嚴曉云 石紅璆 查代明 余甜甜 張炳火

摘要[目的]研究沙雷氏菌JXJ-54胞外脂肪酶的產(chǎn)酶條件以及粗酶酶學性質(zhì)。[方法]以沙雷氏菌JXJ-54為出發(fā)菌株，采用單因素分析優(yōu)化其產(chǎn)胞外脂肪酶的條件并對該酶進行酶學性質(zhì)研究。[結果]該菌株的最佳產(chǎn)酶條件為牛肉浸膏10 g/L、K2HPO4 2 g/L、菜籽油乳化液體積分數(shù)2.25%，初始pH 9.0、培養(yǎng)溫度20 ℃、裝樣量40 mL、接種量2%、發(fā)酵時間20 h。JXJ-54脂肪酶的最適底物為對硝基苯酚辛酸酯和對硝基苯酚葵酸酯，在30 ℃、pH 8.5～9.5時酶活力最高，且具有一定的熱穩(wěn)定性和較好的pH穩(wěn)定性;酶樣品受到多數(shù)供試金屬離子和EDTA的抑制，在供試表面活性劑和有機溶劑中具有良好耐受性，甚至處于激活狀態(tài)。[結論]該菌株能利用簡單的發(fā)酵培養(yǎng)基達到較好的產(chǎn)酶效果，其所產(chǎn)胞外脂肪酶為低溫堿性脂肪酶，具有一定的熱穩(wěn)定性和較好的pH穩(wěn)定性，在供試表面活性劑和有機溶劑中具有良好的耐受性，在食品加工、洗滌劑、低溫環(huán)境修復等低溫堿性環(huán)境的工業(yè)領域中有一定的應用潛力。

關鍵詞低溫堿性脂肪酶;有機溶劑耐受性;表面活性劑耐受性;沙雷氏菌屬

中圖分類號Q815文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）03-0076-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.025

脂肪酶（triacylglycerol acylhydrolases，EC 3.1.1.3）廣泛存在于動植物和微生物中，既能在油水界面上催化?；视退猓帜茉谖⑺嗷蚍撬嘀写呋D(zhuǎn)酯、酯化、氨解、醇解、酸解等多種化學反應，且催化反應具有良好的化學選擇性、區(qū)域選擇性和/或立體選擇性[1]。微生物脂肪酶具有資源豐富、催化活性多樣、穩(wěn)定性高、工業(yè)生產(chǎn)適用性好等優(yōu)點，已成為工業(yè)用脂肪酶的主要來源，廣泛應用于食品、洗滌劑、飼料、生物能源、精細化工、醫(yī)藥等領域[2-3]。

有機溶劑耐受性是評價脂肪酶性能的重要指標，也是脂肪酶資源挖掘的熱點方向。雖然關于有機溶劑耐受性脂肪酶的研究報道較多[4-6]，但是從沙雷氏菌屬（Serratia）細菌中篩選出有機溶劑耐受性脂肪酶的研究報道較少。Zhao等[7]對粘質(zhì)沙雷氏菌（S. marcescens）ECU1010胞外脂肪酶進行了純化，并對該純酶進行了酶學性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)該脂肪酶具有良好的有機溶劑耐受性，這是首次關于沙雷氏菌脂肪酶具有有機溶劑耐受性的研究報道。朱綺霞等[8]在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中高效表達了粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶LipA，酶學性質(zhì)表明LipA對一些有機溶劑有較好的耐受性。司冠儒[9]從土壤中篩選出一株脂肪酶活力較高的粘質(zhì)沙雷氏菌JNS3-9，通過PCR技術克隆了其脂肪酶基因lipA，并在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）168中實現(xiàn)了高效表達，酶學性質(zhì)表明LipA對有機溶劑有一定的耐受性。Ugur等[10]從生乳中篩選出一株產(chǎn)脂肪酶的格氏沙雷氏菌（S. grimesii）RB06-22，對部分純化后的胞外脂肪酶進行了酶學性質(zhì)研究，結果表明該脂肪酶對一些有機溶劑有一定的耐受性，其中正己烷對該酶有強烈的激活作用。李婧玒等[11]克隆了源于北極凍土沙雷氏菌BOB的脂肪酶基因lip18，并在大腸桿菌BL21（DE3）中實現(xiàn)了活性表達，酶學性質(zhì)表明Lip18具有較好的有機溶劑耐受性。García-Silvera等[12]從石油污染的土壤中篩選出一株產(chǎn)脂肪酶的粘質(zhì)沙雷氏菌SM3，甲磺酸乙酯誘變處理后獲得了一株產(chǎn)脂肪酶活力較高的突變株SMRG4，其胞外脂肪酶具有良好的有機溶劑耐受性。筆者以沙雷氏菌JXJ-54為對象，研究其胞外脂肪酶的產(chǎn)酶條件以及粗酶酶學性質(zhì)，旨在為進一步應用提供理論基礎和技術指導。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。沙雷氏菌JXJ-54，前期分離并用甘油管保藏于超低溫冰箱中。

