王義坤，孫琪然，段亞楠，王 柯，陳學(xué)森，沈 向，尹承苗*，毛志泉*

（1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018；2 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，北京 100193）

中國(guó)傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)栽培地區(qū)的蘋果園大部分已進(jìn)入衰老期，其中20年以上樹齡果園占20%，每年面臨2～3.33萬hm2的果園更新任務(wù)[1]。老果園更新?lián)Q代難免發(fā)生連作障礙，蘋果連作會(huì)造成幼樹樹體生長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)酢⒉∠x害加劇、產(chǎn)量降低、果實(shí)品質(zhì)下降等問題，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。因此，研究減輕蘋果連作障礙技術(shù)對(duì)于蘋果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前，菌肥等生物防治措施因環(huán)保、改良土壤效果明顯、更易商業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)正被逐步應(yīng)用于防治各類土傳病害[3-4]。

微生物肥料又稱生物肥料、菌肥或接種劑，是以微生物生命活動(dòng)及其產(chǎn)物促進(jìn)農(nóng)作物得到特定肥料效應(yīng)的微生物活體制品[5]。1895 年德國(guó)科學(xué)家Noble研發(fā)出世界上最早的微生物肥料“Nitragin”根瘤菌接種劑專利產(chǎn)品[6]，從此微生物肥料逐漸進(jìn)入農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)。有研究表明菌肥可以明顯促進(jìn)連作條件下草莓的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，提高草莓產(chǎn)量和果品質(zhì)量[7]。菌肥主要是依靠大量的有益微生物來抑制土壤中有害微生物的活動(dòng)，從而改善連作土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)，為植物提供有利的生長(zhǎng)環(huán)境。

隨著科技的不斷進(jìn)步，人們對(duì)有益微生物的研究越來越透徹。木霉 (Trichoderma spp.) 作為一種植物根際促生菌，是自然界普遍存在的土壤習(xí)居真菌[8]。自1932年Weindling[9]發(fā)現(xiàn)木素木霉對(duì)植物病原真菌具有拮抗作用以來，木霉已成為植病生防學(xué)家的重點(diǎn)研究對(duì)象[10]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，木霉在體外或體內(nèi)至少對(duì)18個(gè)屬29種病原真菌表現(xiàn)出拮抗作用[11]。蘋果連作土壤中添加圓弧青霉D12菌肥可以很好地改善蘋果連作土壤微生物區(qū)系，增加平邑甜茶幼苗根系活力和生物量[12]。草酸青霉A1 菌肥在盆栽試驗(yàn)條件下能顯著促進(jìn)平邑甜茶幼苗的生長(zhǎng)，且對(duì)連作土壤中有害真菌尖孢鐮孢菌有很好的抑制作用，說明草酸青霉A1 菌肥能在一定程度上減輕蘋果連作障礙[13]。前人研究表明[14-17]，細(xì)菌型土壤向真菌型土壤的轉(zhuǎn)變和根際微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著改變是連作障礙產(chǎn)生的主要原因，連作可導(dǎo)致根際微生態(tài)環(huán)境惡化以及土壤微生物區(qū)系的失衡并誘發(fā)土傳病害，特別是真菌型土傳病害，造成了連作系統(tǒng)下作物的大幅度減產(chǎn)。

本試驗(yàn)在前人研究以及本課題組研究的基礎(chǔ)上，將圓弧青霉D12、哈茨木霉、草酸青霉A1三種拮抗真菌制成菌肥，以蘋果常用砧木平邑甜茶 (Malus hupehensis Rehd.) 為材料，在盆栽條件下研究了圓弧青霉D12、哈茨木霉、草酸青霉A1三種菌肥對(duì)連作土壤環(huán)境和平邑甜茶幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以期為有效緩解蘋果連作障礙提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2017年3—10月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家蘋果工程實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。連作土壤采自于山東省泰安市滿莊灘清灣30年生蘋果園，在距樹干80 cm、深5—40 cm的區(qū)域多點(diǎn)隨機(jī)取土，混勻。園土為砂土，有機(jī)質(zhì)含量為9.3 g/kg、硝態(tài)氮13.23 mg/kg、銨態(tài)氮4.11 mg/kg、速效鉀108.86 mg/kg、速效磷9.28 mg/kg，土壤pH為5.51。

