曾 林 ，黃彬茹 ，趙春麗 ，王 曉 ，賴鐘雄 *，劉生財 *

（1.福建農(nóng)林大學園藝學院，福建福州 350002；

2.福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所，福建福州 350002）

莧菜（Amaranthus tricolor）也叫雁來紅、米莧、青香莧等，原產(chǎn)中國、印度及東南亞等地。莧菜中含有豐富的類黃酮、甜菜色素等次生代謝物，具有一定的保健功能[1]，并且莧菜還擁有生長周期短、抗逆性強等優(yōu)點，因此，莧菜得到了國內(nèi)外許多研究學者的關(guān)注[2]。此外，張媛媛等[3]研究發(fā)現(xiàn)，莧菜的愈傷組織中也蘊含著豐富的次生代謝物質(zhì)，說明莧菜的愈傷組織也具有很大的研究前景。

苯丙氨酸解氨酶（phenylalaniammonia-lyase，PAL）是苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，苯丙烷代謝途徑的不同去向?qū)Υ紊x物質(zhì)的積累以及生理生化作用具有很大程度的影響[4]，所以PAL對類黃酮的產(chǎn)生、植物色素的形成、植物細胞分化以及木質(zhì)化過程、參與植物抗逆境性等方面都有重要作用，可預(yù)見其未來在醫(yī)學、保健以及食品工業(yè)等領(lǐng)域都具有誘人的發(fā)展前景[5]。

自然界中生物的基因往往對密碼子的使用存在一定的偏好性，而密碼子使用的偏好性能夠反映物種或基因的起源、進化規(guī)律和突變方式，同時對基因功能分析、蛋白質(zhì)表達和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究等具有重要參考價值[6]。該研究主要進行莧菜AtPAL基因密碼子偏好性分析、與其他物種PAL基因密碼子偏好性的對比分析，以及與大腸桿菌、酵母菌等模式生物基因組密碼子偏好性的比較分析，可為莧菜AtPAL基因選擇異源表達受體和表達系統(tǒng)提供理論基礎(chǔ)，也為密碼子的優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 序列來源及分析軟件

莧菜AtPAL基因由福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所實驗室以‘大紅’莧菜為原材料克隆而出（GenBank登錄號：MK574874），其 ORF（開放閱讀框）區(qū)長度為2142 bp，共編碼713個氨基酸，杏（Prunus armeniaca）、菠菜（Spinacia oleracea）、一品紅（Euphorbia pulcherrima）、葡萄（Vitis vinifera）、番茄（Solanum lycopersicum）、甜菜（Beta vulgaris）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、毛白楊（Populus tomentosa）、康乃馨（Dianthus caryophyllus）、煙草（Nicotiana tabacum）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、甘蔗（Saccharum officinarum）等物種PAL基因序列來源于 GenBank（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）； 擬 南 芥（Arabidopsis thaliana）、煙草（Nicotiana tabacum）、大腸桿菌（Escherichia coli）、酵母菌（Yeast）、番茄（Solanum lycopersicum）等模式生物的密碼子偏好性數(shù)據(jù)均來源于密碼子使用數(shù)據(jù)庫（http：//www.kazusa.or.jp/codon/）。主要用到 codon W、SPSS（IBM SPSS Statistics 23）、MEGA7.0、Origin（OriginPro2017）等軟件，以及EMBOSS在線程序（http：//vm-bioinfo.toulouse.inra.fr/emboss）中的CUSP進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)的匯總統(tǒng)計主要用到Excel軟件。

