(浙江工業(yè)大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，浙江 杭州 310014)

1970年以前，滅蟻靈作為殺蟲劑和添加型阻燃劑而被廣泛使用，但后來由于其生物毒性而被禁用[1-3]。得克隆( Dechlorane plus，簡稱 DP) 作為滅蟻靈的替代品而被研發(fā)生產(chǎn)，并廣泛應(yīng)用于各類電子產(chǎn)品、電線電纜、尼龍和計算機外殼等材料中 。DP有順式-DP(syn-DP)和反式-DP(anti-DP)兩個異構(gòu)體組成。DP的主要生產(chǎn)商為美國OxyChem公司和我國江蘇安邦電化學(xué)公司。兩個公司的DP產(chǎn)量分別450～4 500 t[11]以及300～1 000 t[4-5]。研究表明：在大氣、水體、沉積物、灰塵和樹皮等多種環(huán)境介質(zhì)中，以及在生物、人體內(nèi)均檢測到DP[6-12]。由于DP極高的疏水性(logKow=9.3)，水體環(huán)境中的DP將會吸附在懸浮顆粒物上，并下沉到沉積物中。我國各大水系，如長江流域、松花江流域、珠江流域和錢塘江流域等沉積物中均檢測到DP的殘留。對底泥中DP的直接利用可能是它們進入生物體的主要途徑之一。所以，有關(guān)底泥中DP的生物可利用性及生態(tài)毒理性研究，對于預(yù)測該類化合物的生物富集、食物鏈傳遞及健康風(fēng)險均至關(guān)重要。但到目前為止，相關(guān)研究仍然非常匱乏。

中華圓田螺(Cipangopaludinachinensis)，生活在水系底部，屬于雜食性淡水甲殼類軟體動物，在我國分布廣泛。由于田螺生活在水系底部、移動緩慢，且其食物主要來源于底泥中的腐殖質(zhì)，田螺能夠基本反映這一水域的污染情況，因此常被選用于生物積累及毒性實驗。因此本研究以中華圓田螺為模式生物，通過生物-沉積物積累因子(Bio-sediment accumulation factors，BSAFs)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)等研究底泥中DP的生物可利用性及氧化應(yīng)激效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品與試劑

順式-DP(syn-DP，99.8%)和反式-DP(anti-DP，99.8%)標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Accustandard公司；13C-PCB 141，13C-PCB 208，13C-PCB 202購自美國劍橋同位素實驗室；CAT測試盒、MDA測試盒和蛋白質(zhì)定量測試盒購自南京建成生物工程研究所；色譜純正己烷、丙酮及二氯甲烷購自百靈威科技有限公司。

1.2 染毒底泥的制備

實驗所用底泥參考本實驗室之前研究[14]。

濕法染毒：用丙酮制備質(zhì)量濃度為100 mg/L的DP貯備液。稱取10g石英砂均勻平鋪于500 mL燒杯中，然后用微量進樣針依次加入3 mL DP貯備液、10 mL丙酮使溶劑能浸沒石英砂，待丙酮揮發(fā)至0.5 mL左右時，加入20 g土壤，并用不銹鋼勺攪拌均勻，重復(fù)這一步驟至500 g土壤全部放入燒杯中。最后加適量去離子水，保證土壤含水率約為30%。將燒杯放于自動攪拌器上攪拌72 h，期間每日查看含水率，適時補充去離子水。待攪拌結(jié)束后，將土壤轉(zhuǎn)移至不銹鋼盆中，將剩余2 500 g土壤逐漸加入，充分?jǐn)嚢?。攪拌完成后置于室溫下，避光保?5 d，用于后續(xù)實驗。

1.3 中華圓田螺的養(yǎng)殖和暴露實驗

實驗所用中華園田螺購自浙江省杭州市三塘小區(qū)菜市場，大小基本一致。培養(yǎng)水溫為20～25 ℃，晝夜光照比為6 h∶18 h的循環(huán)水系統(tǒng)中。培養(yǎng)所用水均為去氯自來水。

