歐陽劍 吳席 徐杰娜 樊婷婷

摘要[目的]進(jìn)一步驗(yàn)證MYB4基因在響應(yīng)干旱脅迫中的應(yīng)答功能，構(gòu)建ProMYB4：GUS載體，通過篩選鑒定獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株。[方法]以野生型擬南芥植株的全基因組為模板，利用特異性引物擴(kuò)增MYB4基因啟動(dòng)子，將目的基因連接到pART27載體上。然后將構(gòu)建成功的重組載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101，浸花法轉(zhuǎn)化野生型植株。最后通過抗性篩選和PCR鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株。[結(jié)果] MYB4啟動(dòng)子成功克隆，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過比對(duì)完全正確?？剐院Y選獲得了陽性轉(zhuǎn)基因植株。[結(jié)論]成功獲得ProMYB4：GUS陽性轉(zhuǎn)基因植株，為進(jìn)一步研究MYB4基因功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞擬南芥;MYB4基因;MYB4啟動(dòng)子;轉(zhuǎn)基因植株

中圖分類號(hào)Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）03-0082-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.026

由于氣候變化，干旱已經(jīng)成為當(dāng)今世界亟待解決的重大環(huán)境問題之一[1-2]。干旱對(duì)植物的生長發(fā)育有著巨大影響，會(huì)直接導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量急劇降低，嚴(yán)重影響人類的生存質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)發(fā)展[3-4]。探索抗旱相關(guān)基因的功能及其對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制具有重大的理論意義和實(shí)踐價(jià)值[5]。尋找提高植物抗旱關(guān)鍵性基因并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)植物品種進(jìn)行改良是解決上述問題的有效途徑之一[6]。研究發(fā)現(xiàn)MYB4基因?qū)χ参锟购灯鹬P(guān)鍵性作用[7-8]。筆者擬通過克隆MYB4啟動(dòng)子，構(gòu)建ProMYB4：GUS載體，從而進(jìn)一步探究MYB4基因在擬南芥響應(yīng)干旱脅迫中所起的作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1材料。試驗(yàn)采用的植物材料為擬南芥（Arabidopsis thaliana），哥倫比亞背景（Columbia，Col），購于美國擬南芥種子資源中心，后經(jīng)合肥工業(yè)大學(xué)植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室繁殖所得。

1.1.2主要試劑及酶類。

Easy Taq DNA Polymerase（TransGen）;T4-DNA Ligase;PrimeSTAR HS DNA Ploymerase;限制性內(nèi)切酶Kpn I （NEB）和Xho I （NEB）;無水乙醇，氯仿，蔗糖，Agar，NaCl，Yeast extract，Trypyone; DNA Loading buffer，Marker，Gold View，Silwet L-77，MES，壯觀霉素，慶大霉素，卡那霉素等。

1.1.3菌體和質(zhì)粒載體。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，農(nóng)桿菌感受態(tài)菌株 GV3101，pART27 載體。

1.2方法

1.2.1擬南芥全基因組DNA的提取。

剪取單棵幼苗葉片（約 100 mg）于 1.5 mL EP 管中并加入2顆直徑 3 mm 的玻璃珠，放入泡沫盒，倒入少量液氮，待液氮揮發(fā)后關(guān)蓋上下劇烈搖動(dòng)至植物組織完全破碎成均勻粉末;向破碎好的植株組織中加入已預(yù)熱的 2×CTAB 緩沖液 600 μL，上下翻轉(zhuǎn)混合均勻;65 ℃水浴鍋，水浴加熱30 min，期間每隔 10 min 輕輕彈動(dòng) EP 管;取出樣品冷卻到室溫后放進(jìn)塑料插板，加入配制好的酚氯仿混合試劑，上下劇烈搖晃約 15 s;室溫 13 000 r/min 離心 10 min，吸取上清至新 1.5 mL EP 管中;加入 1 mL 無水乙醇，輕輕顛倒混勻后于-20 ℃冰箱沉淀1 h;室溫 13 000 r/min 離心 10 min 后，棄上清，加入 1 mL 已配制好的 75%乙醇，室溫 13 000 r/min 離心 3 min，再次棄上清。重復(fù)此步驟再次洗滌沉淀;徹底吸除上清，開蓋倒置 EP 管室溫干燥 20 min，待乙醇徹底揮發(fā)后向管中加入 40 μL 無菌雙蒸水，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2MYB4基因啟動(dòng)子擴(kuò)增。