1.2 數(shù)據(jù)分析方法

運用codon W軟件分析得到莧菜AtPAL基因CDS 區(qū)的A3s、C3s、T3s、G3s（分別表示密碼子中第 3位上腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和鳥嘌呤的含量）、CAI（密碼子適應(yīng)指數(shù)）、ENc（有效密碼子數(shù)）、RSCU值（同義密碼子相對使用度）等密碼子偏好性指標；運用EMBOSS在線程序中的CUSP進行分析，得到莧菜PAL基因CDS區(qū)各個密碼子的Frequency（密碼子使用頻率）、Fraction（單個密碼子在其同義密碼子中出現(xiàn)的比例）、GC1s（密碼子中第1位堿基的GC含量）、GC2s、GC3s、GC含量等偏好性指標；所得數(shù)據(jù)運用Excel軟件進行制表匯總。用同樣的方法，分析得到其他物種PAL基因的相關(guān)密碼子偏好性指標；以各個物種的RSCU值以及PAL基因CDS序列為數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，利用SPSS及MEGA軟件對不同物種進行聚類分析；運用SPSS和Origin軟件進行不同物種間PAL基因的中性分析、ENc與GC3s關(guān)聯(lián)性分析、以及奇偶偏好（PR2）分析；通過將莧菜PAL基因密碼子偏好性與不同模式生物基因組密碼子偏好性進行對比分析，來確定莧菜AtPAL基因最佳的異源表達受體。

2 結(jié)果與分析

2.1 莧菜AtPAL基因ENc值、CAI值以及GC含量

ENc值是指基因序列的有效密碼子數(shù)，可以檢測某一基因?qū)γ艽a子的偏好程度，數(shù)值大小范圍為20（每個氨基酸只使用1個密碼子）到 61（各個密碼子被均衡使用），數(shù)值越小，表明該基因的密碼子使用偏好性越強[7-8]。除此之外，ENc值的大小還可以體現(xiàn)出基因的表達水平，一般來說，ENc值越大，則基因的表達水平越低，ENc值小于30的可預(yù)測為高表達基因，大于55的可預(yù)測為低表達基因[9]。CAI指實際編碼該蛋白的所有密碼子對于完全使用最優(yōu)密碼子編碼該蛋白情況下的適應(yīng)性指數(shù)，一般與密碼子偏好性呈正相關(guān)，常用來衡量基因表達水平的高低[10]，該值大小范圍為0～1，越接近0則表明其基因表達水平以及密碼子偏好性越弱[11]。

使用CUSP在線程序分析得到莧菜AtPAL基因的GC含量、GC3s含量，使用codon W軟件分析得到莧菜AtPAL基因的ENc值以及CAI值，結(jié)果顯示，莧菜AtPAL基因的ENc值為53.64，比較接近55，說明莧菜AtPAL基因的表達水平和密碼子偏好性均較弱；GC含量為48.27%，即G+C的含量占48.27%，A+T的含量占51.73%，含量上比較接近，說明莧菜AtPAL基因略偏好使用A/T堿基，GC3s含量為48.88%，低于50%，說明莧菜AtPAL基因更偏好使用以A/T結(jié)尾的密碼子；CAI值為0.220，遠小于1，也進一步說明了莧菜AtPAL表達水平較弱。另外，莧菜AtPAL基因密碼子在第3位堿基上各種堿基的含量為A3s（0.280）、T3s（0.363）、C3s（0.339）、G3s（0.261），說明莧菜AtPAL基因在密碼子的選用上最偏好選用以T結(jié)尾的密碼子。

2.2 莧菜PAL基因密碼子選用偏好性

RSCU值是指某一密碼子所使用的頻率與其在無偏使用時期望頻率之間的比值[12]，能夠更直觀的體現(xiàn)出密碼子使用的偏好性程度[9]。若基因?qū)δ骋幻艽a子使用沒有偏好性，則該密碼子的RSCU值等于1，若某一密碼子的RSCU值大于1，則表示對該密碼子具有一定的偏好性。Frequency（密碼子使用頻率）是指在1000個密碼子中某一密碼子出現(xiàn)的次數(shù)；Fraction值是指某一密碼子在其同義密碼子中出現(xiàn)的比例（即一個氨基酸對應(yīng)的所有同義密碼子的Fraction值加和為1），這2個值也能在一定程度上反映出基因密碼子使用偏好性。