中華圓田螺暴露實驗方法具體如下：田螺置于底部平鋪有1 500 g染毒沉積物的36 L玻璃水槽內(nèi)，沉積物和上覆水的體積比為1∶3，采用氧氣泵曝氣供氧，以使培養(yǎng)過程中上覆水中溶解氧保持3.0 mg/L以上。在第2，4，8，16，32天分別取樣。待處理的田螺先放置在清水里24 h，使其吐盡腸道里的沉積物，隨后將其解剖，依據(jù)組織不同分為肌肉和肝臟兩個組，放入聚四氟乙烯封口袋中，貼好標(biāo)簽，置于-20 ℃冰箱里待測。

1.4 樣品的處理和凈化

1) 沉積物的前處理。稱取2 g沉積物于玻璃纖維濾筒中，加入0.5 g銅粉，加入示蹤標(biāo)13C-PCB 141和13C-PCB 208，用140 mL二氯甲烷索氏提取48 h；提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，并加入適量正己烷替換二氯甲烷，并最終濃縮至1 mL；濃縮后的提取液經(jīng)層析柱凈化，層析柱填料從下至上分別為2 g無水硫酸鈉、2.5 g氧化鋁、3 g中性硅膠、2 g無水硫酸鈉，淋洗液為80 mL二氯甲烷；將淋洗液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2 mL，正己烷溶劑替換2次再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2 mL；濃縮液經(jīng)氮吹定容至1 mL，加入內(nèi)標(biāo)13C-PCB 202，保存在-20 ℃冰箱內(nèi)待GC-MS分析測定。

2) 中華圓田螺的前處理。稱取2 g冷凍干燥后的中華圓田螺樣品于研缽中，并加入2 g無水硫酸鈉，充分研磨至田螺樣品呈粉末狀；置于玻璃纖維濾筒中，加入0.5 g銅粉，示蹤標(biāo)13C-PCB 141和13C-PCB 208，用140 mL二氯甲烷索氏提取48 h；提取液經(jīng)濃硫酸酸洗3次去脂肪，將酸洗后的提取液經(jīng)沉積物相同凈化方法處理，最后待GC-MS分析測定。

1.5 儀器分析

目標(biāo)化合物的儀器分析采用Agilent-7890氣相色譜儀-5973N質(zhì)譜儀。

色譜條件：進樣口溫度設(shè)置為280 ℃，進樣方式為不分流模式，載氣為高純氦氣，流量為1.0 mL/min，進樣量為1.0 μL；色譜柱選用DB-5MS毛細管柱(30 m×250 mm×0.25 μm)；升溫程序：初始溫度80 ℃保持3 min，然后以10 ℃/min升至300 ℃并保持20 min。

質(zhì)譜條件：離子源為負離子化學(xué)電離源(ECNI)，能量為70 eV；離子源、傳輸線和四極桿溫度分別設(shè)置為150，280，150 ℃；甲烷為反應(yīng)氣體，采用選擇離子(SIM)模式進行目標(biāo)化合物的定性定量分析；syn-DP和anti-DP檢測離子為653.8/651.8/655.8，示蹤標(biāo)13C12-PCB 141和13C12-PCB 208的檢測離子為372/370/374和475.8/473.8/477.8，內(nèi)標(biāo)13C12-PCB202的檢測離子為441.8/439.8/443.8。

1.6 質(zhì)量控制和保證

采用8點標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量目標(biāo)物，DP每種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2>0.998，示蹤標(biāo)13C-PCB 141，13C-PCB 208和內(nèi)標(biāo)13C-PCB 202的線性相關(guān)系數(shù)R2>0.999。將10倍信噪比對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為實驗方法檢出限，得到目標(biāo)物syn-DP，anti-DP在沉積物中的檢出限(以干重計)分別為0.03，0.027 ng/g，兩個化合物在中華圓田螺體內(nèi)的檢出限(以干重計)分別為0.02，0.016 ng/g。syn-DP和anti-DP在沉積物中的回收率為113.3%和120.3%，在生物樣品中的回收率為101.5%和105.2%。

