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        病死雞尸體發(fā)酵堆肥中蛋白酶分解菌的分離鑒定及發(fā)酵工藝的研究

        2019-06-11 07:50:08郭芳先肖發(fā)沂馮傳明陳永科劉鎮(zhèn)
        家禽科學 2019年2期
        關(guān)鍵詞:分離鑒定發(fā)酵

        郭芳先 肖發(fā)沂 馮傳明 陳永科 劉鎮(zhèn)

        摘? 要:從雞場病死雞自然發(fā)酵堆肥中取樣,分離篩選得到一株產(chǎn)蛋白酶活性高(揺瓶培養(yǎng)基酶活為2000U/ml)的菌株,經(jīng)過鑒定,該菌株為解淀粉芽孢桿菌。本文通過不斷優(yōu)化該菌株的產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基及其發(fā)酵工藝,最終確定了該菌在100~2000L發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝,放罐芽孢數(shù)可達3.1×1010CFU/ml,芽孢率≥98%。

        關(guān)鍵詞:解淀粉芽孢桿菌;分離鑒定;發(fā)酵

        中圖分類號:S858.314.4+3? ? ?文獻標識碼:B? ? ?文章編號:1673-1085(2019)02-0024-03

        病死動物尸體堆肥發(fā)酵因其簡單實用、經(jīng)濟環(huán)保并能產(chǎn)生穩(wěn)定高效植物肥料的特點,已成為病死動物尸體無害化處理的主流方式,也是符合我國養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)狀的合理有效的處理方式之一[1]。但是傳統(tǒng)的堆肥法主要依靠自然界的微生物進行發(fā)酵,發(fā)酵過程受環(huán)境溫度、原材料等因素的影響,發(fā)酵效率太低,且占地面積較大。本研究主要是從傳統(tǒng)病死雞尸體發(fā)酵堆肥中篩選分解蛋白酶的優(yōu)勢微生物,并研究這些微生物的發(fā)酵工藝,將其制備成菌劑,提高病死雞尸體發(fā)酵堆肥的效率。

        1? 材料與方法

        1.1? 樣品? 采用四點取樣法取濰坊市某養(yǎng)雞場病死雞尸體自然發(fā)酵的好氧堆肥升溫期的樣品。

        1.2? 培養(yǎng)基

        1.2.1? 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA):蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化鈉5g,瓊脂粉20g,蒸餾水1000ml,pH7.0。

        1.2.2? 高氏1號培養(yǎng)基:可溶性淀粉20g,氯化鈉0.5g,硝酸鉀1g,三水磷酸氫二鉀0.5g,七水硫酸鎂0.5g,七水硫酸亞鐵0.01g,瓊脂粉20g,蒸餾水1000ml,pH7.5。

        1.2.3? 真菌培養(yǎng)基采用含有氯霉素的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA),青島海博生產(chǎn)。

        1.2.4? 蛋白酶菌株篩選培養(yǎng)基:磷酸二氫鉀0.36g/L,硫酸鎂0.5g/L,氯化鋅0.014g/L,磷酸氫二鈉1.07g/L,氯化鈉0.16g/L,氯化鈣0.002g/L,硫酸亞鐵0.002g/L,干酪素4g/L,胰酪胨0.05g/L,瓊脂粉20g/L,pH6.8~7.0。

        1.3? 試驗材料? 包括豆粕、玉米粉、玉米淀粉、葡萄糖、玉米漿、氯化銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈉等。

        1.4? 試驗設(shè)備? 有干燥箱、滅菌鍋、搖床、培養(yǎng)箱、50L全自動發(fā)酵罐、100~2000L發(fā)酵罐等。

        1.5? 試驗方法

        1.5.1? 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選及分離鑒定? 稱取10g樣品與滅菌的裝有90ml生理鹽水的錐形瓶中,在搖床上充分震蕩30min,采用稀釋涂布平板法將10-4、10-5、10-6三個梯度各100μl分別涂布于NA、高氏1號培養(yǎng)基和PDA平板中。每個梯度做4個重復(fù),NA平板放在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2d,高氏1號培養(yǎng)基平板和PDA平板放在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~4d。然后挑選不同形態(tài)的菌落分別接種至蛋白酶菌株篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng),細菌菌落放在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2d,放線菌和真菌菌落放在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~4d,觀察透明圈。將有透明圈的菌落進一步分離純化,然后進行保存,并將斜面菌種送至鑒定機構(gòu)進行菌種鑒定。

        1.5.2? 解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝的研究

        1.5.2.1? 搖瓶配方試驗? 選擇各種發(fā)酵常用物料,進行搖瓶配方的摸索,通過多次正交試驗,初步確定發(fā)酵配方。

        1.5.2.2? 2000L發(fā)酵罐配方試驗? 在搖瓶配方初步確定的基礎(chǔ)上進行50L發(fā)酵罐小試,然后用100~2000L發(fā)酵罐進行中試,最終確定該菌的發(fā)酵配方。