通過codonW軟件和CUSP在線程序分析得到莧菜AtPAL基因各個密碼子的RSCU值、Frequency值、Fraction值（表 1），結(jié)果顯示，RSCU值大于 1的密碼子總共有27個，說明莧菜PAL基因CDS區(qū)對這27個密碼子具有一定的使用偏好性，RSCU值大于 1.5 的密碼子有 GCT、TTG、CTT、CCT、AGA、TCA、AGC、ACT等8個，即表示莧菜PAL基因?qū)@8個密碼子具有較強的偏好性，其中編碼精氨酸的AGA密碼子RSCU值為最高，達到2.06，說明莧菜AtPAL基因在選擇編碼精氨酸的同義密碼子時最偏好使用AGA密碼子。另外，TTT、TTC、TGG（剔除起始密碼子ATG后）等3個密碼子的RSCU值為1，即說明莧菜AtPAL基因?qū)@3個密碼子沒有使用的偏好性。所分析的密碼子中，只有編碼蘇氨酸的ACG密碼子RSCU值為0，其余59個密碼子（剔除3個終止密碼子和1個起始密碼子）的RSCU值均不為0，說明莧菜AtPAL基因編碼區(qū)沒有使用ACG這個密碼子，且在密碼子的使用上偏好性較弱，與分析ENc值時所得結(jié)論一致。27個RSCU值大于1的密碼子中有15個是以A/T結(jié)尾的，8個RSCU值大于1.5的密碼子中有6個是以A/T結(jié)尾的，這也說明了莧菜AtPAL基因在密碼子的使用上，偏好選擇以A/T結(jié)尾的密碼子，與前面分析GC含量時得出的結(jié)論一致。另外發(fā)現(xiàn)，RSCU值大的密碼子其Frequency值以及Fraction值往往也較大，這也說明了密碼子的Frequency值和Fraction值可在一定程度上反映出密碼子使用的偏好性。

2.3 不同物種間PAL基因密碼子偏好性比較

2.3.1 不同物種間ENc值、CAI值以及GC含量分析。利用codon W軟件分析各個物種PAL基因CDS區(qū)序列得到表2的結(jié)果，結(jié)果顯示，PAL基因的ENc值、GC含量、GC3s含量、CAI值在單子葉植物與雙子葉植物之間均存在明顯的差異。11種雙子葉植物的ENc值范圍為46.46～54.42，均值為51.08，比較接近55，說明在雙子葉植物中PAL基因的表達水平和密碼子使用的偏好性普遍較弱；而4種單子葉植物的ENc值均較低，均值為29.35，低于30，說明在單子葉植物中PAL基因的表達量普遍偏高，并且密碼子使用偏好性也較強。

11種雙子葉植物的GC含量范圍為42.46%～51.77%，均值為46.86%，GC3s含量范圍為38.58%～57.99%，均值為46.28%，且除杏和康乃馨以外，其余9種雙子葉植物的GC以及GC3s含量均在50%以下，說明PAL基因在雙子葉植物中普遍略偏好使用A/T堿基，并且偏好使用以A/T結(jié)尾的密碼子，與Murray等[13]研究發(fā)現(xiàn)的雙子葉植物密碼子使用規(guī)律相符；4種單子葉植物的GC含量、GC3s含量均高于0.5，均值分別是67.65%（GC含量）、96.40%（GC3s含量），說明在單子葉植物中，PAL基因普遍偏好使用G/C堿基，尤其對以A/T結(jié)尾的密碼子有著極強的偏好性。另外，除番茄外的14個物種GC1含量均在50%以上，且15個物種的GC2含量均在50%以下，說明PAL基因無論是在雙子葉植物中還是在單子葉植物中均普遍偏好使用第1位堿基為G/C、第2位堿基為A/T的密碼子，但在第1位堿基上，單子葉植物對G/C堿基的偏好程度比雙子葉植物要強（單雙子葉植物GC1含量均值分別為62.73%、52.99%）。

11種雙子葉植物CAI值均較低，值的范圍為0.193～0.239，范圍波動較小，均值為0.217，與1相差較大，因此，也進一步說明在雙子葉植物中PAL基因的表達水平和密碼子使用的偏好性普遍較弱；而4種單子葉植物，除高粱以外的物種CAI值均高于0.3，均值為0.309，說明PAL基因在單子葉植物中的基因表達水平以及密碼子使用偏好性普遍高于雙子葉植物。