試驗(yàn)材料為平邑甜茶實(shí)生苗。將其種子與細(xì)沙混勻，2017年1月于4℃左右層積30天，待種子萌動(dòng)露白后在育苗盤中播種育苗。至幼苗長(zhǎng)到6片真葉時(shí)移栽到外徑29 cm、內(nèi)徑25 cm的泥瓦盆中進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。

試驗(yàn)所用菌肥，由本實(shí)驗(yàn)室提供菌株，德州創(chuàng)迪微生物資源有限公司負(fù)責(zé)制作菌肥。試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)施肥處理：圓弧青霉D12菌肥 (T1)、哈茨木霉菌肥 (T2)、草酸青霉A1菌肥 (T3)、載體基質(zhì)對(duì)照(CK1)、連作土壤對(duì)照 (CK2)，菌肥加入量為連作土壤質(zhì)量比的1.6%，連作土壤與菌肥混合，每個(gè)處理設(shè)置20盆重復(fù)，共100盆，每盆定植2株長(zhǎng)勢(shì)基本一致的幼苗，正常肥水管理。

1.2 測(cè)定指標(biāo)

生長(zhǎng)指標(biāo)：2017年8月19日取樣，每個(gè)處理隨機(jī)選取3株植株，用水洗凈，測(cè)定株高、地徑、鮮質(zhì)量。用專業(yè)版WinRHIZO(2007年版) 根系分析系統(tǒng)對(duì)各處理根系樣品圖像進(jìn)行掃描分析，記錄幼苗根系長(zhǎng)度、總體積和總表面積等根系構(gòu)型參數(shù)。待指標(biāo)測(cè)定完成后烘干，測(cè)定其干質(zhì)量。

土壤微生物數(shù)量測(cè)定：采用稀釋平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法[18]。取10 g新鮮過篩土壤加到盛有90 mL無菌水的錐形瓶中，封口并將其放在搖床振蕩10 min，待土壤充分散開混勻后，靜止20～30 s，即為10倍稀釋液，用移液槍吸取1 mL稀釋液至盛有9 mL無菌水的試管中，振蕩搖勻，即為100倍稀釋液，依次類推，每次更換槍頭連續(xù)稀釋，則制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍土壤稀釋液。細(xì)菌培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌培養(yǎng)采用改良高氏培養(yǎng)基。

根系呼吸速率：取幼苗根系上的新鮮白根，采用Oxytherm氧電極 (Hansatech公司，英國(guó)) 測(cè)定根系呼吸速率，參照毛志泉等[19]的方法。

實(shí)時(shí)熒光定量 (qPCR)：取0.5 g過篩的新鮮土壤，按E.Z.N.A.?土壤DNA提取試劑盒操作步驟提取DNA，采用CFX96TMThermal Cycler (Bio-Rad) 對(duì)土壤中腐皮鐮孢菌的基因拷貝數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，參照李家家等[20]的方法。

土壤酶活性：參照關(guān)松蔭[21]的方法。脲酶活性測(cè)定采用比色法，以24 h后1g土壤中NH3-N的質(zhì)量(mg) 表示脲酶活性，用mg/(g·d) 表示。過氧化氫酶測(cè)定采用容量法，以1g土壤的0.1 mol/L高錳酸鉀的毫升數(shù)表示過氧化氫酶活性，用mL/g表示。磷酸酶活性測(cè)定采用磷酸苯二鈉比色法，以1 g土壤的酚毫克數(shù)表示磷酸酶活性，用mg/(g·d) 表示。蔗糖酶活性測(cè)定采用比色法，以24 h后1 g土壤中葡萄糖的質(zhì)量 (mg) 表示蔗糖酶活性，用mg/(g·d) 表示。

土壤酚酸測(cè)定：采用ASE-HPLC測(cè)定方法[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行計(jì)算和作圖，差異顯著性通過SPSS 19.0軟件的鄧肯氏新復(fù)極差法檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種菌肥對(duì)連作平邑甜茶幼苗生物量的影響

由表1可知，施加三種菌肥均使平邑甜茶幼苗的地徑、鮮質(zhì)量指標(biāo)較連作對(duì)照 (CK2) 分別增加49.8%、56.0%、56.0%，31.5%、40.6%、40.9%，達(dá)到顯著性差異；施加哈茨木霉 (T2)、草酸青霉A1(T3) 株高、干重指標(biāo)較連作對(duì)照分別增加了53.3%、53.3%和106.3%、99.8%，達(dá)到顯著性差異；施加圓弧青霉D12(T1) 較連作對(duì)照分別增加39.4%、62.0%；施加載體基質(zhì)處理 (CK1) 較連作對(duì)照 (CK2) 在株高、地徑、鮮重、干重指標(biāo)分別增加15.3%、25.7%、6.5%、20.5%，與連作對(duì)照差異較小。

