李佳 周素華 賈娜 劉揚 孫曉東

摘要[目的]杜仲種子由于有膠質果翅包裹，不易出芽，為了解除杜仲種子的休眠、提高發(fā)芽能力，利用不同濃度的赤霉素對杜仲種子進行處理，為其繁殖培育和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。 [方法]觀察不同濃度赤霉素處理后，培養(yǎng)皿培養(yǎng)和土壤培養(yǎng)下杜仲種子的發(fā)芽情況，并對種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、丙二醛含量、呼吸強度、浸泡液電導率進行測定。[結果]隨著赤霉素濃度的上升，杜仲種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在赤霉素濃度為400 mg/L時，發(fā)芽率和發(fā)芽勢最高。培養(yǎng)皿培養(yǎng)的發(fā)芽勢、發(fā)芽率均低于土壤培養(yǎng)，其中，土壤培養(yǎng)種子發(fā)芽率最高達76.7%，而培養(yǎng)皿最高僅50%。此外，隨著赤霉素濃度的上升，丙二醛含量逐漸增加，浸泡液的電導率逐漸下降，種子呼吸強度逐漸減弱。[結論]赤霉素能在一定范圍內打破杜仲種子的休眠，從而促進種子發(fā)芽，并且用土壤培養(yǎng)的方法更適合杜仲種子生長。

關鍵詞杜仲;赤霉素;種子萌發(fā);土壤培養(yǎng)

中圖分類號S567.1+9文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）03-0144-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.046

杜仲（Eucommia ulmoides），又稱膠木，屬杜仲科杜仲屬[1]。杜仲生長在陽光充足、溫暖濕潤的地方，大多分布在我國陜西南邊、四川、云南、貴州等省區(qū)[2]。杜仲在經(jīng)濟和藥用方面的價值都很高[3]，杜仲皮可入藥，其味甘，性溫[4]，可用于治療肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈目眩等，是古代著名藥典的佳品[5]。此外，杜仲葉片提取物也可以入藥[6]。杜仲在生產(chǎn)中一般用種子繁殖，但種子外部的果翅含有杜仲膠[7]，因此，需要滿足一定的條件才會發(fā)芽。

赤霉素是植物生長中常用的一種激素，它能調節(jié)植物生長、影響植物各階段發(fā)育過程，包括促進枝條的生長;打破種子的休眠，促進種子發(fā)芽;使植物提前開花，抑制葉和果實的老化等[8]。在促進種子發(fā)芽方面，對于不同植物，赤霉素的最適濃度不盡相同。對于同一種植物，即使同一赤霉素濃度，使用方法不同，其促進種子發(fā)芽的效果也不一樣。赤霉素濃度不夠或超過適宜濃度，種子感受性低或遭受逆境，都會使種子不能發(fā)芽。該研究試圖通過不同濃度的赤霉素對杜仲種子進行浸種處理，探究赤霉素促進杜仲種子發(fā)芽的最適濃度及其對杜仲種子發(fā)芽的影響。

目前，已有諸多學者對赤霉素促進杜仲種子發(fā)芽的最適濃度以及最適溫度進行了研究，也有去除杜仲種子膠質果翅后進行培養(yǎng)，來提高杜仲種子的發(fā)芽率，但其在去除果翅后，都使用培養(yǎng)皿培養(yǎng)?？紤]到杜仲本身適合生長于山地，且實際生產(chǎn)應用中都是通過大面積土壤培養(yǎng)進行生產(chǎn)。因此該研究通過使用不同濃度赤霉素處理杜仲種子，并將其分別置于培養(yǎng)皿和土壤中進行培養(yǎng)，統(tǒng)計不同濃度下杜仲種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率，測定丙二醛含量、浸泡液電導率、種子呼吸強度，研究不同濃度赤霉素處理對杜仲種子發(fā)芽的影響，探討保持和提高杜仲種子活力適宜的赤霉素濃度，為杜仲種子播種苗提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

杜仲種子于2017年11月采集于陜西省略陽縣，采集后置于冰箱冷藏室保存。

1.2試驗方法

1.2.1種子前處理。采用溫水浸種催芽，即選取顆粒飽滿、新鮮且有光澤的杜仲種子，用溫水清洗，于恒溫培養(yǎng)箱內40 ℃浸種48 h，期間換水1次。種子吸水膨脹后，撈出上浮種子，剩余種子用蒸餾水沖洗干凈。

1.2.2消毒處理。

將清洗干凈的杜仲種子放入0.02%的高錳酸鉀溶液中，浸泡30 min進行滅菌，撈出后用蒸餾水沖洗2次。

1.2.3不同濃度赤霉素處理杜仲種子。

采用去胚乳發(fā)芽法[9]，即將杜仲種子先剝除果翅后，再用鑷子輕輕搗毀種子的一端果翅約1 mm。以蒸餾水浸種催芽作為對照，將去除果翅后的杜仲種子分別置于100、200、300、400、500、600 mg/L的赤霉素溶液中，在常溫下浸種24 h后，取出杜仲種子用蒸餾水清洗3次，分別置于培養(yǎng)皿培養(yǎng)和土壤培養(yǎng)。