2.3.2 基于PAL基因密碼子偏好性及基因編碼區(qū)的聚類分析?；?5種不同物種的RSCU值，利用SPSS軟件計算不同物種間的歐式平方距離系數(shù)，歐式平方距離系數(shù)的數(shù)值越大，則表示物種間相關(guān)基因密碼子使用偏好性差異越大，所得結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，任意一種雙子葉植物與任意一種單子葉植物（水稻、甘蔗、玉米、高粱）間的歐式平方距離系數(shù)均較大，說明PAL基因密碼子使用偏好性在單子葉植物和雙子葉植物之間存在很大的差異。但11種雙子葉植物兩兩之間或是4種單子葉植物兩兩之間，其歐式平方距離系數(shù)均較??；同屬石竹目的4個物種（莧菜、甜菜、菠菜、康乃馨）兩兩之間的歐式平方距離系數(shù)都在14.000以下，同為藜科的甜菜和菠菜之間的歐式平方距離系數(shù)只有6.088，同屬禾本科的甘蔗、玉米、水稻、高粱兩兩之間的歐式平方距離系數(shù)也均在11.000以下，而親緣關(guān)系遠的物種間的歐式平方距離系數(shù)普遍相對較高，說明PAL基因密碼子使用偏好性與物種間的親緣關(guān)系有一定的聯(lián)系，親緣關(guān)系近的物種往往密碼子使用的偏好性差異也較小，但并不絕對，比如屬于楊柳科的毛白楊與屬于藜科的菠菜，兩者在親緣關(guān)系上相差較大，但歐式平方距離系數(shù)卻只有5.845，表示兩者PAL基因在密碼子的使用偏好性上差異較小，這說明一些物種在進化過程中其PAL基因可能會形成獨特的密碼子使用偏好性。

基于不同物種間密碼子使用偏好性的歐氏平方距離系數(shù)進行聚類分析，以每條基因作為一個對象，將密碼子的RSCU值作為變量，采用59個密碼子（剔除3個終止密碼子，1個起始密碼子ATG以及編碼色氨酸的TGG）的RSCU值對其密碼子使用偏性進行分析[14]?；蜷g的距離規(guī)定為基因同義密碼子相對使用度的歐氏平方距離[15]，對于基因X與基因Y，其密碼子使用距離D的計算公式為：

為了使同類樣品之間的離差平方和最小，而類與類之間的離差平方和最大，使用了離差平方和法計算類與類間的距離[16]，通過聚類分析得到圖1的樹狀圖。結(jié)果顯示，進化樹將15個物種劃分成了單子葉植物和雙子葉植物2個大類，玉米、甘蔗、水稻和高粱4種單子葉植物聚為一個大類，其余的11種雙子葉植物聚為一個大類；在雙子葉植物中，同屬藜科的菠菜、甜菜與屬于楊柳科的毛白楊聚為一小類，同屬石竹目的莧菜和康乃馨也單獨聚為一個小類，但是也發(fā)現(xiàn)同屬石竹目的4個物種（莧菜、甜菜、菠菜、康乃馨）并沒有完全單獨聚為一個小類別。因此，在一定程度上可以說明，親緣關(guān)系近的物種其PAL基因往往具有相似的密碼子使用偏好性，但并非絕對，某些物種的PAL基因在進化過程中可能會形成獨特的密碼子使用偏好性。

圖1 基于PAL基因同義密碼子相對使用度的聚類樹狀圖

基于不同物種PAL基因CDS區(qū)序列，使用MEGA7.0進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，結(jié)果如圖2所示。從進化樹所呈現(xiàn)的結(jié)果可以看出，15個物種同樣被分為2個大類，同為單子葉植物的玉米、高粱、甘蔗、水稻單獨聚為一大類，其余的11種雙子葉植物聚為另一個大類；在雙子葉植物中，同屬石竹目的菠菜、甜菜、莧菜、康乃馨單獨聚成了一小類，其中同為藜科的甜菜和菠菜更是單獨聚為了一個小類。因此，在一定程度上能夠說明無論是在單子葉植物中或是雙子葉植物中，親緣關(guān)系越近的2個物種其PAL基因密碼子使用的偏好性往往越相似，而且相較于基于RSCU值聚類分析的結(jié)果，基于CDS區(qū)序列聚類分析的結(jié)果與傳統(tǒng)意義上的物種分類更為接近，與賴瑞聯(lián)等[17]在研究龍眼TIR1基因時所得結(jié)論相符。

