萬宇平 吳小勝 賈芳芳

摘要通過沙丁胺醇與對氨基苯甲酸反應(yīng)，制備出沙丁胺醇免疫磁珠分離富集試劑盒，試劑盒對樣品中沙丁胺醇的捕獲量為20 ng/mL，與沙丁胺醇結(jié)構(gòu)或者功能相似的競爭藥物：克侖特羅、萊克多巴胺、苯乙醇胺A、溴氯布特羅、溴布特羅、特布他林、羥甲基沙丁胺醇、西馬特羅、妥布特羅、馬噴特羅、賽布特羅、克侖潘特、奇帕特羅、噴布特羅、克侖丙羅、馬布特羅、氯丙那林等17種藥物進(jìn)行特異性反應(yīng)時，均無交叉反應(yīng)。

關(guān)鍵詞沙丁胺醇;單克隆抗體;免疫磁珠分離富集試劑盒

中圖分類號S859.79文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）03-0137-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.043

沙丁胺醇（Salbutamol，SAL）是一種選擇性β2受體激動劑，該種藥物具有擴張支氣管的作用，因此，醫(yī)療上常常用來治療喘息性支氣管炎、支氣管哮喘等疾病。除了能夠擴張支氣管，沙丁胺醇還能促進(jìn)動物骨骼肌生長、減少蓄積脂肪，一些養(yǎng)殖場非法將沙丁胺醇添加到動物飼料中，用來提高其瘦肉率。在人食用高含量沙丁胺醇的動物源性食品后，會出現(xiàn)惡心、嘔吐、肌肉疼痛等癥狀[1-6]。我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》中明確規(guī)定：沙丁胺醇等β-興奮劑類藥物禁用于所有食品動物。

目前，檢測沙丁胺醇?xì)埩舻姆椒ㄖ饕幸合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等。上述方法對樣本進(jìn)行提取純化時，需要色譜柱等凈化裝置，這些裝置不僅操作較為繁瑣，而且價格較為昂貴[7-10]。沙丁胺醇免疫磁珠通過內(nèi)含四氧化三鐵的納米磁珠表面修飾官能團與沙丁胺醇抗體結(jié)合，在外加磁場作用下，從混合溶液中富集、分離沙丁胺醇，操作步驟簡單，試驗成本較低。該研究利用免疫磁珠分離技術(shù)檢測動物尿液和動物組織中的沙丁胺醇?xì)埩袅?，為致力于食品安全檢測的基層實驗室提供檢測方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品 CAS：1219798-60-3，購自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心;氨基苯甲酸、乙酸乙酯、甲醇、鹽酸、牛血清白蛋白、魯米諾，購自北京百欣試劑公司;豬尿和豬肉，市售;小鼠脾細(xì)胞、沙丁胺醇?xì)埩裘嘎?lián)免疫檢測試劑盒（以下簡稱“ELISA試劑盒”），產(chǎn)自北京勤邦生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

MX-F渦旋儀：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司;MK3酶標(biāo)儀：上海雷勃分析儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1制備抗原。

1.3.1.1半抗原的制備。

取0.5 g對氨基苯甲酸，加入到300 μL 1mol/L鹽酸溶液中，再加入4 mL蒸餾水稀釋，冷卻至0 ℃并攪拌，加入0.23 g亞硝酸鈉，繼續(xù)攪拌2 h，得到重氮鹽溶液。取0.7 g沙丁胺醇，用甲醇溶解，向其中加入0.21 g氫氧化鈉，攪拌，加入重氮鹽溶液，繼續(xù)攪拌4 h，停止反應(yīng)，加入稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0，加乙酸乙酯萃取，分去水相，將有機相蒸干，加入乙醚重結(jié)晶得到沙丁胺醇半抗原產(chǎn)物0.61 g，收率為87%，沙丁胺醇半抗原的合成路線見圖1。

1.3.1.2免疫原的制備。

取9 mg沙丁胺醇半抗原，溶解于1 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中;取30 mg二氯乙烷（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）用0.2 mL水充分溶解后，加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24 h，即可得到反應(yīng)液A;稱取牛血清白蛋白（BSA）50 mL，使之充分溶解在3.8 mL pH 7.2的磷酸鹽緩沖液中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到BSA溶液中，并于室溫下攪拌24 h;用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液于4 ℃透析3 d，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，得到沙丁胺醇免疫原;分裝，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2制備單克隆抗體、偶聯(lián)單抗的磁珠。

將“1.3.1”得到的沙丁胺醇免疫原依次進(jìn)行動物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞篩選、單克隆抗體制備等操作[16]，最終得到沙丁胺醇單克隆抗體。

將10 μg沙丁胺醇單克隆抗體溶解到60 μL、pH 5.0、0.25 mmol/L的2-（N-嗎啉）乙磺酸一水合物（MES）中，向其中加入5 mg活化的磁珠，并用上述濃度MES溶液調(diào)節(jié)總體積至100 μL，輕輕混勻磁珠與沙丁胺醇單克隆抗體;室溫下偶聯(lián)30 min，可利用渦旋儀使磁珠保持混勻狀態(tài);離心管置于磁分離架上進(jìn)行磁分離5 min，移除上清液;為了淬滅未反應(yīng)的-COOH，可加入100 μL，pH 7.2～7.6的三羥甲基氨基甲烷（TRIS）反應(yīng)封閉磁珠;用100 μL、0.2%BSA、0.1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液清洗封閉好的磁珠3～5次，將磁珠復(fù)溶于含0.3%的BSA、0.08%吐溫-20/0.02%NaN5的磷酸鹽緩沖液中，于2～8 ℃保藏。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。