        1.5.2.3? 100~2000L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝的研究? 對發(fā)酵罐的通風量和轉(zhuǎn)速進行調(diào)整,以促進菌種的快速繁殖。

        2? 結(jié)果與分析

        2.1? 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選及分離鑒定

        2.1.1? 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選? 經(jīng)過多輪篩選,最后只有1#菌株在蛋白酶篩選培養(yǎng)基平板上有透明圈,將1#菌株接種至蛋白酶揺瓶培養(yǎng)基培養(yǎng),檢測發(fā)酵液酶活,平均酶活為2000U/ml,1#菌株在NA平板和蛋白酶篩選平板上的菌落形態(tài)見圖1所示。

        2.1.2? 1#菌株分離鑒定結(jié)果? 經(jīng)過鑒定機構(gòu)的鑒定,1#菌株為解淀粉芽孢桿菌。

        2.2? 解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝的研究

        2.2.1? 揺瓶配方試驗? 通過多次揺瓶實驗,檢測揺瓶菌數(shù)及芽孢率,最后確定該菌種的揺瓶發(fā)酵配方碳源為玉米淀粉、葡萄糖,氮源為豆粕、氯化銨,無機鹽為硫酸鎂、硫酸錳等。

        2.2.2? 2000L發(fā)酵罐配方試驗? 上述揺瓶配方適當增加濃度分別進行50L罐小試,100~2000L發(fā)酵罐中試,多次重復(fù)實驗結(jié)果(取平均值)如表1。

        從表1數(shù)據(jù)可以看出,50L的發(fā)酵配方為搖瓶配方中各組分均增加0.5倍,2000L發(fā)酵罐的發(fā)酵配方為揺瓶配方中的各組分均增加1倍,放罐芽孢數(shù)最高。適當增加揺瓶配方中各組分的濃度有利于提高發(fā)酵的放罐芽孢數(shù),這是因為2000L發(fā)酵罐的溶解氧比50L發(fā)酵罐和三角瓶中的溶解氧效果都好。但是如果配方濃度太大,造成培養(yǎng)基中缺氧,反而容易引起菌體的死亡,不易形成芽孢,影響最終的芽孢數(shù)量。

        2.2.3? 100~2000L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝的研究? 在菌種發(fā)酵過程中,通過提高發(fā)酵罐中的通風量和提高轉(zhuǎn)速,有利于為菌種提供更多的溶解氧,從而促進菌種的快速繁殖,縮短發(fā)酵時間,節(jié)約發(fā)酵成本。表2和表3分別是調(diào)整發(fā)酵罐的通風量和轉(zhuǎn)速對發(fā)酵時間和放罐芽孢數(shù)的影響。

        從表2、表3中可以看出,有效的調(diào)整通風量和發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速,可以明顯縮短菌種的發(fā)酵時間,但是對放罐芽孢數(shù)基本沒有影響。

        3? 結(jié)論與分析

        該研究從濰坊某養(yǎng)雞場尸體堆肥中分離出了一株產(chǎn)蛋白酶酶活較高的解淀粉芽孢桿菌,經(jīng)揺瓶實驗,蛋白酶酶活可達2000U/ml。近年來,有研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌能夠產(chǎn)蛋白酶[2,3],但是大部分都分離自土壤,主要用來做飼料添加劑,用于做尸體發(fā)酵方面的報道很少。

        芽孢是細菌休眠體,產(chǎn)芽孢細菌在營養(yǎng)條件缺乏時,在細胞內(nèi)形成圓形或橢圓形的芽孢休眠體。芽孢含水量極低,抗逆性強,能經(jīng)受高溫、紫外線、電離輻射以及多種化學物質(zhì)滅殺等,條件適宜時,芽孢會重新成為一個細菌[4];由于芽孢較其營養(yǎng)體細胞易保藏、復(fù)活率高,是制備菌粉制劑的理想存在形式,所以本研究通過多次反復(fù)試驗確定了解淀粉芽孢桿菌的2000L發(fā)酵罐的產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基,并對其發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化,縮短了該菌的發(fā)酵時間(由原來的25h縮短為20h),降低了發(fā)酵成本,為以后制備病死雞堆肥發(fā)酵菌劑提供了基礎(chǔ)。

        參考文獻:

        [1]? 續(xù)彥龍,王麗麗,龔改林,等.堆肥法無害化處理染疫動物尸體的研究進展[J].畜牧與獸醫(yī),2015,47(4):138-140.

        [2]? 謝為天,李紅勝,劉穎,等.一株源于紅樹林土壤芽孢桿菌的鑒定及其蛋白酶學性質(zhì)研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2014,41(9):155-158.

        [3]? 付文娟,楊亞晉,王慶,等.高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選及其提高發(fā)酵豆粕肽含量效果研究[J].中國畜牧雜志,2013,49(23):41-46.

        [4]? Higgins D,Dworkin J.Recent progress in Bacillus subtilis sporulation[J].Fems Microbiology Reviews,2012,36(1):131-148.

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