1.1.2

培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：蛋白脈10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，自然pH，固體培養(yǎng)基另加瓊脂條18 g/L;基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糖5 g/L、蛋白胨10 g/L、K2HPO4 2 g/L、MgSO4 0.5 g/L、大豆油乳化液體積分數(shù)2%，pH 7.0。大豆油乳化液：大豆油與體積分數(shù)2%的PVA按1∶3的比例混合，10 000 r/min乳化10 min即可。

1.2方法

1.2.1

脂肪酶活力的測定。挑取生長于LB固體培養(yǎng)基上的沙雷氏菌JXJ-54單菌落，接種到4 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)過夜，然后以2%的接種量接種于20 mL基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min發(fā)酵24 h;所有發(fā)酵液于4 ℃、4 500 r/min離心15 min，所得上清液即為胞外脂肪酶粗酶，酶活力測定參考文獻[6]。

1.2.2培養(yǎng)基的優(yōu)化。

1.2.2.1碳源。在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上改變碳源組成，按照上述條件進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定脂肪酶活力以確定碳源對產(chǎn)酶的影響，對照組不添加碳源，其酶活力設為100%。

1.2.2.2氮源。在上述優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎上改變氮源組成，按照上述條件進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定脂肪酶活力以確定氮源對產(chǎn)酶的影響，對照組不添加氮源，其酶活力設為100%;分別添加7.50、8.75、10.00、11.25、12.50 g/L最佳氮源以確定其添加量對產(chǎn)酶的影響，最佳組的酶活力設為100%。

1.2.2.3

金屬離子。在上述優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎上改變金屬離子的組成，按照上述條件進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定脂肪酶活力以確定金屬離子對產(chǎn)酶的影響，對照組不添加金屬離子，其酶活力設為100%。

1.2.2.4

誘導劑。在上述優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎上改變油脂誘導劑的組成，按照上述條件進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定脂肪酶活力以確定誘導劑對產(chǎn)酶的影響，對照組不添加誘導劑，其酶活力設為100%;分別添加2.00%、2.25%、2.50%、2.75%、300%最佳誘導劑以確定其添加量對產(chǎn)酶的影響，最佳組的酶活力設為100%。

1.2.3

發(fā)酵條件的優(yōu)化。

1.2.3.1

初始pH。采用優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，在初始發(fā)酵條件的基礎上改變初始pH進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定脂肪酶活力以確定發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH對產(chǎn)酶的影響，最佳組的酶活力設為100%。

1.2.3.2

溫度。采用優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，在上述優(yōu)化發(fā)酵條件的基礎上改變溫度進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定脂肪酶活力以確定發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響，最佳組的酶活力設為100%。

1.2.3.3

裝樣量。采用優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，在上述優(yōu)化發(fā)酵條件的基礎上改變250 mL三角燒瓶中的培養(yǎng)基體積進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定脂肪酶活力以確定裝樣量對產(chǎn)酶的影響，最佳組的酶活力設為100%。

1.2.3.4

接種量。采用優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，在上述優(yōu)化發(fā)酵條件的基礎上改變種子液的接種量進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定脂肪酶活力以確定接種量對產(chǎn)酶的影響，最佳組的酶活力設為100%。

1.2.3.5

發(fā)酵時間。采用優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，在上述優(yōu)化發(fā)酵條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)，分別在不同時間段取樣進行脂肪酶活力測定以確定發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響，最佳組的酶活力設為100%。

