盧銘 王鳳芝 李琪

摘要[目的]探究不同配伍比例刺五加-樹舌靈芝醇提物對小鼠鎮(zhèn)靜催眠作用的影響。[方法]不同配伍比例的刺五加和樹舌靈芝用75%乙醇作為溶劑，料液比為1∶20，利用冷凝回流提取1.5 h后得各配伍比例的乙醇提取物;利用差熱分析儀對得到的不同配伍比例的乙醇提取物進(jìn)行分析;應(yīng)用苯巴比妥鈉所致小鼠睡眠的方法，研究刺五加和樹舌靈芝乙醇提取物改善睡眠的量效關(guān)系。[結(jié)果]差熱分析結(jié)果顯示，刺五加和樹舌靈芝配比為1∶5和5∶1時，2種藥物配伍后的相互作用明顯。鎮(zhèn)靜催眠作用結(jié)果顯示，配伍比例為1∶5、3∶1、4∶1、5∶1小鼠的體重依次顯著增大（P<0.05）;配伍比例為1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、1∶4、1∶5、3∶1、4∶1、5∶1的給藥組抑制小鼠的活動次數(shù)（P<0.05）依次增大;閾下劑量苯巴比妥鈉對小鼠鎮(zhèn)靜催眠試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有給藥組均有鎮(zhèn)靜催眠效果;閾上劑量苯巴比妥鈉對小鼠鎮(zhèn)靜催眠試驗(yàn)結(jié)果顯示，配伍比例為1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、1∶4、1∶5、3∶1、4∶1、5∶1的給藥組鎮(zhèn)靜催眠作用（P<0.05）依次增大。[結(jié)論]刺五加-樹舌靈芝配比為5∶1的醇提物對小鼠的鎮(zhèn)靜催眠作用效果最好，其作用優(yōu)于單味藥刺五加組和單味藥樹舌靈芝組。

關(guān)鍵詞刺五加;樹舌靈芝;翻正反射;醇提物;鎮(zhèn)靜催眠

中圖分類號R285文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）03-0150-04

doi∶10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.048

刺五加是五加科（Araliaceae）五加屬（Acanthopanax）刺五加[Acanthopanax senticosus（Rupr. Maxim.） Harms.]的干燥根及根莖或莖，又名坎拐棒子、一百針、老虎潦，在民間很早就供藥用[1]，具有鎮(zhèn)靜催眠[2]、抗炎[3-4]、抗氧化[5-6]、抗輻射[7]、降糖[8]、抗疲勞[4]、抗缺氧[6]等作用。樹舌為靈芝屬（Ganoderma Karst.） 樹舌靈芝（Ganoderma applanatumn）的子實(shí)體，別名樹舌、平蓋靈芝、扁目靈芝[9]，具有抗氧化[10]、免疫調(diào)節(jié)[11]、抗腫瘤[12-14]、保肝[15]、抗菌[16]等作用。

神經(jīng)衰弱是由于長期處于緊張和壓力下，出現(xiàn)精神易興奮和腦力易疲乏等現(xiàn)象?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無特效藥治療，西藥一般治療效果佳，但有一定副作用。中藥中有許多具有安神功效的藥物，毒副作用小，但需長期服用，療效慢。

樹舌靈芝性涼、刺五加性溫，具有清肝熱、補(bǔ)肝腎的作用。故筆者將二者聯(lián)合使用對鎮(zhèn)靜催眠作用進(jìn)行研究，為得到一種療效好、見效快的鎮(zhèn)靜催眠復(fù)方中藥提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1動物。實(shí)驗(yàn)動物為清潔級健康雄性昆明小鼠156只，體重18～22 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供，合格證書SCXK（黑）-2013-001。分籠飼養(yǎng)小鼠，飼料供給充足、不限飲水，室溫20～25 ℃，適應(yīng)環(huán)境7 d后使用。