2.2 三種菌肥對(duì)平邑甜茶根系生長(zhǎng)及根系呼吸速率的影響

由表2可以看出，施加三種菌肥后均促進(jìn)了平邑甜茶幼苗根系生長(zhǎng)，與不施菌肥連作土壤對(duì)照 (CK2)相比，圓弧青霉D12菌肥 (T1) 處理的根長(zhǎng)、根表面積、根體積、根尖數(shù)分別增加了166%、270%、477%、114%，哈茨木霉 (T2) 處理的分別增加了238%、417%、747%、162%，草酸青霉A1 (T3) 處理的分別增加了241%、466%、901%、132%。其中施加草酸青霉A1菌肥 (T3) 和哈茨木霉菌肥 (T2) 處理的各指標(biāo)間無顯著性差異。

表 2 不同菌肥處理對(duì)平邑甜茶根系生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of microbial fertilizers on growth of Malus hupehensis Rehd. seedlings

由圖1可以看出，施加圓弧青霉D12(T1)、哈茨木霉 (T2)、草酸青霉A1 (T3) 菌肥后平邑甜茶幼苗根系呼吸速率分別是連作對(duì)照的1.46倍、1.54倍、1.51倍，三者均與對(duì)照差異顯著，但三者間差異不顯著。施加載體基質(zhì)處理 (CK1) 與連作對(duì)照處理 (CK2) 差異不大，未達(dá)顯著性差異。

圖 1 不同菌肥處理對(duì)平邑甜茶根系呼吸速率的影響Fig. 1 Effects of microbial fertilizers on root respiration rate of Malus hupehensis Rehd. seedlings

2.3 三種菌肥對(duì)土壤酶活性的影響

由圖2可以看出，施加三種菌肥后，土壤酶活性有顯著提高，各處理的過氧化氫酶活性表現(xiàn)為哈茨木霉菌肥 (T2) ＞ 草酸青霉 A1 (T3) ＞ 圓弧青霉D12(T1) ＞ 載體基質(zhì) (CK1) ＞ 連作 (CK2)，施加哈茨木霉 (T2) 和草酸青霉A1 (T3) 效果顯著；施加三種菌肥 (T1、T2、T3) 處理的脲酶活性分別是連作對(duì)照(CK2) 的2.53倍、2.41倍、2.50倍，均與對(duì)照差異顯著；圓弧青霉D12(T1)、哈茨木霉 (T2)、草酸青霉A1 (T3)、載體基質(zhì)處理 (CK1) 的中性磷酸酶活性分別為連作對(duì)照 (CK2) 的1.60倍、1.74倍、1.65倍、1.25倍，施加三種菌肥處理的效果明顯，與對(duì)照差異顯著，但三者間無明顯差異；蔗糖酶活性以草酸青霉A1菌肥處理 (T3) 最高，是連作對(duì)照 (CK2)的2.95倍，哈茨木霉菌肥處理 (T2) 次之，二者間差異不顯著，但與其他處理均達(dá)到顯著性差異。

圖 2 不同菌肥處理對(duì)平邑甜茶土壤酶活性的影響Fig. 2 Effects of three kinds of fertilizer on soil enzyme activities

2.4 三種菌肥對(duì)土壤酚酸含量變化的影響

由表3可以看出，與連作對(duì)照 (CK2) 相比，施加三種菌肥后，根皮苷、根皮素、阿魏酸、咖啡酸含量有一定下降，其中，三個(gè)菌肥處理的根皮苷和根皮素分別降低62.6%、64.9%、69.8%，77.9%、78.9%、78.3%；施加載體基質(zhì) (CK1) 和連作 (CK2) 處理相比，四種酚酸的含量未達(dá)顯著性差異。

2.5 三種菌肥對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響和真菌的實(shí)時(shí)熒光定量分析