1.2.4酶學性質(zhì)研究。

1.2.4.1底物特異性。以對硝基苯酚乙酸酯、對硝基苯酚丁酸酯、對硝基苯酚辛酸酯、對硝基苯酚葵酸酯、對硝基苯酚月桂酸酯、對硝基苯酚豆蔻酸酯和對硝基苯酚棕櫚酸酯為底物，分別測定脂肪酶活力以確定底物對酶活力的影響，最高酶活力設為100%。

1.2.4.2

溫度對酶活力的影響。在最適底物條件下，分別測定不同反應溫度（20～55 ℃）下的脂肪酶活力以確定反應溫度對酶活力的影響，最高酶活力設為100%。不同溫度（30～60 ℃）下溫浴處理酶樣品，1 h后分別測定脂肪酶活力以確定其熱穩(wěn)定性，處理前的酶活力設為100%。

1.2.4.3

pH對酶活力的影響。在最適底物、溫度條件下，分別在Na2HPO4-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 5.0～8.0）和Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 8.0～10.5）中測定脂肪酶活力以確定反應pH對酶活力的影響，最高酶活力設為100%。在不同pH緩沖液中28 ℃搖床處理酶樣品，1 h后測定脂肪酶活力以確定其pH穩(wěn)定性，pH 7.0組的酶活力設為100%。

1.2.4.4

金屬離子和EDTA對酶活力的影響。酶樣品中分別加入NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、MnCl2、ZnCl2、CuCl2、FeCl3和EDTA，使其終濃度為10 mmol/L，將加入等量雙蒸水的酶樣品設為對照組，28 ℃搖床處理1 h后，分別測定脂肪酶活力以確定金屬離子和EDTA對酶活力的影響，對照組的酶活力設為100%。

1.2.4.5

表面活性劑對酶活力的影響。酶樣品中分別加入SDS、CTAB和Triton X-100，使其終濃度為0.10%，加入等量雙蒸水的酶樣品設為對照組，28 ℃搖床處理1 h后，分別測定脂肪酶活力以確定表面活性劑對酶活力的影響，對照組的酶活力設為100%。

安徽農(nóng)業(yè)科學2019年

1.2.4.6

有機溶劑對酶活力的影響。酶樣品中分別加入異丙醇、甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷和正己烷，使其體積分數(shù)分別為10%～50%，加入等量雙蒸水的酶樣品設為對照組，28 ℃搖床處理1 h后，分別測定脂肪酶活力以確定有機溶劑對酶活力的影響，對照組的酶活力設為100%。

1.2.5

數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)來自3次獨立重復試驗，以平均數(shù)±標準差表示。

2結果與分析

2.1培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1碳源。由圖1可知，葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖均顯著抑制菌株JXJ-54產(chǎn)酶，其中蔗糖的抑制作用最強。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基中無需額外添加碳源。這些碳源的存在不利于菌株JXJ-54產(chǎn)脂肪酶，可能是由于它們的分解代謝物抑制脂肪酶基因的表達。

2.1.2

氮源。由圖2A可知，硝酸鈉、尿素、酵母提取物、牛肉浸膏、蛋白胨均顯著促進菌株JXJ-54產(chǎn)酶，其中牛肉浸膏的促進作用最強，因此選擇牛肉浸膏作為該菌株產(chǎn)酶的最佳氮源。由圖2B可知，牛肉浸膏加入量為10 g/L時，菌株的產(chǎn)酶活力最強，因此選擇該濃度為牛肉浸膏的最適加入量。

2.1.3金屬離子。由圖3可知，供試金屬離子均不同程度地抑制菌株JXJ-54產(chǎn)酶，其中Cu2+、Mg2+、Fe3+顯著抑制菌株產(chǎn)酶，而Ca2+、Mn2+的抑制作用沒有顯著性。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基中無需額外添加金屬離子。

2.1.4誘導劑。由圖4A可知，供試油脂乳化液作為誘導劑顯著促進菌株JXJ-54產(chǎn)酶，其中菜籽油的促進作用最強，其次為葵花籽油、玉米油、芝麻油、花生油和大豆油，但是它們之間的促進作用沒有顯著差異，因此選擇菜籽油乳化液作為該菌株產(chǎn)酶的最佳誘導劑。與不添加誘導劑的對照組相比，各誘導劑組的脂肪酶活力只增加了20%～29%，這可能是由于誘導劑為菌株JXJ-54提供了額外的碳源所致，說明該菌株可能是組成型表達胞外脂肪酶。由圖4B可知，菜籽油乳化液加入量為2.25%時，菌株產(chǎn)酶活力最強，因此選擇該體積分數(shù)為菜籽油乳化液的最適加入量。