2 結(jié)果與討論

2.1 DP的生物積累效應(yīng)

經(jīng)過32 d的暴露實驗，DP在中華圓田螺體內(nèi)不同時間的積累濃度如圖1所示：高(1 000 ng/g)、低(100 ng/g)兩個暴露水平下anti-DP(積累濃度曲線，高暴露水平：C=0.370t-0.174，R2=0.971，p<0.05；低暴露水平：C=0.149t-0.101，R2=0.948，p<0.05)和syn-DP(積累濃度曲線，高暴露水平：C=0.077t+0.272，R2=0.921，p<0.05；低暴露水平：C=0.04t+0.424，R2=0.652，p>0.05)在中華圓田螺體內(nèi)的積累濃度隨暴露時間的增加而增加，但32 d暴露后，anti-DP和syn-DP在中華圓田螺體內(nèi)的濃度未達平衡。低濃度暴露水平下，syn-DP和anti-DP的生物-沉積物積累因子(BSAF=CB/Cs，CB為化學(xué)品在生物體內(nèi)濃度，Cs為化學(xué)品在沉積物中濃度)分別為0.82和0.40，顯著高于高濃度暴露水平(0.19和0.06)。此結(jié)果與Jia等[9]研究結(jié)論相似：由于DP的濃度分配未達到平衡，相對較低DP濃度的生物積累中BSAFs較高。數(shù)值上與Wang和Shen的研究結(jié)果有所區(qū)別但整體上相似。Wang等[5]研究了中國東北地區(qū)大連一河流的沉積物和魚類，得到syn-DP和anti-DP的BSAFs值為0.88(0.33～2.8)，0.33(0.086～1.0)，Shen等[15]得到安達略湖水生物的syn-DP和anti-DP的平均BSAFs值為0.8和0.3?？赡茉蚴侵腥A圓田螺屬于低營養(yǎng)級生物，Tomy等[16]研究表明anti-DP容易在高營養(yǎng)級魚類積累而syn-DP則更傾向積累于低營養(yǎng)級魚類。

許多研究用fsyn=syn-DP/(syn-DP+anti-DP)來描述異構(gòu)體的相對豐度。工業(yè)品中fsyn為0.20～0.35[17]，本實驗暴露底泥中fsyn是0.24，基本和工業(yè)品的相對豐度相似。生物樣品暴露4 d時fsyn分別為0.41(低濃度組)和0.38(高濃度組)，隨著暴露時間的增加，低暴露組fsyn為0.57(第8天)、0.35(第16天)和0.25(第32天)，高暴露組則為0.38，0.19及0.18。可以發(fā)現(xiàn)兩組的fsyn值均隨時間增加先變大后變小，且高濃度組的下降幅度大于低濃度組。結(jié)果說明anti-DP在中華圓田螺體內(nèi)更容易積累或者syn-DP更容易代謝，即中華圓田螺會對DP異構(gòu)體選擇性積累或者代謝。此結(jié)果與先前李亦瑋[18]和Tomy[16]的研究相似。

圖1 DP在田螺體內(nèi)的生物積累情況Fig.1 Bioaccumulation of DP in the mudsnail

2.2 DP對中華圓田螺的毒性效應(yīng)

生物的生化反應(yīng)被用作環(huán)境污染物的早期預(yù)警指標(biāo)，而酶活性可以作為環(huán)境污染物的生物標(biāo)記物。CAT酶活力能夠反映生物體內(nèi)氧化還原程度，揭示生物受脅迫程度。MDA的量可以反映機體的脂質(zhì)過氧化程度，從而間接反應(yīng)細胞受到氧化損傷的程度。本實驗測量了暴露1，3，7，10 d的CAT酶和MDA含量，研究DP對中華圓田螺的毒性效應(yīng)。

