王星淇，石小保，林芳柯，孫雪麗，劉范，田娜，郝向陽(yáng)，程春振

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州 350002）

遺傳轉(zhuǎn)化是研究基因功能和植物遺傳改良的重要手段。在特定植物的遺傳轉(zhuǎn)化體系不夠成熟或研究一個(gè)植物的基因在其他植物或微生物中的作用時(shí)，常常會(huì)用到異源表達(dá)系統(tǒng)。然而不同生物對(duì)密碼子的使用有一定的偏好性，這使得在異源表達(dá)某一基因時(shí)有時(shí)會(huì)出現(xiàn)基因在異源表達(dá)系統(tǒng)中不能成功翻譯出相應(yīng)蛋白的情況。因此，在進(jìn)行基因克隆、基因功能鑒定、異源表達(dá)系統(tǒng)選擇以及改進(jìn)和優(yōu)化提高基因表達(dá)水平等方面的研究時(shí)，密碼子偏好性分析顯得極為重要[1]。

非洲菊是世界五大鮮切花之一[2]，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而非洲菊抗逆性較弱，容易受病害和環(huán)境變化的影響[3]，提高非洲菊的抗逆性對(duì)非洲菊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展意義重大。木質(zhì)素生物合成途徑在植物抗逆反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[4]。肉桂醇脫氫酶（C A D）是木質(zhì)素生物合成途徑最早被研究的酶之一，其在木質(zhì)素單體生物合成的最后一步反應(yīng)過(guò)程中催化肉桂醛還原成相應(yīng)的木質(zhì)素單體的前體[5-6]，在3種木質(zhì)素的合成過(guò)程中都起到了非常重要的作用。CAD基因自1973年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從其組成結(jié)構(gòu)、生物性質(zhì)、基因克隆及遺傳轉(zhuǎn)化等方面展開(kāi)了系列研究，并取得了一定的進(jìn)展。目前有關(guān)非洲菊CAD基因的研究較少，該研究基于前期獲得的非洲菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了CAD基因篩選，并進(jìn)行了密碼子偏好性分析，旨在為今后該基因的功能研究、生物信息學(xué)分析和木質(zhì)素代謝研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 CAD基因的篩選及模式生物基因組的密碼子偏好性數(shù)據(jù)來(lái)源

基于實(shí)驗(yàn)室前期獲得的非洲菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選包含全長(zhǎng)CDS的CAD基因。5個(gè)常見(jiàn)模式生物：擬南芥（Arabidopsis thaliana）、煙草（Nicotiana sylvestris）、番茄（Solanum lycopersicum）、大腸桿菌（Escherichia coli）以及酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）基因組密碼子偏好性數(shù)據(jù)下載自Codon Usage Database（http：//www.kazusa.or.jp/codon/）[7]。

1.2 CAD基因密碼子使用偏好性分析與堿基組成分析方法

通過(guò)CodonW軟件計(jì)算非洲菊CAD基因的ENC和CAI值，并通過(guò)使用EMBOSS在線網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/） 分析計(jì)算得到非洲菊CAD基因密碼子第1、2、3位的GC含量（GC1s、GC2s、GC3s）與總GC含量。再使用CodonW軟件獲得非洲菊CAD基因的RSCU值。

利用軟件Origin8.0進(jìn)行中性繪圖分析、ENC-plot分析和 PR2分析（PR2-bias plot analysis），具體步驟參照屈蒙蒙等的方法[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1CAD基因家族的ENC和GC

從非洲菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選獲得5條具有完整CDS的CAD基因，分別命名為CAD1、CAD2、CAD3、CAD4、CAD5。通過(guò)CodonW軟件計(jì)算它們的ENC和CAI值，利用EMBOSS在線分析得它們的總GC含量以及位于密碼子不同位置的GC含量，整理得表1。由表1可以看出，5個(gè)非洲菊CAD基因的ENC值相差不大，介于53.37～58.07，平均值為55.77，說(shuō)明非洲菊CAD基因密碼子的使用偏好性較弱。從CAI指數(shù)看，非洲菊CAD基因CAI值介于0.191～0.225，平均值為0.210，遠(yuǎn)小于1，進(jìn)一步說(shuō)明了非洲菊CAD基因的密碼子偏好性較弱?？侴C含量為44.16%～50.23%，平均值為46.46%；GC1s為48.46%～55.71%，平均值為52.56%；GC2s為37.05%～40.67%，平均值為39.16%；GC3s為44.08%～57.94%，平均值為47.67%，由此推測(cè)非洲菊CAD基因家族編碼氨基酸時(shí)使用較多的A或T，G或者C的偏好性較弱，且偏向于以A或T結(jié)尾。

2.2 同義密碼子相對(duì)使用度

通過(guò)CodonW軟件分析后得到5個(gè)非洲菊CAD基因的RSCU值，取平均值后整理得到表2。偏好性較強(qiáng)的密碼子（RSCU＞1）有32個(gè)，其中以G或者C結(jié)尾的密碼子有12個(gè)，以A或者U（T）結(jié)尾的密碼子有20個(gè)，說(shuō)明以A或者U（T）結(jié)尾的密碼子出現(xiàn)的頻率較高而G或者C的偏好性較弱，與GC含量值預(yù)測(cè)結(jié)果一致。此外，無(wú)相對(duì)使用度極大的特定同義密碼子，表明該家族成員對(duì)密碼子的偏好性較為平均，無(wú)特別偏好的密碼子。