2.2發(fā)酵條件的確定

2.2.1初始pH。由圖5可知，菌株JXJ-54在初始pH為40～10.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中具有較高的產(chǎn)酶活力，其中初始pH為9.0時菌株產(chǎn)酶活力最高，因此選擇9.0為該菌株產(chǎn)酶的最佳初始pH。

2.2.2溫度。由圖6可知，發(fā)酵溫度對菌株JXJ-54產(chǎn)酶的影響較大，發(fā)酵溫度為20 ℃時菌株產(chǎn)酶活力最高，因此選擇20 ℃為該菌株產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵溫度。

2.2.3

裝樣量。由圖7可知，裝樣量對菌株JXJ-54產(chǎn)酶的影響不大，裝樣量為30 mL時菌株產(chǎn)酶活力最高，由于裝樣量為30 mL與40 mL時的酶活力沒有顯著差異，因此選擇40 mL為該菌株產(chǎn)酶的最佳裝樣量。

2.2.4

接種量。由圖8可知，接種量對菌株JXJ-54產(chǎn)酶的影響較大，隨著接種量的增加，菌株產(chǎn)酶活力逐漸增高，接種量為2%時產(chǎn)酶活力達到最高，隨后緩慢下降，因此選擇2%為該菌株產(chǎn)酶的最佳接種量。

2.2.5

發(fā)酵時間。由圖9可知，發(fā)酵時間是影響菌株JXJ-54產(chǎn)酶的關鍵因素之一，隨著發(fā)酵時間的延長，菌株產(chǎn)酶活力迅速增高，12 h達到產(chǎn)酶的穩(wěn)定期，24 h達到產(chǎn)酶的峰值，隨后逐漸下降。由于20 h的酶活力與24 h相比沒有顯著差異，因此選擇20 h為該菌株產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵時間。

2.3酶學性質(zhì)研究

2.3.1

底物特異性。由圖10可知，JXJ-54脂肪酶特異性水解中鏈對硝基苯酚酯，其最適底物為對硝基苯酚辛酸酯和對硝基苯酚葵酸酯，與其他沙雷氏菌屬脂肪酶的底物特異性存在較大的差異[7，11，13]。

2.3.2

溫度對酶活力的影響。由圖11A可知，JXJ-54脂肪酶的最適反應溫度為30 ℃，20 ℃時其酶活力較低，保持在45%，而25～55 ℃時其酶活力較高，均保持在85%以上。由圖11B可知，酶樣品在30～60 ℃下溫浴1 h后，其殘余酶活力急劇下降，50～60 ℃的殘余酶活力只有溫浴處理前的20%左右。JXJ-54脂肪酶的溫度特性與Lip18脂肪酶類似[11]。一般來說，最適反應溫度低于40 ℃的酶屬于低溫酶，且具有一定的熱穩(wěn)定性[14]。因此，JXJ-54脂肪酶為低溫脂肪酶，在30～40 ℃時具有較好的熱穩(wěn)定性，這對該酶應用于生物轉(zhuǎn)化領域非常有利，特別是食品加工和油脂加工領域[15]。

2.3.3pH對酶活力的影響。由圖12A可知，JXJ-54脂肪酶

的最適反應pH為8.5～9.5，pH 8.0～10.0時其酶活力保持在70%以上，pH低于8.0或高于10.0時其酶活力急劇下降。由圖12B可知，酶樣品在不同pH緩沖液（5.0～10.5）中28 ℃處理1 h后，其殘余酶活力均保持在80%以上。JXJ-54脂肪酶的pH特性與RB06-22脂肪酶和SMRG4脂肪酶類似[10，12]。綜上，JXJ-54脂肪酶為低溫堿性脂肪酶，具有較寬的最適反應pH和較好的pH穩(wěn)定性，在低溫堿性環(huán)境的工業(yè)領域具有較大的應用潛力，比如洗滌劑配方和低溫環(huán)境修復。