1.1.2試材。刺五加根及根莖，采自黑龍江省佳木斯市樺南縣，樹舌靈芝子實(shí)體采自佳木斯市湯原縣大亮子河林場，二者經(jīng)佳木斯大學(xué)王麗紅教授認(rèn)定為五加科五加屬刺五加和靈芝屬樹舌靈芝。二者經(jīng)粉碎機(jī)打磨成粗粉，供試驗(yàn)用。

1.1.3試劑。乙醇，分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;地西泮注射液，批號1610212，天津金耀藥業(yè)有限公司;苯巴比妥鈉注射液，批號17121301，天津金耀藥業(yè)有限公司。

1.1.4儀器與設(shè)備。RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;FA2004分析天平儀，上海越平科學(xué)儀器（蘇州）制造有限公司;YLS-1A多功能小鼠自主活動記錄儀，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司;高溫差熱分析儀，上海精密儀器儀表有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1刺五加-樹舌靈芝提取物的制備。

刺五加和樹舌靈芝按配比1∶1（1號）、1∶2（2號）、1∶3（3號）、1∶4（4號）、1∶5（5號）、5∶1（6號）、4∶1（7號）、3∶1（8號）、2∶1（9號）、刺五加（10號）、樹舌靈芝（11號），精確稱取各配伍比例的刺五加和樹舌靈芝共3.00 g，采用回流提取法，將原料放入500 mL圓底燒瓶中，使用75%乙醇溶液為提取溶劑，料液比1∶20，加入60 mL乙醇，提取時間1.5 h，抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去部分乙醇，再將所得濾液用電熱套和坩堝蒸干溶液。

1.2.2差熱分析測定方法。

此次試驗(yàn)研究不同配比刺五加-樹舌靈芝復(fù)方制劑中活性成分，試驗(yàn)條件差熱量程±5 μV;升溫速率20 K/min;升溫范圍0～200 ℃;氣氛為靜態(tài)空氣;參比物為空坩堝。

1.2.3刺五加-樹舌靈芝對小鼠鎮(zhèn)靜催眠作用的研究。

1.2.3.1刺五加-樹舌靈芝提取物的制備。

刺五加和樹舌靈芝按配比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1精確稱取刺五加-樹舌靈芝共11.25 g，將原料放入500 mL錐形瓶中，使用75%乙醇溶液為提取溶劑，料液比1∶20，加入乙醇225 mL，浸泡24 h后，置于圓底燒瓶中，采用冷凝回流提取法，提取時間1.5 h，抽濾，將所得濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干乙醇后，濃縮至浸膏，用所制備的羧甲基纖維素鈉溶液定容至25 mL容量瓶中，制成濃度為0.45 g/mL的混懸液，以待使用。

1.2.3.2小鼠給藥劑量的計(jì)算。

計(jì)算小鼠給藥劑量，通過人所需給藥劑量折算出小鼠給藥劑量。小鼠的給藥劑量（mg/kg）=W×人的臨床用量（mg/kg）。人的臨床用量為0.5 mg/kg，W=9.01，小鼠給藥劑量4.505 mg/kg，含生藥量為11.25 mg，小鼠體重20 g計(jì)算，給藥劑量0.090 1 mg/只。

1.2.3.3動物分組及給藥方法。

取體重18～22 g昆明小鼠156只，隨機(jī)分為13組，每組12只，分別為空白（生理鹽水）、對照組（羥甲基纖維素鈉）、地西泮陽性對照組（0.15 mg/kg）、1∶1組、1∶2組、1∶3組、1∶4組、1∶5組、5∶1組、4∶1組、3∶1組、2∶1組、刺五加組、樹舌靈芝組。灌胃給藥，每日1次，灌胃劑量為每20 g灌胃0.2 mL。