利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)所需引物，選用Kpn I和Xho I這2個(gè)酶切位點(diǎn)。上游引物FP：CGGGGTACCATAGTGAATGTGAAAAACTGAC;下游引物RP：CCGCTCGAGACTTTTATGTTTACTTTCTTTC，以獲得的全基因組為模板進(jìn)行基因擴(kuò)增。

1.2.3重組質(zhì)粒的獲取。

將獲得的啟動(dòng)子基因序列和pART27質(zhì)粒采用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Xho I進(jìn)行雙酶切，利用T4-DNA Ligase連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，然后涂布于壯觀霉素LB平板上。于37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，挑選單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，隨后送測(cè)序。

1.2.4轉(zhuǎn)基因植株的篩選。

將測(cè)序無誤的重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，通過菌落PCR篩選鑒定陽性單克隆，挑取陽性單菌落培養(yǎng)，采用花序浸花法侵染野生型擬南芥植株。將所收種子干燥春化后撒于含50 μg/mL卡那霉素的1/2MS平板，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d左右，挑選生長嫩綠且有根的幼苗進(jìn)行移栽，后續(xù)篩選鑒定。

2結(jié)果與分析

2.1擬南芥MYB4基因啟動(dòng)子的克隆

選用野生型擬南芥幼苗葉片提取全基因組DNA，以此為模板，選取MYB4基因起始密碼子ATG對(duì)MYB4啟動(dòng)子進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，電泳結(jié)果顯示PCR所得片段約2 000 bp，說明MYB4啟動(dòng)子擴(kuò)增成功。

2.3陽性重組質(zhì)粒的PCR鑒定

將酶切后的目的基因及載體質(zhì)粒利用T4-DNA? Ligase 酶進(jìn)行連接，16 ℃連接過夜，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)過夜后挑取單克隆菌落于加有相應(yīng)抗性的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至菌液渾濁，然后進(jìn)行菌落PCR，電泳檢測(cè)結(jié)果見圖3。將陽性菌株送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過比對(duì)后，顯示序列完全正確。

2.4陽性植株的篩選將測(cè)序正確重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌GV3101中，用含有壯觀霉素和慶大霉素固體LB培養(yǎng)基篩選陽性克隆，挑選單菌落進(jìn)行菌落PCR獲取陽性克隆。然后對(duì)陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，采用浸花法對(duì)花期野生型擬南芥進(jìn)行侵染。收取侵染后的種子，春化14 d后撒于含有50 μg/mL卡那霉素的1/2MS平板上，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d左右，挑選生長嫩綠且有根的幼苗進(jìn)行移栽?？敲顾睾Y選結(jié)果如圖4所示。

3討論

干旱、水資源缺乏是制約我國干旱地區(qū)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境保護(hù)的關(guān)鍵因素[9]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國約有1/3的土地處于干旱區(qū)，水資源缺乏制約了這些地區(qū)經(jīng)濟(jì)、社會(huì)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境建設(shè)[10-11]。探索研究抗旱相關(guān)基因的功能及其對(duì)干旱脅迫響應(yīng)的機(jī)制具有重大的理論意義和實(shí)踐價(jià)值[12]。

致力于探索和研究植物抗旱關(guān)鍵性基因，并通過基因工程技術(shù)對(duì)植物品種進(jìn)行優(yōu)化和改良，是解決全球水資源匱乏問題的有效途徑之一[13]。前期研究表明，MYB4基因參與植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建ProMYB4：GUS重組載體，并通過生物學(xué)手段將其轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，獲得轉(zhuǎn)基因植株，從而為進(jìn)一步研究MYB4基因在植物中響應(yīng)干旱脅迫時(shí)所起的作用奠定了基礎(chǔ)。

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