由圖3可以看出，與連作對(duì)照 (CK2) 相比，施加圓弧青霉D12(T1)、哈茨木霉 (T2)、草酸青霉A1(T3) 及載體基質(zhì) (CK1) 后細(xì)菌數(shù)量分別增加179%、188%、207%、12%，其中施加載體基質(zhì) (CK1) 與連作對(duì)照 (CK2) 未達(dá)到顯著性差異；施加三種菌肥后放線菌數(shù)量較連作對(duì)照 (CK2) 分別增加220%、270%、253%，施加哈茨木霉 (T2) 和草酸青霉A1 (T3) 效果較明顯，二者之間未達(dá)到顯著性差異。

表 3 施用三種菌肥土壤酚酸含量Table 3 Phenolic acid contents of soil applied with three microbial fertilizers

圖 3 不同菌肥處理對(duì)土壤中細(xì)菌和放線菌的影響Fig. 3 Bacteria and actinobacteria population of replanted soil after applied with microbial fertilizers

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)土壤中的腐皮鐮孢菌進(jìn)行測(cè)定 (圖4)，結(jié)果表明，5個(gè)處理中連作對(duì)照 (CK2) 的腐皮鐮孢菌基因拷貝數(shù)最高，與施加載體基質(zhì)處理 (CK1) 未達(dá)到顯著性差異，施加圓弧青霉D12(T1)、哈茨木霉 (T2)、草酸青霉A1 (T3) 處理分別比對(duì)照(CK1)降低了63.3%、70.7%、73.2%，均與對(duì)照差異顯著。

圖 4 不同菌肥處理對(duì)腐皮鐮孢菌的實(shí)時(shí)熒光定量分析Fig. 4 Real-time quantitative analysis of Fusarium solani under different treatments

3 討論

近年來，隨著生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展和社會(huì)對(duì)環(huán)境保護(hù)的日益重視，對(duì)新技術(shù)和新產(chǎn)品的研發(fā)以及探尋新肥料 (尤其是生物菌肥) 來替代化肥的研究倍受關(guān)注[23]。多年的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐證明，微生物有機(jī)肥可降低病原菌數(shù)量、改善土壤環(huán)境、促進(jìn)植株根系生長(zhǎng)、增加生物量，進(jìn)而緩解連作障礙[24]。

3.1 三種菌肥對(duì)連作平邑甜茶幼苗生物量及根系呼吸速率的影響

本研究中發(fā)現(xiàn)，施加三種菌肥均促進(jìn)了平邑甜茶幼苗生物量的增加，較連作以及載體基質(zhì)對(duì)照，均存在顯著性差異。原因可能是圓弧青霉D12、哈茨木霉、草酸青霉A1作為拮抗真菌，抑制了土壤中致病菌的活性，有利于植株根系更好地吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。已有研究證明，木霉通過調(diào)節(jié)初生代謝從而起到促進(jìn)植株生長(zhǎng)和作物產(chǎn)量的作用[25]；根系呼吸作用是根系代謝的中心，它對(duì)根系更新、養(yǎng)分吸收以及植株生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義[26]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，施加三種菌肥后，平邑甜茶幼苗根系呼吸速率得到一定提高，與連作對(duì)照差異明顯；但施加哈茨木霉、草酸青霉A1菌肥處理表現(xiàn)較好。呼吸速率的降低會(huì)使?fàn)I養(yǎng)離子吸收受到抑制而減緩植物生長(zhǎng)[27]?？梢娛┘泳屎螅軌蚋纳七B作土壤環(huán)境，利于植株根系的生長(zhǎng)以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

3.2 三種菌肥對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響及真菌的實(shí)時(shí)熒光定量分析

土壤微生物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)，以及土壤酶活性作為土壤質(zhì)量衡量指標(biāo)已經(jīng)被廣泛接受[28]。前人研究表明，菌肥在緩解連作障礙方面的優(yōu)勢(shì)與施肥后改善微生物群落結(jié)構(gòu)、抑制植物病原菌的種群數(shù)量有密切的關(guān)系[29]。本研究中，連作土壤中施加三種菌肥后，較連作對(duì)照處理細(xì)菌和放線菌的數(shù)量有了大幅度提高，但連作對(duì)照與載體基質(zhì)之間的差異較小，未達(dá)顯著性差異；長(zhǎng)期連作會(huì)降低有益微生物數(shù)量，增加有害真菌數(shù)量，導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變[30-31]，而有害真菌數(shù)量的增加是造成連作障礙的主要原因[32-33]。本試驗(yàn)選取引起蘋果連作障礙的有害真菌腐皮鐮孢菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)施加三種菌肥后均降低了連作土壤中腐皮鐮孢菌的數(shù)量，其原因可能是菌肥中含有的拮抗真菌對(duì)土壤中腐皮鐮孢菌起到抑制作用，改變了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)[34]，為植株生長(zhǎng)發(fā)育提供良好條件。可見，連作土壤中施加三種菌肥后對(duì)土壤微生物環(huán)境的影響較為顯著，改變了原有蘋果連作環(huán)境條件下的微生物體系結(jié)構(gòu)，細(xì)菌、放線菌增多，土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化和分解速率加快，從而增加土壤肥力、促進(jìn)植株生長(zhǎng)。