（1）各給藥組對小鼠體重的影響。按上述分組給藥，連續(xù)給藥7 d，分別記錄每天小鼠體重的變化。

（2）各給藥組對小鼠自主活動次數(shù)的影響。按上述分組給藥，連續(xù)給藥7 d，末次給藥1 h 后，將各組小鼠分別放入自主活動儀暗箱中，適應(yīng)環(huán)境2 min后，記錄各組小鼠5 min 內(nèi)自主活動次數(shù)，比較組間差異。

1.2.3.4不同給藥組對閾上劑量苯巴比妥鈉的小鼠催眠作用的影響。

將78只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為13組，每組6只，分別標(biāo)號為刺五加∶樹舌靈芝1∶1為1號、1∶2為2號、1∶3為3號、1∶4為4號、1∶5為5號、5∶1為6號、4∶1為7號、3∶1為8號、2∶1為9號、刺五加為10號、樹舌靈芝為11號、空白、對照?？瞻捉M給予相同體積的羥甲基纖維素鈉，對照組給予相同劑量的地西泮，連續(xù)灌胃7 d。第7天灌胃后，將13組實(shí)驗(yàn)小鼠皮下注射閾上劑量的苯巴比妥鈉。以小鼠翻正反射消失時間記為睡眠潛伏期，以翻正反射消失的持續(xù)時間記為睡眠時間，分別記錄各組入睡的睡眠潛伏期和睡眠時間。

1.2.3.5不同給藥組對閾下劑量苯巴比妥鈉的小鼠催眠作用的影響。

將78只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為13組，每組6只，分別標(biāo)號為刺五加∶樹舌靈芝1∶1為1號、1∶2為2號、1∶3為3號、1∶4為4號、1∶5為5號、5∶1為6號、4∶1為7號、3∶1為8號、2∶1為9號、刺五加為10號、樹舌靈芝為11號、空白、對照?？瞻捉M給予相同體積的羥甲基纖維素鈉，對照組給予相同劑量的地西泮，連續(xù)灌胃7 d。第7天灌胃后，將13組實(shí)驗(yàn)小鼠皮上注射閾下劑量的苯巴比妥鈉，分別記錄各組入睡的睡眠潛伏期和睡眠時間。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±S表示，組間數(shù)據(jù)運(yùn)用Duncans multiple range test方法進(jìn)行單因素方差分析。根據(jù)P<0.05判斷顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1差熱分析法測定分析刺五加-樹舌靈芝提取物

根據(jù)差熱分析法（DTH）對不同比例刺五加和樹舌靈芝醇提取物反應(yīng)后的放熱情況（圖1）可知，配伍后的藥物曲線和單獨(dú)刺五加、單獨(dú)樹舌靈芝曲線明顯不同，經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)5號、6號曲線變化明顯，混合后的產(chǎn)物在刺五加和樹舌單獨(dú)提取物之間，且二者圖形相近，所產(chǎn)生的物質(zhì)相近，故將二者反應(yīng)后的曲線和單獨(dú)刺五加與樹舌靈芝曲線作為對比。

2.2刺五加-樹舌靈芝對小鼠鎮(zhèn)靜催眠作用研究

2.2.1各給藥組對小鼠體重的影響。

根據(jù)小鼠晝伏夜出的習(xí)性，選擇早上固定時間灌胃給藥，連續(xù)灌胃7 d，并記錄每天的小鼠體重，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

2.2.2各給藥組對小鼠自主活動次數(shù)的影響。從表2可看出，與給藥前相比，給藥后的1號、2號、3號、4號、5號、6號、7號、8號、9號、10號、11號，小鼠的自主活動次數(shù)均比給藥前低。給藥后各給藥組與空白組相比，10號和11號無顯著性差異（P>0.05），6號能顯著減少小鼠的自主活動次數(shù)（P<0.05），其次為7號、8號、9號、3號、4號、5號、1號、2號。結(jié)果見表2。