圖2 基于PAL基因CDS序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

表3 不同物種間PAL基因密碼子使用偏性的歐式平方距離系數(shù)

2.4 不同物種PAL基因中性分析

在進化過程中基因?qū)γ艽a子的使用偏好性往往受諸多因素影響，分析密碼子第1、2、3位上GC含量間的相關(guān)性，可以在一定程度上判別影響密碼子使用偏好性的因素[18]。一般認為，若GC12（GC1與GC2加和的平均值）與GC3的含量存在相關(guān)性，則表示在進化過程中基因?qū)γ艽a子的使用偏好性主要受突變壓力的影響，若不存在相關(guān)性則表示主要受自然選擇壓力的影響[19]，根據(jù)這個結(jié)論，在進行中性分析時以不同物種的GC12含量作為縱坐標，不同物種的GC3含量作為橫坐標[20]，利用Origin軟件進行中性繪圖，所得結(jié)果如圖3所示。從中性分析的結(jié)果圖可以看出，GC12與GC3存在極顯著的相關(guān)性（r=0.946，P＜0.01），說明在進化過程中突變壓力是影響PAL基因密碼子使用偏好性的主要因素。

圖3 不同物種PAL基因中性繪圖分析

2.5 不同物種PAL基因ENc與GC3s繪圖分析

研究表明，基因的ENc值與GC3含量之間的期望曲線能夠在一定程度上反映出影響基因?qū)γ艽a子使用偏好性的因素，若某一基因位點落在期望曲線上，則表示影響該基因密碼子使用偏好性的因素是突變壓力；若不在期望曲線上，則表示該基因受到突變壓力、自然選擇壓力或其他一些因素的影響[21-22]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，當GC3含量取值分布范圍較廣時，則主要是突變壓力影響密碼子的偏好性[23]。從圖4的結(jié)果來看，發(fā)現(xiàn)該研究的15個物種的PAL基因全都分布在期望曲線的下方，大部分都較靠近期望曲線分布，也存在少部分距離期望曲線較遠的點，另外GC3含量的分布范圍為0.386～0.969，分布較廣，說明總體而言PAL基因在密碼子的使用偏好性上主要受突變壓力的影響，但也存在其它一些因素影響著PAL基因密碼子使用偏好性，與中性分析的結(jié)果一致。

2.6 不同物種PAL基因奇偶偏好分析

圖4 不同物種PAL基因ENc與GC3s的關(guān)系

奇偶分析（PR2）主要用于分析密碼子第3位上嘌呤含量與嘧啶含量的關(guān)系[24]，一般認為，如果基因密碼子偏好性只受到突變壓力的影響，那么基因密碼子在第3位上的堿基A和T與G和C的使用頻率應(yīng)該是相等的，即A3/（A3+T3）=0.5，G3/（C3+G3）=0.5。從圖5可以發(fā)現(xiàn)，15個物種PAL基因密碼子第3位上的A3/（A3+T3）值均小于0.5，并且，所有物種的G3/（C3+G3）值均偏離0.5，因此，可以進一步說明PAL基因密碼子偏好性除受突變壓力影響外，還可能受如自然選擇壓力[25]等其他一些因素的影響。

