒光參數(shù)的關(guān)系

由表1可見,棉花氣孔長度、寬度和開度之間極顯著正相關(guān)(P＜0.01),氣孔寬度和氣孔密度不相關(guān)。氣孔長度、寬度和開度與Pn和Yield極顯著正相關(guān)(P＜0.01),與NPQ極顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01),與Gs、Tr和Fv/Fm相關(guān)不顯著。

3 討論與結(jié)論

氣孔是植物體內(nèi)水分和CO2與外界環(huán)境進(jìn)行交換的通道,氣孔的大小、多少和調(diào)節(jié)功能與葉片的光合作用和蒸騰作用等生理過程有密切的聯(lián)系[14]。在干旱脅迫下,植物可通過氣孔調(diào)節(jié)來適應(yīng)。一般而言,植物葉片氣孔長度、寬度、氣孔開張度會隨著土壤干旱脅迫程度的加重而逐漸降低[7,15-16]。氣孔密度變化因作物種類和脅迫程度不同而異。在輕度至中度脅迫或者脅迫發(fā)生的初期,葉片氣孔密度會上升,即適度的干旱可增加葉片氣孔密度[17],而過度干旱或長期干旱則使葉片氣孔密度下降[18]。其原因可能是輕度和中度干旱脅迫使細(xì)胞伸長受抑制,導(dǎo)致葉面積減少,即單位面積的氣孔數(shù)目增加,氣孔密度上升。嚴(yán)重干旱脅迫時(shí),葉片受影響嚴(yán)重,抑制了氣孔發(fā)生,氣孔數(shù)目顯著減少,最終表現(xiàn)為氣孔密度下降[19]。本研究采用PEG滲透脅迫模擬干旱,結(jié)果表明隨著脅迫程度的加深,棉花葉片氣孔長度、寬度、開度下降,氣孔密度上升,未發(fā)現(xiàn)氣孔密度下降,可能是脅迫程度不夠。此外,有報(bào)道稱可通過基因調(diào)控降低氣孔密度來提高植物的抗旱性[20]。氣孔關(guān)閉的原因受到ABA和/或水力學(xué)信號調(diào)控[21]。

圖6 不同PEG-6000濃度處理下棉花實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量(Yield,A)和非光化學(xué)淬滅(NPQ,B)Fig.6 Photochemical quantum yield(Yield,A)and non-photochemical quenching coefficient(NPQ,B)of cotton under four PEG-6000 concentrations

表1 棉花氣孔形態(tài)指標(biāo)與光合、熒光參數(shù)的關(guān)系Table 1 Correlation coefficients among leaf stomata morphological parameters,gas exchange and chlorophyll fluorescence parameters under four PEG-6000 concentrations in cotton(n=80)

干旱脅迫對作物光合能力的限制是由氣孔關(guān)閉引起還是由碳代謝受損所導(dǎo)致,因植物種類、脅迫程度不同而不同。Ennahli等[22]認(rèn)為適度水分虧缺下棉花葉片凈光合速率的變化主要是由于葉片氣孔關(guān)閉,胞間CO2濃度降低造成的。Ahmed等[23]認(rèn)為干旱脅迫早期綠豆葉片的Pn迅速下降,但氣孔導(dǎo)度并沒有發(fā)生任何變化,隨著干旱脅迫時(shí)間的不斷延長氣孔導(dǎo)度才明顯降低,說明干旱脅迫初期非氣孔限制因素是導(dǎo)致Pn降低的主要因素,而后期Pn的降低則主要是由于氣孔關(guān)閉導(dǎo)致CO2虧缺造成的。羅宏海等[12]認(rèn)為花鈴期土壤干旱導(dǎo)致棉花葉片光合速率降低,輕度干旱葉片熒光參數(shù)變化不顯著,中度干旱下qP和φPSⅡ顯著下降,NPQ顯著升高。本研究表明,PEG-6000模擬干旱導(dǎo)致棉花葉片氣孔閉合、Ci降低,Pn降低主要受氣孔限制。在應(yīng)對干旱的響應(yīng)上,葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm在1.5%和3%濃度處理1 d、3 d和5 d均與對照無顯著差異,表明該參數(shù)對干旱的敏感性比Yield和NPQ差。這與羅宏海等[12]的結(jié)論一致。

本試驗(yàn)條件下,處理后1 d,各濃度處理的葉片水勢、光合性能明顯下降,說明PEG-6000模擬棉花干旱效果顯著。下一步可以適當(dāng)降低PEG-6000濃度,或者在處理后數(shù)小時(shí)內(nèi),連續(xù)觀測葉片氣孔和光合指標(biāo)變化,以明確葉片對短時(shí)間內(nèi)干旱脅迫的響應(yīng)。還可以增加恢復(fù)試驗(yàn),經(jīng)脅迫處理一定時(shí)間后利用正常營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),研究葉片在干旱解除后的恢復(fù)能力。

本研究通過對PEG-6000誘導(dǎo)的棉花葉片氣孔形態(tài)、光合和熒光指標(biāo)分析,發(fā)現(xiàn)干旱引起凈光合速率等指標(biāo)的下降,主要是由氣孔的閉合引起。熒光參數(shù)Yield和NPQ比Fv/Fm對干旱反應(yīng)更敏感。