1.3.3試劑盒對樣本中沙丁胺醇的分離富集方法。

1.3.3.1取溶于偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠復(fù)溶液0.1 mL于10 mL離心管中，用5 mL去離子水潤洗磁珠1～2次，將離心管在磁鐵上靜置2～3 min，確保磁珠全部吸附在磁鐵上，每次用磁鐵分離磁珠和洗液。

1.3.3.2將尿液樣本5mL加入到裝有潤洗好的偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠的10 mL離心管中，混勻，室溫下反應(yīng)20 min，或者將動物組織樣本用均質(zhì)器均質(zhì)后，稱取5.0樣本至樣本瓶中，分別加入1.5 g氯化鈉、20 mL 50%甲醇溶液，用渦旋儀渦旋5 min，室溫下3 000 r/min離心5 min，吸取5 mL離心上清液，加入5mL去離子水，混勻，吸取離心上清液與去離子水的混合液5 mL與偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠混勻，在室溫下反應(yīng)20 min。

1.3.3.3反應(yīng)完成后，用磁鐵分離磁珠，用5 mL去離子水清洗磁珠，清洗2次。

1.3.3.4將1 mL甲醇加入到裝有經(jīng)過步驟（3）清洗過的磁珠的10 mL離心管中，混勻，靜置1 min，用磁鐵分離磁珠，回收甲醇溶液，用于檢測分析。

1.3.4試劑盒的捕獲量和回收率測定方法。

試劑盒的捕獲量指每毫克偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠可以捕獲沙丁胺醇的最大量。

制備沙丁胺醇濃度分別為10、15、20、25、30 ng/mL的樣本溶液，每份豬尿、豬肉樣本溶液為1 mL，取沙丁胺醇單克隆抗體免疫磁珠0.1mL分別加入至上述樣本中，用試劑盒進(jìn)行樣本中沙丁胺醇的分離和富集，并用ELISA試劑盒對用偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠處理過樣本進(jìn)行檢測。

1.3.5試劑盒的特異性測定方法。

以沙丁胺醇作為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)沙丁胺醇的交叉反應(yīng)率為100%，用于試劑盒交叉反應(yīng)性研究的藥物均為與沙丁胺醇結(jié)構(gòu)或者功能相似的競爭藥物：克侖特羅、萊克多巴胺、苯乙醇胺A、溴氯布特羅、溴布特羅、特布他林、羥甲基沙丁胺醇、西馬特羅、妥布特羅、馬噴特羅、賽布特羅、克侖潘特、奇帕特羅、噴布特羅、克侖丙羅、馬布特羅、氯丙那林。豬尿、豬肉樣本中分別添加上述18種藥物（包括沙丁胺醇）濃度為20 ng/mL，按照試劑盒步驟操作，對樣本中沙丁胺醇進(jìn)行分離富集后，利用ELISA試劑盒方法對樣本進(jìn)行檢測。

2結(jié)果與分析

2.1試劑盒的捕獲量

由表1可知，樣本中沙丁胺醇濃度為10、15、20 ng/mL時，經(jīng)沙丁胺醇免疫磁珠分離富集試劑盒對樣本中沙丁胺醇分離富集后，再經(jīng)ELISA試劑盒進(jìn)行檢測，得出沙丁胺醇添加回收率范圍為93.5%～98.5%;樣本中沙丁胺醇濃度為25、30 ng/mL時，得出沙丁胺醇添加回收率范圍為65.0%～76.8%，表明沙丁胺醇免疫磁珠分離富集試劑盒對樣品中沙丁胺醇的捕獲量為20 ng/mL。

2.2特異性

從表2可以看出，試劑盒對沙丁胺醇具有較高的特異性，對與沙丁胺醇結(jié)構(gòu)或者功能相似的競爭藥物均無交叉反應(yīng)。

3結(jié)論與討論

目前，在檢測方法中，一般都需要對目標(biāo)物進(jìn)行前處理，達(dá)到分離富集的作用。較常用的前處理凈化裝置，包括C18柱、石墨化碳固相萃取柱、硅土固相萃取柱、硅膠SPE固相萃取柱等[11-22]。以上凈化裝置費用較高，不適于基層實驗室大量使用。該研究的沙丁胺醇免疫磁珠分離富集試劑盒價格合適，用于后期檢測的靈敏度也較好。

該研究制備了抗沙丁胺醇單克隆抗體，并研發(fā)出沙丁胺醇免疫磁珠分離富集試劑盒，試劑盒對樣品中沙丁胺醇的捕獲量為20 ng/mL，與沙丁胺醇結(jié)構(gòu)或者功能相似的競爭藥物：克侖特羅、萊克多巴胺、苯乙醇胺A、溴氯布特羅、溴布特羅、特布他林、羥甲基沙丁胺醇、西馬特羅、妥布特羅、馬噴特羅、賽布特羅、克侖潘特、奇帕特羅、噴布特羅、克侖丙羅、馬布特羅、氯丙那林等17種藥物進(jìn)行特異性反應(yīng)時，均無交叉反應(yīng)，說明試劑盒對沙丁胺醇具有較高的特異性。

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