圖5 不同物種PAL基因奇偶偏好（PR2）分析

2.7 莧菜AtPAL基因異源表達系統(tǒng)的選擇

不同物種的密碼子使用頻率比值可以反映出物種間密碼子使用偏性的差異，若比值大小在0.5～2則代表物種間密碼子偏好性比較相似，若不在這個范圍內(nèi)則表示物種間的密碼子偏性差異較大[14]。大腸桿菌是常見的原核表達系統(tǒng)，酵母菌是常見的真核表達系統(tǒng)，擬南芥、煙草、番茄則常作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，表4列出了莧菜AtPAL基因密碼子使用頻率與大腸桿菌、酵母菌、擬南芥、煙草、番茄等生物密碼子使用頻率的比值，結(jié)果顯示，大于2或小于0.5的比值個數(shù)分別有：擬南芥8個、煙草10個、番茄13個、大腸桿菌20個、酵母菌17個，即說明對于擬南芥、煙草、番茄3種模式生物而言，擬南芥基因組密碼子的使用偏性與莧菜AtPAL基因密碼子的使用偏性差異最小，因此擬南芥是3種模式植物中最適合作為莧菜AtPAL基因遺傳轉(zhuǎn)化受體的植物；而對于大腸桿菌和酵母菌而言，酵母表達系統(tǒng)要優(yōu)于大腸桿菌表達系統(tǒng)，即酵母菌更適合作為莧菜AtPAL基因的表達載體。

表4 莧菜AtPAL基因密碼使用偏好性與5種常見模式生物基因組密碼子使用偏好性比較

3 結(jié)論與討論

該研究發(fā)現(xiàn)，莧菜AtPAL基因GC含量為48.27%，GC3s含量為48.88%，表明莧菜AtPAL基因偏好使用A/T堿基，且偏好使用以A/T結(jié)尾的密碼子；ENc值為 53.64，較接近 55，CAI值為 0.220，較接近0，說明莧菜AtPAL基因的表達水平和密碼子偏好性均較弱。分析莧菜AtPAL基因RSCU值發(fā)現(xiàn)，具有使用偏好性的密碼子有27個（RSCU＞1），其中GCT、TTG、CTT、CCT、AGA、TCA、AGC、ACT 等 8 個密碼子具有較強的使用偏好性（RSCU＞1.5）；對比不同物種間PAL基因密碼子偏好性發(fā)現(xiàn)，PAL基因在雙子葉植物中普遍略偏好使用A/T堿基，并且偏好使用以A/T結(jié)尾的密碼子，而在單子葉植物中普遍略偏好使用G/C堿基，并且較偏好使用以G/C結(jié)尾的密碼子。2種聚類分析結(jié)果均表明，PAL基因密碼子使用偏性與物種間親緣關(guān)系存在一定聯(lián)系，親緣關(guān)系近的物種，其PAL基因密碼子使用偏好性也往往較相似，但并非絕對，基于RSCU值聚類分析的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，參與甜菜色素代謝的莧菜和參與花青素代謝的康乃馨、杏等物種聚為一類，莧菜、菠菜、甜菜3種參與甜菜色素代謝的植物并沒有完全聚為一類，而是與參與花青素代謝的植物混聚在一起，出現(xiàn)這樣的聚類結(jié)果，很可能說明苯丙烷代謝通路是植物體中很重要的一條代謝通路，參與甜菜色素代謝和參與花青素代謝的植物的PAL基因都具有很強的保守性，因而石竹目的植物并沒有單獨的聚在一起。除此之外，還可能與一些物種在進化過程中形成了獨特的密碼子偏好性，花青素代謝和甜菜素色代謝可能具有共同的起源[26]等原因有關(guān)。

不同物種間PAL基因的中性分析、ENc與GC3關(guān)聯(lián)性分析、PR2分析結(jié)果表明，影響PAL基因密碼子偏好性的主要因素是突變壓力，其他一些因素也對其有一定的影響，如自然選擇壓力、基因長度等。

莧菜AtPAL基因密碼子偏好性與大腸桿菌、酵母菌、擬南芥、煙草、番茄等模式生物基因組密碼子偏好性對比結(jié)果表明，擬南芥是3種模式植物中最適合作為莧菜AtPAL基因遺傳轉(zhuǎn)化受體的植物，酵母菌比大腸桿菌更適合作為莧菜AtPAL基因的表達載體，若要使用大腸桿菌作為莧菜AtPAL基因的表達載體，還需要針對大腸桿菌對密碼子的使用偏好性對莧菜AtPAL基因進行密碼子的優(yōu)化。該研究結(jié)果可作為莧菜AtPAL基因進行異源表達時，選擇合適受體及表達系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)，同時也能夠為莧菜AtPAL基因密碼子的優(yōu)化提供依據(jù)。