2.3.4

金屬離子和EDTA對酶活力的影響。由圖13可知，金屬離子和EDTA對JXJ-54脂肪酶活力具有不同的影響，K+和Mg2+對酶活力具有顯著激活作用，Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+和EDTA對酶活力具有顯著抑制作用，Na+對酶活力沒有顯著作用。由EDTA抑制酶活力可知，JXJ-54脂肪酶為金屬酶，其催化活性需要一定的金屬離子參與。一般來說，Ca2+和Mn2+對脂肪酶活力具有激活作用，但它們卻抑制JXJ-54脂肪酶活力，與LipA脂肪酶和RB06-22脂肪酶相反[8，10]，與Lip42脂肪酶、UD-8脂肪酶和CICC1368脂肪酶類似[16-18]。

2.3.5

表面活性劑對酶活力的影響。由圖14可知，表面活性劑對JXJ-54脂肪酶活力具有不同的影響，陽離子表面活性劑CTAB顯著激活酶活力，而陰離子表面活性劑SDS和非離子表面活性劑Triton X-100對酶活力沒有顯著影響，與RB06-22脂肪酶和SMRG4脂肪酶類似[10，12]。可見，JXJ-54脂肪酶在供試表面活性劑中具有良好的耐受性，在洗滌劑配方中可能具有應用潛力。

2.3.6

有機溶劑對酶活力的影響。由表1可知，有機溶劑對JXJ-54脂肪酶活力的影響與其lg P值有關。當lg P < 0時，除甲醇和乙醇外，酶活力隨著有機溶劑體積分數(shù)的增大而降低，10%～30%甲醇、10%乙腈和30%乙醇對酶活力具有顯著激活作用，30%～50%異丙醇、50%甲醇、30%～50%乙腈、50%乙醇和30%～50%丙酮對酶活力具有顯著抑制作用，10%異丙醇、10%乙醇和10%丙酮對酶活力沒有顯著影響。當lg P > 0時，酶活力隨著有機溶劑體積分數(shù)的增大而增強，30%～50%乙酸乙酯、30%～50%三氯甲烷和50%正己烷對酶活力具有顯著激活作用，10%乙酸乙酯對酶活力具有顯著抑制作用，10%三氯甲烷和10%～30%正己烷對酶活力沒有顯著影響?？傊?，JXJ-54脂肪酶具有良好的有機溶劑耐

受性，這一現(xiàn)象在其他沙雷氏菌屬脂肪酶中也有報道[7-12]。脂肪酶在有機溶劑中呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定性，使其在基于非水相或微水相催化反應的應用領域具有巨大的潛力，比如食品、油脂、新型材料、精細化工、醫(yī)藥、化妝品、生物能源等[19]。

3結論

通過單因素分析，確定出沙雷氏菌JXJ-54產(chǎn)胞外脂肪酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為牛肉浸膏10 g/L、K2HPO4 2 g/L、菜籽油乳化液體積分數(shù)2.25%，最佳發(fā)酵條件為初始pH 9.0、培養(yǎng)溫度20 ℃、裝樣量40 mL、接種量2%、發(fā)酵時間20 h?？傊?，該菌株能夠利用簡單的發(fā)酵培養(yǎng)基達到較好的產(chǎn)酶效果。

從底物、溫度、pH、金屬離子、EDTA、表面活性劑、有機溶劑等方面研究了沙雷氏菌JXJ-54所產(chǎn)胞外脂肪酶粗酶的酶學性質(zhì)。該酶對中鏈對硝基苯酚酯有最大水解活力，最適底物為對硝基苯酚辛酸酯和對硝基苯酚葵酸酯;在30 ℃、pH 8.5～9.5時酶活力最高，且具有較好的溫度（30～40 ℃）和pH（5.0～10.5）穩(wěn)定性;K+和Mg2+對酶活力具有顯著激活作用，Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+和EDTA對酶活力具有顯著抑制作用，Na+對酶活力沒有顯著作用;陽離子表面活性劑CTAB顯著激活酶活力，而陰離子表面活性劑SDS和非離子表面活性劑Triton X-100對酶活力沒有顯著影響;酶樣品在不同體積分數(shù)的異丙醇、甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷和正己烷中具有良好耐受性，甚至處于激活狀態(tài)?？傊琂XJ-54脂肪酶為低溫堿性脂肪酶，具有一定的熱穩(wěn)定性和較好的pH穩(wěn)定性，在供試表面活性劑和有機溶劑中具有良好的耐受性。

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