3.3 三種菌肥對(duì)土壤酶活性的影響

土壤酶活性直接與土壤中物質(zhì)的轉(zhuǎn)化、養(yǎng)分釋放和固定過程、土壤養(yǎng)分供應(yīng)密切相關(guān)[35]，在一定程度上能夠反映土壤中養(yǎng)分情況。土壤酶來源于動(dòng)植物殘?bào)w分解、微生物生產(chǎn)和根系分泌物，故而土壤有機(jī)質(zhì)、微生物代謝強(qiáng)度和作物長(zhǎng)勢(shì)是影響土壤酶活性的主要因子[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，較連作及載體基質(zhì)對(duì)照，施加三種菌肥后土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶和過氧化氫酶的活性均有不同程度地提高，不過施加菌肥后三者在中性磷酸酶和脲酶活性方面差異較小。磷酸酶能促進(jìn)土壤中有機(jī)磷化合物或無機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)化為植物能利用的無機(jī)態(tài)磷，其活性可以反映土壤的供磷能力[37]。土壤脲酶主要來源于植物和微生物，是決定土壤中氮轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，其活性高低反映了各種生化過程的方向和強(qiáng)度[38]。其原因可能是施加菌肥后改變了土壤微生物環(huán)境，利于植物根系生長(zhǎng)，提高植物對(duì)土壤有機(jī)磷化合物、無機(jī)磷酸鹽及氮素的利用吸收。而在過氧化氫酶和蔗糖酶活性方面，施加哈茨木霉和草酸青霉A1效果表現(xiàn)較好。土壤過氧化氫酶與土壤有機(jī)質(zhì)含量、微生物數(shù)量有關(guān)，可以促進(jìn)過氧化氫的分解，有利于防止它對(duì)生物體的毒害作用[39]。說明哈茨木霉和草酸青霉A1在一定程度上能夠提高植株對(duì)逆境的抵抗能力，有效地緩解連作障礙。施加載體基質(zhì)處理與連作相比，四種土壤酶活性有一定提高，但效果不明顯，說明載體基質(zhì)中富含的物質(zhì)對(duì)土壤酶活性的提高有一定幫助，但較施加菌肥效果仍然較差。

3.4 三種菌肥對(duì)土壤酚酸含量變化的影響

果園連作障礙原因復(fù)雜，其中，連作果園土壤中由上茬根系分泌和上茬殘根腐解產(chǎn)生的酚酸類物質(zhì)是引起連作障礙的重要原因之一[40-41]。早期研究發(fā)現(xiàn)，蘋果根系產(chǎn)生的根皮素、根皮苷和苦杏苷等酚酸類物質(zhì)，能夠強(qiáng)烈抑制蘋果幼苗的生長(zhǎng)[42]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，施加三種菌肥后，根皮素、根皮苷、阿魏酸、咖啡酸較連作對(duì)照都有不同程度降低，其中施加哈茨木霉和草酸青霉A1效果較好，施加圓弧青霉D12效果次之；施加載體基質(zhì)和連作處理的四種酚酸物質(zhì)的變化差異不大，說明施加載體基質(zhì)并不能有效降低土壤中酚酸物質(zhì)含量。具體原因可能是，施加菌肥后改善了植株根系生長(zhǎng)環(huán)境及連作土壤微生物環(huán)境，利于有益微生物的大量繁殖，降解了大量酚酸類物質(zhì)。

4 結(jié)論

連作土壤中施加不同菌肥均可促進(jìn)植株生長(zhǎng)，抑制土壤病原真菌的繁殖，降低土壤酚酸物質(zhì)含量，優(yōu)化根際土壤環(huán)境，但施加不同菌肥效果存在差異，施加草酸青霉A1與哈茨木霉效果較好，可作為緩解蘋果連作障的良好措施，其具體的防控機(jī)理還需進(jìn)一步研究。