2.2.3不同給藥組對閾上劑量苯巴比妥鈉鎮(zhèn)靜催眠作用的影響。

觀察記錄各給藥組閾上劑量苯巴比妥鈉對小鼠睡眠潛伏時間和睡眠時間（表3），與空白組比較，各給藥組均縮短了小鼠入睡的潛伏時間。其中6號最顯著（P<0.05），10號和11號對小鼠的潛伏期幾乎沒有影響（P>0.05），其余各組之間差異不大;與空白組比較，6號顯著延長了小鼠睡眠時（P<0.05），10號和11號對小鼠的睡眠時間幾乎沒有影響（P>0.05）。

2.2.4不同給藥組對閾下劑量苯巴比妥鈉鎮(zhèn)靜催眠作用的影響。從表4可看出，與空白組相比，對照組及1號、2號、3號、4號、5號、6號、7號、8號、9號、10號、11號，對閾下劑量苯巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠催眠均表現(xiàn)出協(xié)同作用，且6號小鼠睡眠潛伏期顯著縮短（P<0.05），組間比較顯示，3號、4號、5號、7號、8號之間無顯著性差異（P>0.05），9號、10號、11號、1號、2號之間無顯著性差異（P>0.05）;6號顯著延長小鼠的睡眠時間（P<0.05），組間比較顯示，7號和8號之間無顯著性差異（P>0.05），3號、4號、5號、2號、9號之間無顯著性差異（P>0.05），1號、2號、9號之間無顯著性差（P>0.05），10號和11號之間無顯著性差異（P>0.05）。

3結(jié)論

此次試驗(yàn)將刺五加和樹舌靈芝按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1不同比例配伍，用75%乙醇為溶劑，料液比為1∶20，采用冷凝回流提取法，旋蒸除去多余乙醇，濃縮，提取其有效成分，并與單獨(dú)刺五加和樹舌靈芝提取物進(jìn)行對比，利用差熱分析儀檢測二者混合后是否有新物質(zhì)產(chǎn)生，分析結(jié)果顯示刺五加和樹舌靈芝配比為5∶1和1∶5的效果最為明顯，且兩者所提取的化學(xué)物質(zhì)基本相同，該方法操作簡單、用藥量少，能準(zhǔn)確檢測產(chǎn)物的吸放熱情況，為接下來試驗(yàn)結(jié)果提供依據(jù)。

經(jīng)對不同配伍比例刺五加和樹舌靈芝醇提物對小鼠鎮(zhèn)靜催眠作用的研究，其中包括各給藥組對小鼠行為學(xué)影響的試驗(yàn)、小鼠體重變化情況，苯巴比妥鈉閾上及閾下鎮(zhèn)靜催眠試驗(yàn)，研究其提取物是否對小鼠具有鎮(zhèn)靜催眠效果，小鼠行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示，1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1對小鼠的活動均有抑制效果，組間比較刺五加-樹舌靈芝配比為5∶1組效果最為明顯（P<0.05）;直接睡眠試驗(yàn)結(jié)果顯示，1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1組均有鎮(zhèn)靜作用，但不能致小鼠直接睡眠;苯巴比妥鈉閾下鎮(zhèn)靜催眠試驗(yàn)結(jié)果顯示，1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1能縮短小鼠睡眠潛伏期（P<0.05）及延長小鼠的睡眠時間，組間比較刺五加-樹舌靈芝配比為5∶1組效果最為明顯（P<0.05）;苯巴比妥鈉閾上鎮(zhèn)靜催眠試驗(yàn)結(jié)果顯示，1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1組可延長小鼠的睡眠時間（P<0.05），但是刺五加-樹舌靈芝配比為5∶1組效果最為明顯（P<0.05）。

試驗(yàn)證明刺五加和樹舌靈芝配伍可顯著提高鎮(zhèn)靜催眠效果，刺五加與樹舌靈芝醇提物配比為5∶1時鎮(zhèn)靜催眠效果最為顯著，療效最好，具有開發(fā)新藥的依據(jù)。

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