1.2.4種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率的測定。

每個赤霉素濃度下選取30粒種子，重復3次，于光照恒溫培養(yǎng)箱25 ℃進行培養(yǎng)。視情況適宜定量噴灑蒸餾水，保持芽床和種子濕潤，每天觀察不同芽床的發(fā)芽情況（當芽長足種子長度的2/3時視為發(fā)芽）。6 d后統(tǒng)計各濃度處理下不同芽床發(fā)芽種子數(shù)量，計算發(fā)芽勢;12 d后統(tǒng)計各濃度處理下發(fā)芽種子數(shù)量，計算發(fā)芽率。

發(fā)芽勢=第6天發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%;

發(fā)芽率=第12天發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%。

1.2.5種子浸泡液電導率、丙二醛含量、呼吸強度的測定。

丙二醛含量的測定用硫代巴比妥酸法[10]。選取經(jīng)過赤霉素處理后的種子，倒入研磨缸充分研磨，加入5 mL 5%的三氯乙酸，取等量的研磨液進行離心，離心后取上清液2 mL，放入試管中，再加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸于試管中，于100 ℃下的恒溫水浴鍋中反應，然后迅速放入常溫水中冷卻，使反應終止，取2 mL放入比色皿，分別在450、523、600 nm處測定吸光度，吸光度的測定用722N可見分光光度計。

電導率的測定：將不同濃度赤霉素浸泡杜仲種子24、36 h的浸泡液過濾到200 mL燒杯中，用ST3100C電導率儀測定電導率。種子呼吸強度的測定用小籃子法[11]。

2結果與分析

2.1赤霉素浸種對杜仲種子萌發(fā)的影響

觀察不同濃度赤霉素處理對杜仲種子發(fā)芽勢的影響，其結果如圖1所示。于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的杜仲種子，赤霉素濃度在0～400 mg/L時，發(fā)芽勢逐漸上升;在400～600 mg/L，隨赤霉素濃度升高，發(fā)芽勢下降明顯，濃度為400 mg/L時，發(fā)芽勢最高，達40.0%。土壤培養(yǎng)基本上與培養(yǎng)皿培養(yǎng)呈現(xiàn)相同的趨勢，即在赤霉素濃度為0～400 mg/L時，隨著赤霉素濃度升高，發(fā)芽勢逐漸上升，大于400 mg/L時，隨赤霉素濃度升高，發(fā)芽勢逐漸下降。該研究結果顯示，經(jīng)土壤培養(yǎng)的杜仲種子發(fā)芽勢基本高于培養(yǎng)皿培養(yǎng)，說明杜仲種子更適合于土壤培養(yǎng)。

不同濃度赤霉素處理杜仲種子的發(fā)芽率如圖2所示。培養(yǎng)皿培養(yǎng)的杜仲種子，在0～400 mg/L時，隨著赤霉素濃度升高，發(fā)芽率逐漸上升，濃度在300、400 mg/L時，種子發(fā)芽率相同且最高，均為50%;在400～600 mg/L時，隨著赤霉素濃度升高，發(fā)芽率明顯下降。土壤培養(yǎng)與培養(yǎng)皿培養(yǎng)呈現(xiàn)了相同的趨勢。土壤培養(yǎng)中，當赤霉素濃度為400 mg/L時，此時杜仲種子的發(fā)芽率最高，為76.7%。培養(yǎng)皿培養(yǎng)與土壤培養(yǎng)2種方法均支持400 mg/L的赤霉素浸種最能促進杜仲種子發(fā)芽。而且，在各個赤霉素濃度下，土壤培養(yǎng)發(fā)芽率均高于培養(yǎng)皿培養(yǎng)，表明土壤培養(yǎng)法更適宜促進杜仲種子發(fā)芽。

2.2赤霉素浸種對杜仲種子丙二醛含量的影響

從圖3可看出，赤霉素處理在濃度0～400 mg/L時，丙二醛含量總體趨勢變化不是很大，只在100和200 mg/L 時稍微有所增加。但當赤霉素濃度為600 mg/L 時，丙二醛含量大幅度提高。在濃度為300、400 mg/L時，與被試濃度范圍內其他濃度下丙二醛含量相比較低，但又高于0 mg/L，結合此濃度下杜仲種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢又最高，說明此時的赤霉素濃度剛好打破種子休眠，而又不破壞種子內部結構，加快種子新陳代謝，促進種子發(fā)芽。當赤霉素濃度高于400 mg/L時，丙二醛含量顯著增加，表明高于此濃度會使杜仲種子遭受逆境傷害，抑制種子活力，降低發(fā)芽率。因此超過400 mg/L的赤霉素浸種處理不再適宜促進杜仲種子發(fā)芽。

