史晶晶, 徐瑞晶, 徐浩, 馬霜, 賈秋蕊, 高志民*

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黃藤染色體核型及基因組大小分析

史晶晶1,2, 徐瑞晶1,3, 徐浩1,2, 馬霜1,2, 賈秋蕊4, 高志民1,2*

(1. 國家林業(yè)局竹藤科學與技術重點開放實驗室, 北京 100102; 2. 國際竹藤中心竹藤資源基因科學研究所, 北京 100102; 3. 國際竹藤中心熱帶森林植物研究所, 海南 三亞 572000; 4. 河北省唐山市遷西縣林業(yè)局, 河北 唐山 064300)

為探究黃藤()染色體核型和基因組的大小，采用體細胞染色體常規(guī)制片法與顯微攝影技術相結合的方法，對黃藤染色體進行了核型分析，同時以番茄()為內(nèi)標，應用流式細胞術對黃藤葉片基因組大小、DNA含量和DNA倍性進行了測定。結果表明，黃藤莖尖是理想的染色體制片材料；黃藤的染色體數(shù)為2=24, 核型公式為K(2)=1M+17m+5sm+1st，核型類型為2C；核型不對稱系數(shù)61.20%；黃藤的DNA含量為1.57 pg，基因組大小為1 539.53 Mb，黃藤的DNA倍性為二倍體(2)。這是首次報道黃藤的核型和基因組大小，為深入開展黃藤屬及其近緣屬植物的核型和基因組比較分析提供了參考依據(jù)。

黃藤；染色體；核型；基因組

染色體是在細胞周期的分裂中期形成的高度縊縮的結構，是遺傳信息的載體。每種植物的體細胞都具有一定的染色體，其臂長、臂比、染色體長度比、著絲粒位置等特征各具特點，是區(qū)分不同物種的便捷形象表征，單個細胞中染色體數(shù)量與結構特征即核型[1]。植物體細胞的核型分析是一種通過觀察染色體的數(shù)目、大小以及形態(tài)來分析染色體類型的技術方法。在核型分析中，主要是以染色體全長、著絲粒位置、臂長和隨體等為依據(jù)[2]。核型分析技術為生物基因組學提供了系統(tǒng)直觀的基礎資料，對研究物種的遺傳、變異、起源以及進化具有重要意義，對于植物系統(tǒng)分類和品種改良的育種實踐具有重要意義。流式細胞術是一種對液流中排成單列的細胞或其它生物微粒逐個進行快速定量分析和分選的技術[3]，被廣泛應用于臨床醫(yī)學[4]、細胞生物學[5]、微生物學[6]、遺傳學等領域，也被廣泛應用于基因組大小的測定。研究物種的基因組大小可為基因組分析提供重要的參考依據(jù)。

棕櫚藤為棕櫚科(Palmae)省藤亞科(Calamoideae)省藤族(Calameae)植物，是熱帶森林的重要植物類群，全世界共有13屬，約600種，主要分布在亞洲、非洲、大洋洲等熱帶地區(qū)[7]。在我國，棕櫚藤主要集中分布在熱帶、南亞熱帶地區(qū)，約有3屬40種21變種[8]。棕櫚藤藤莖的強度、韌性、彈性以及易于造型等優(yōu)良工藝特性，使其成為編制工業(yè)的優(yōu)良材料，原藤是僅次于木材和竹材的重要林產(chǎn)品[9], 其開發(fā)利用已成為林業(yè)領域研究的熱點之一。目前，我國的棕櫚藤工業(yè)以傳統(tǒng)編織為主，技術水平較高，但我國的藤資源短缺，大部分依靠進口。由于原藤進口價格的昂貴，如何更好的培育原藤資源，合理開發(fā)利用棕櫚藤資源成為我國棕櫚藤業(yè)發(fā)展的重要問題。為更好地開發(fā)利用棕櫚藤資源，實現(xiàn)遺傳改良，首先要了解其細胞學和遺傳信息，然而對棕櫚藤細胞學和遺傳學的研究報道卻寥寥無幾。報道主要集中于省藤屬()植物[10–13], 如小省藤(.)、盈江省藤(.var.)、寬刺藤(.)、高地省藤(.var.)。省藤屬植物體細胞染色體數(shù)均為2=26[10]，澤生藤(.)的體細胞染色體數(shù)為2=28[11]。黃藤()為棕櫚科鱗果亞科(Lepidocaryoideae)省藤族(Calameae)黃藤屬植物，是我國棕櫚科單屬單種植物[14]，藤莖質地柔韌，抗拉強度高，具有良好的工藝特性，適于編制和家具制作；藤筍富含維生素、氨基酸和礦物質，是良好的蔬菜；藤種質地堅硬，可用于制作“佛珠”[15]；黃藤果實具有較高的藥用價值，可用于提取血竭，血竭具有活血化瘀、收斂止血、消腫止痛、補血益氣等功效[16]。因此，黃藤是具較高經(jīng)濟價值和開發(fā)前景的多用途珍貴森林植物[17]。然而，黃藤的核型和基因組大小尚未見報道。對黃藤進行核型分析以及基因組大小的測定，將為研究黃藤的遺傳變異和起源進化提供參考依據(jù)，對于黃藤的基因組分析、種質資源利用以及品種改良的育種實踐具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