表2 非洲菊CAD基因同義密碼子的使用頻率

2.3 CAD基因成員堿基組成

采用 SPSS17.0 進(jìn)行GC1s、GC2s、GC3s、GC和ENC兩兩Pearson關(guān)聯(lián)分析，由表3可得GC1s、GC2s、GC3s、GC和ENC之間無(wú)顯著相關(guān)性（P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著），說(shuō)明非洲菊CAD基因第1、2和3位上的堿基組成無(wú)特別的相似關(guān)系。

表3 非洲菊CAD基因不同位置的密碼子GC含量及ENC的相關(guān)性

圖1 5個(gè)非洲菊CAD基因的密碼子使用偏好性中性繪圖

由圖1可得，5個(gè)非洲菊CAD基因較為分散，且分布在對(duì)角線兩側(cè)，大部分都距離對(duì)角線較為接近。G1s、G2s與G3s無(wú)明顯的線性關(guān)系，與Pearson分析結(jié)果一致。

由圖2分析可得，5個(gè)非洲菊CAD基因的ENC值距離ENC的期望曲線都較遠(yuǎn)，無(wú)顯著規(guī)律。而由圖3分析可得，這5個(gè)非洲菊CAD基因A3/（A3+T3）與G3/（G3+C3）的比值大部分與0.5偏離較大，這表明該基因編碼氨基酸時(shí)除受突變壓力的影響外，外界因素與自然壓力影響較大。且從圖3的整體布局上看，縱坐標(biāo)主要集中于小于0.5的位置，橫坐標(biāo)也主要集中在小于0.5的位置，這說(shuō)明密碼子第3位上T（U）的含量大于A的含量，第3位上C的含量大于G的含量。

2.4 CAD基因受體系統(tǒng)選擇

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)非洲菊遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究仍較為少見(jiàn)[9-10]，非洲菊的遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究也較為不成熟[11-13]，因此找尋非洲菊合適的異源表達(dá)系統(tǒng)和模式受體為基因進(jìn)行相關(guān)的功能驗(yàn)證以及為遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究奠定基礎(chǔ)仍然非常重要。非洲菊CAD基因家族成員密碼子平均使用頻率分別與模式植物擬南芥（At）、煙草（Nt）、番茄（Sl）、大腸桿菌（Ec）、酵母菌（Sc）基因組密碼子使用偏性的數(shù)據(jù)比較的匯總表如表4所示，與大腸桿菌使用偏性相差較大的密碼子有18個(gè)，而與酵母菌使用偏性相差較大的密碼子僅有10個(gè)，說(shuō)明酵母菌真核表達(dá)系統(tǒng)較適合成為非洲菊CAD的異源表達(dá)系統(tǒng)；番茄、煙草、擬南芥與非洲菊CAD基因使用頻率相差較大的密碼子分別是10、7、6，由此推測(cè)擬南芥是作為非洲菊CAD基因遺傳轉(zhuǎn)化研究的更為理想的受體。

圖3 5個(gè)非洲菊CAD基因的PR2分析

表4 非洲菊CAD基因與5個(gè)常見(jiàn)模式生物基因組密碼子使用頻率的比較

3 討論

通過(guò)對(duì)5個(gè)非洲菊CAD基因的ENC和CAI值和總GC含量以及位于密碼子不同位置的GC含量的分析可得，非洲菊CAD基因的密碼子偏好性較弱，基因表達(dá)水平總體偏低。該基因編碼氨基酸時(shí)使用較多的A或T，G或者C的偏好性較弱，且偏向于以A或T結(jié)尾。同時(shí)，通過(guò)RSCU分析發(fā)現(xiàn)，非洲菊CAD基因密碼子使用偏性較強(qiáng)的密碼子有32個(gè)，其中以G或者C結(jié)尾的密碼子有12個(gè)，以A或者U（T）結(jié)尾的密碼子有20個(gè)。以上結(jié)果與雙子葉植物更偏好使用A或T（U）結(jié)論一致[14]。

非洲菊CAD基因位于第1、2、3位的密碼子無(wú)明顯的線性關(guān)系，A3/（A3+T3）與G3/（G3+C3）的比值大部分與中間值0.5偏離較大，可推測(cè)該基因編碼氨基酸時(shí)除受突變壓力的影響外，外界因素與自然壓力影響較大。

目前，非洲菊基因原核表達(dá)多使用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)[15-17]，而該研究發(fā)現(xiàn)酵母菌真核表達(dá)系統(tǒng)更適合作為非洲菊CAD基因的異源表達(dá)系統(tǒng)。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)擬南芥是非洲菊CAD基因異源植物表達(dá)最為理想的植物受體，該結(jié)論可對(duì)非洲菊CAD基因遺傳轉(zhuǎn)化研究以及功能驗(yàn)證提供參考。