2.3赤霉素浸種對杜仲種子浸泡液電導率的影響

不同濃度的赤霉素處理杜仲種子后，浸泡液電導率如圖4所示。赤霉素溶液浸種24 h后，隨赤霉素濃度上升，電導率逐漸上升，表明赤霉素可以打破杜仲種子休眠，引起種子內部活動，從而促進種子發(fā)芽。當赤霉素濃度高于400 mg/L時，電導率大于30 μS/cm，種子發(fā)芽率降低。赤霉素溶液浸泡杜仲種子36 h后，種子浸泡液電導率比浸泡24 h明顯增大，且電導率均大于30 μS/cm，因此，赤霉素浸種時間不易超過24 h，否則會降低種子活力，導致種子不易發(fā)芽。

2.4赤霉素浸種對杜仲種子呼吸強度的影響

呼吸作用是指種子內活的組織在酶的參與下將貯藏的營養(yǎng)物質進行一系列氧化分解，同時釋放能量的過程。一般種子在貯藏期間呼吸強度大，容易發(fā)生劣變，使得種子活力減少。呼吸強度常被作為研究植物生理器官活性的檢測指標。不同濃度赤霉素處理杜仲種子后的呼吸強度如圖5所示。隨著赤霉素濃度上升，釋放二氧化碳的量逐漸降低，杜仲種子的呼吸強度緩慢下降，表明赤霉素浸種對杜仲種子呼吸有抑制作用。

3結論與討論

種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率可以直觀地表示種子的發(fā)芽能力。該研究顯示，當赤霉素濃度為0～400 mg/L時，杜仲種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率隨赤霉素濃度上升而增加;赤霉素濃度為400～600 mg/L時，杜仲種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率隨赤霉素濃度增加而降低。說明赤霉素濃度能在0～400 mg/L打破杜仲種子休眠，對杜仲種子發(fā)芽起促進作用;當赤霉素濃度超過400 mg/L，會抑制杜仲種子發(fā)芽。此外，該研究發(fā)現(xiàn)土壤培養(yǎng)的杜仲種子發(fā)芽效果優(yōu)于培養(yǎng)皿培養(yǎng)，并且土壤培養(yǎng)的杜仲種子株高顯著高于培養(yǎng)皿培養(yǎng)的種子，長勢也優(yōu)于培養(yǎng)皿培養(yǎng)的種子，這可能是由于土壤中含有一定的營養(yǎng)物質，并且土壤會起到一定的保溫作用。

當植物遭受不利環(huán)境脅迫或種子本身衰老時，細胞膜系統(tǒng)會發(fā)生變化[12]，丙二醛是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，因此可用丙二醛含量來表示植物細胞遭受的逆境程度[13]。丙二醛含量的高低，可反映出植物遭受逆境的程度大小。該研究發(fā)現(xiàn)，隨赤霉素濃度增加，丙二醛含量呈先升后降再上升的趨勢，當赤霉素濃度高于400 mg/L時，杜仲種子遭受逆境程度過大，種子內部結構被嚴重破壞，不再促進發(fā)芽，因此超過400 mg/L 的赤霉素濃度不再適宜促進杜仲種子發(fā)芽。

植物細胞膜對維持細胞正常內部結構有保護作用[14]。細胞膜具有選擇透性力[15]，植物在受到外界環(huán)境的影響時，細胞膜會受到損壞，不能再選擇性進行膜內外的物質交換，細胞膜透性增大，內外部的電離子會發(fā)生變化，而導致浸泡液的電導率發(fā)生變化，因此可用浸泡液電導率的大小判斷杜仲種子受到的影響。該研究中，當處理時間為36 h時，各濃度赤霉素處理后的種子浸泡液電導率都在30 μS/cm以上，說明種子受傷害程度較大，活力降低，在試驗中發(fā)芽效果也不明顯。處理時間為24 h，濃度高于400 mg/L時，種子的電導率也高于30 μS/cm，且在600 mg/L時，電導率達40 μS/cm，此時種子基本失去活性，不能再發(fā)芽。因此，赤霉素溶液處理杜仲種子時間應控制在24 h以內，才能有效促進杜仲種子發(fā)芽，達到預期效果，并且赤霉素的濃度應控制在0～400 mg/L。

發(fā)芽勢、發(fā)芽率、種子呼吸強度、丙二醛含量、電導率等都是衡量種子活性的指標[16]，該研究通過觀察杜仲種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、呼吸強度、丙二醛含量、電導率值等，得出赤霉素促進杜仲種子發(fā)芽的最適濃度為400 mg/L。培養(yǎng)皿培養(yǎng)和土壤培養(yǎng)2種方法比較，土壤培養(yǎng)更適合于促進杜仲種子發(fā)芽。

參考文獻

[1] 杜竹靜，劉鴻巖.杜仲種子繁殖栽培技術[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（3）：47.

[2] CHEN W D，PENG P H，LI X W，et al.The geochemical features of genuine Eucommia ulmoides Oliv.producing area in longmen mountains[J].Medicinal plant，2013，4（5）：79-82.

[3] OPENSHAW K.A review of Jatropha curcas：An oil plant of unfulfilled promise[J].Biom Bioener，2000，19：1-15.