從海南三亞甘什嶺天然林林下(109°40′18.76″ E，18°23′06.56″ N，海拔261 m)挖取黃藤()實生苗(1年生)帶回實驗室, 在人工氣候室內(nèi)盆栽培養(yǎng)(26℃，光照強度200mol m–2s–1, 光/暗=16 h/8 h)。選擇生長狀況良好的藤苗，取根尖和莖尖為核型分析的試驗材料，同時取葉片用于基因組大小分析，以番茄()葉片作為參比。

1.2 藥品、耗材和儀器

藥品和耗材：2 mmol L–18-羥基喹啉、FAA固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1體積比)、1 mol L–1HCl、改良苯酚品紅溶液、碘化丙啶(PI)染色液、WPB裂解液、纖維素酶、果膠酶、載玻片、蓋玻片、鑷子、刀片、解剖針、濾紙、300目濾網(wǎng)、培養(yǎng)皿等。

儀器：Zeiss Axio Scope A1熒光顯微鏡以及配套的ProgRes CapturePro成像系統(tǒng)、Adobe Photoshop cc 2017圖片處理軟件、ImageJ測量軟件、VIDEO- TEST-KYRYO 3.1核型分析軟件、BD?FACSCalibur流式細胞儀、離心機等。

1.3 染色體制片

取黃藤的根尖或莖尖(長約0.5 cm)，用蒸餾水沖洗干凈，用2 mmol L–18-羥基喹啉預處理1 h; 將預處理后的黃藤根尖或莖尖用卡諾固定液(無水乙醇∶冰醋酸=1∶3,/)在4℃冰箱中固定5~24 h; 用1 mol L–1HCl在60℃水浴鍋中解離15 min，之后加入2%纖維素酶和1%果膠酶的混合酶液，在37℃水浴鍋中解離2 h；用改良苯酚品紅溶液染色10~15 min并進行壓片；使用Zeiss Axio Scope A1熒光顯微鏡進行鏡檢，挑選染色體分散良好的細胞進行拍照。

1.4 染色體核型分析

將具有完整細胞輪廓，且染色體分散良好的細胞用ProgRes CapturePro軟件進行圖像采集。根據(jù)一般統(tǒng)計要求，選擇30個染色體分散良好的有絲分裂中期細胞進行觀察，統(tǒng)計具有一致染色體數(shù)目的細胞，把85%以上細胞都具有的染色體數(shù)目定為該植物的染色體數(shù)目。另外，選取5個染色體形態(tài)清晰且無重疊的細胞，使用Adobe Photoshop cc 2017進行圖片修整，利用VIDEOTEST- KYRYO 3.1核型分析軟件對染色體進行分析，將染色體以著絲粒位置為基準拉直，并進行同源染色體匹配。將分析后的染色體核型圖片放到ImageJ測量軟件中對染色體的長度進行測量。參照李懋學等[18]的標準進行核型分析，用Leven[19]的公式進行染色體的相對長度的計算；按郭幸榮等[20]提出的染色體長度分類方法，對黃藤細胞染色體的相對長度系數(shù)(染色體長度/全組染色體平均長度)進行統(tǒng)計并分類；核型類型參照Stebbins[21]的標準，按核型中染色體長度比(最長染色體與最短染色體之比)以及臂比(r=長臂/短臂)大于2的染色體所占比例進行劃分；采用Arano[22]的方法計算核不對稱系數(shù)(As.K=長臂總長/全組染色體總長×100%)。