田螺體內(nèi)CAT酶變化情況如圖2所示，整個暴露期間，空白組的肝臟和肌肉CAT酶濃度基本沒有發(fā)生變化(P>0.05)，實驗組的肝臟CAT酶濃度(每克蛋白中的酶活力單位)在同一時段遠大于空白組(差值2.18～39.34 U/g)，實驗肌肉組除了暴露第3 天也呈現(xiàn)一樣結(jié)果但差值沒有這么大(差值0.41～3.01 U/g)，此結(jié)果表明DP會導(dǎo)致田螺體內(nèi)活性氧增加破壞機體，從而分泌大量CAT酶來保持正常的新陳代謝，同時由于肝臟組織比肌肉組織對外源性化學(xué)物質(zhì)有更加強烈的代謝功能，所以肝臟中CAT酶濃度高于肌肉。對比高低兩個暴露濃度中肝臟內(nèi)CAT酶變化可以發(fā)現(xiàn)：低暴露組CAT酶濃度隨時間的增加而增大，高暴露組CAT酶隨時間的增加先增大后降低，除了最后一天，同時段高暴露組CAT酶濃度大于低暴露組，說明DP濃度越高對機體毒性就越大。

丙二醛濃度可以反映機體的脂質(zhì)過氧化程度，從而間接反映細胞受到氧化損傷的程度。MDA具體變化如圖3所示，前三天實驗組與空白組的MDA濃度(每毫克蛋白中MDA的摩爾數(shù))差異不明顯(P>0.05)，第7天開始實驗組MDA濃度明顯大于空白組，且兩者之差達到最大值，其中高暴露濃度下，肝臟和肌肉組中分別相差12.98，2.74 nmol/mg。對比暴露實驗中肝臟肌肉的MDA發(fā)現(xiàn)：與CAT酶濃度類似，肝臟中MDA濃度大于肌肉，高濃度組大于低濃度組。

圖2 CAT酶濃度隨時間的變化Fig.2 Variation of CAT level in different exposure time

圖3 MDA濃度隨時間的變化Fig.3 Variation of MDA level in different exposure time

綜上所述，CAT酶活性在暴露初期的升高，說明DP能夠啟動中華圓田螺的抗氧化系統(tǒng)，產(chǎn)生抗氧化防御，但是隨著暴露時間的延長，由于產(chǎn)生了脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物導(dǎo)致氧化損傷，CAT酶呈現(xiàn)出下降趨勢。與其他研究對比也發(fā)現(xiàn)相似的規(guī)律，Zhang等[6]指出：蚯蚓暴露在DP中，隨著暴露時間的延長和濃度的增加，超氧化物歧化酶持續(xù)增加，使得天然的抗氧化系統(tǒng)崩潰。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA在暴露期間，呈現(xiàn)出先增加后減少再增加的趨勢。Yang等[19]將蚯蚓作為受試生物，將其暴露在不同濃度DP下，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過28 d的暴露，DP并不能對蚯蚓產(chǎn)生直接毒性，但是對其產(chǎn)生的氧化損傷卻不容忽視，酶的活性顯著降低。在DP質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過0.5 mg/kg后，CAT也受到了顯著抑制。

3 結(jié) 論

以中華圓田螺為模擬生物，研究了DP的生物積累性和生物的氧化應(yīng)激效應(yīng)。計算所得BSAFs值和不同暴露時間的fsyn，發(fā)現(xiàn)DP生物積累性不強，但DP異構(gòu)體在生物體內(nèi)發(fā)生選擇性積累或代謝。通過分析不同時段的CAT酶和MDA的濃度，發(fā)現(xiàn)DP會對生物體造成氧化損傷。