1.5 流式細胞儀樣品制備和分析

取黃藤實生苗葉片(約1.5 cm)洗凈，放入培養(yǎng)皿中，加入800L裂解液浸泡30 min；用刀片將葉片切碎后補加800L裂解液，輕輕搖勻混合；用300目濾網(wǎng)過濾到10 mL玻璃管中，于4℃下129×離心8 min；棄上清后加入300L的碘化丙啶(PI)染液在4℃下染色20 min；使用流式細胞儀(Beck- man Coulter, Inc., Cell Lab Quanta SC)進行測量，樣品變異系數(shù)控制在5%以內(nèi)，設置3個重復。

已知番茄2C DNA含量為0.92 pg[23](1 pg=978 Mb), 并根據(jù)公式[24]計算黃藤的2C DNA含量= [(樣品G1平均峰值)/(番茄G1平均峰值)]×番茄2C DNA含量(pg)。

2 結果和分析

2.1 染色體數(shù)目

將黃藤莖尖和根尖的染色體制片在顯微鏡下鏡檢，由莖尖細胞制片可觀測到大量的細胞，且容易找到處于有絲分裂中期、染色體分散良好的細胞進行圖像采集，而根尖制片效果較差。因此，以黃藤莖尖制片進行統(tǒng)計測量。根據(jù)核型分析標準化建議擇優(yōu)挑選出30個具有完整中期分裂相的細胞，進行細胞染色體數(shù)目統(tǒng)計。結果表明，有26個細胞的染色體數(shù)目為24，因此黃藤的染色體數(shù)目為2=24 (圖1)。

2.2 染色體核型分析

選擇5個染色體形態(tài)清晰無重疊的細胞，進行染色體核型參數(shù)的測量計算。結果表明，染色體的相對長度為1.554%~7.683%，其中短臂相對長度為0.586%~3.143%，長臂相對長度為0.968%~4.540%; 相對長度系數(shù)為0.373 03~1.843 89 (表1)。根據(jù)染色體相對長度系數(shù)對染色體進行分類，黃藤的長染色體(L)有2條，中長染色體(M2)有9條，中短染色體(M1)有10條，短染色體(S)有3條；黃藤染色體的長度比是1.55%；臂比為1~3.217，黃藤染色體的著絲粒位置為m型的有17條，st型的有1條，sm型的有5條，M型的有1條。黃藤染色體中有20.83%的臂比大于2，最長與最短染色體比值為4.94。因此, 黃藤的核型為“2C”型，其核不對稱系數(shù)為61.20%。

圖1 黃藤染色體圖。A: 中期染色體; B: 核型。

表1 黃藤染色體核型

使用Excel軟件根據(jù)染色體相對長度[25]作圖,得到黃藤染色體核型模式圖(圖2)。

2.3 DNA含量分析

以番茄為內(nèi)標，應用流式細胞術分析黃藤的DNA相對含量。結果表明，碘化丙啶(PI)著色后檢測到的G1期細胞的熒光分布呈高斯曲線分布，其中紅色為對照番茄的峰值出現(xiàn)在約41.01位置, 黃藤的則出現(xiàn)在約68.67的位置；G2期擁有2倍G1期細胞的DNA含量，呈現(xiàn)2倍于G1信號的高斯峰(Dip G2, An1 G2) (圖3)。

根據(jù)已知番茄的DNA含量，估算出黃藤的DNA含量為1.57 pg，黃藤為二倍體植物(2= 24)，按照1 pg=978 Mb，黃藤的基因組大小約為1 539.53 Mb。

3 討論

細胞染色體制片受很多因素的影響，合適的試驗取材是非常重要的一個因素。一般認為植物莖尖細胞生長旺盛，葉綠素含量較多，不適宜用于觀察染色體，因此多選用植物的根尖分生區(qū)進行染色體觀察。腰希申等[26]的研究表明，黃藤莖尖可長期保持分生能力，因此本試驗同時選擇黃藤的根尖和莖尖作為試驗材料進行核型分析。解離可去除細胞間的果膠層，使細胞壁軟化，便于壓片[27]，本試驗對莖尖和根尖采用酸解法、酶解法和先酸解后酶解法等分別處理后進行鏡檢比較，結果表明使用先酸解后酶解的解離方法對黃藤莖尖的效果最好，能夠得到更多良好的染色體圖像，同時莖尖的制片效果優(yōu)于根尖。這可能是因為黃藤莖尖是包被在多層葉片內(nèi)部，比較幼嫩且葉綠素含量較低，而黃藤實生苗的根數(shù)量較少，且主根分支較少，根尖相對老化所致。

圖2 黃藤染色體核型模式圖

圖3 以番茄為內(nèi)標測定黃藤的流式細胞圖。番茄: Dip G1、Dip G2和Dip S; 黃藤: An1 G1、An1 G2和An1 S; ▲: G1期的峰值。

染色體是細胞核中遺傳物質的載體，通常是在細胞周期的分裂中期形成的高度集縮的結構，染色體是不同物種基因組最簡單明了的形象表現(xiàn)。本試驗結果表明，黃藤具有24條染色體，核型為“2C”型，核不對稱系數(shù)為61.02%，核型公式為K(2)= 1M+17m+5sm+1st。這是首次對黃藤進行核型分析，為黃藤屬植物的起源進化研究以及物種分類提供了理論依據(jù)。

基因組大小是指1個基因組中所擁有的DNA的含量，是一個物種所特有的遺傳學參數(shù)，其與物種分類和進化位置具有一定關系，一般認為植物進化程度越高，其基因組越大[28]。隨著流式細胞術的不斷發(fā)展，已經(jīng)在基因組大小測定方面有著非常廣泛的應用[29]。本試驗參考田新民等[30]的方法選擇番茄為參照，在流式細胞樣品的制備過程中，選擇木本植物緩沖液WPB解離液[31]提取黃藤細胞核，選擇具有較高的分辨率及較低的毒性的PI染料[24]進行染色，結果黃藤的基因組大小為1.57 pg。有報道黃藤屬.的基因組大小4C DNA為11.10 pg[32]，這可能與采用的方法和物種倍性不同有關。

隨著物種的不斷繁衍進化，雜交、多倍體及無融合生殖，使原本可以識別的類群之間的界限變的模糊不清，形成多倍體復合體，給分類學處理帶來了極大的困難[33]，分子水平與細胞水平研究的結合是生命科學發(fā)展趨勢所向。染色體核型分析作為一項融合細胞生物學、遺傳學、染色體工程學等多學科的基礎實驗技術，對植物進行核型分析、構建染色體圖譜、植物親緣關系鑒定以及起源進化研究具有重要意義，可以為植物系統(tǒng)分類提供重要依據(jù)。棕櫚藤是熱帶森林中的多用途植物資源，黃藤是具有較高經(jīng)濟價值和開發(fā)前景的藤種之一，本研究測定黃藤為二倍體，基因組大小約為1 539.53 Mb。黃藤的倍性與基因組大小對于更為深入地開展細胞生物以及分子生物研究將具有極大的促進作用，同時也為開展其它棕櫚藤的研究提供了一定的參考依據(jù)。

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Karyotype and Genome Size Analyses of

SHI Jing-jing1,2, XU Rui-jing1,3, XU Hao1,2, MA Shuang1,2, JIA Qiu-rui4, GAO Zhi-min1,2*

(1. State Forestry Administration Key Open Laboratory on the Science and Technology of Bamboo and Rattan,Beijing 100102, China; 2. Institute of Gene Science for Bamboo and Rattan Resources, International Center for Bamboo and Rattan (ICBR), Beijing 100102, China; 3. Institute of Tropical Forest Plant, ICBR, Sanya 572000, Hainan, China; 4. Qianxi County Forestry Bureau, Tangshan 064300, Hebei, China)

In order to explore the karyotype and genome size of, the root and stem tips from its seedlings were used as experimental materials. The karyotype of., including chromosome number and morphology were analyzed by combining the conventional method of somatic cell chromosome preparation with microphotography. Meanwhile, the DNA content, genome size and ploidy of leaves were determined by flow cytometry usingas an internal reference. The results showed that the stem tip of.was an ideal material for chromosome preparation, and the chromosome number was 2=24, along with the formula of karyotype was K(2)=1M+17m+5sm+1st, and the karyotype was “2C”. The karyotype asymmetry index of.was 61.20%. The DNA content of.was about 1.57 pg with the genome size of 1 535.53 Mb, and the DNA ploidy was diploid (2). This was reported the karyotype and genome size of.for the first time, which provided a reference for studying the karyotype and genome of other species inand related genus.

; Chromosome; Karyotype; Genome

10.11926/jtsb.3982

2018-08-13

2018-09-25

“十二五”農(nóng)村領域國家科技計劃項目(2015BAD04B0101)資助

This work was supported by the Planning Project for National Science and Technology of Rural Areas in the 12th Five-year (Grant No. 2015BAD04B0101).

史晶晶，女，碩士研究生。E-mail: shijingjing@icbr.ac.cn

通信作者 Corresponding author.E-mail: gaozhimin@icbr.ac.cn