趙春梅　郭晶

摘要：本試驗(yàn)以黃瓜葉片為材料進(jìn)行基因組DNA提取，優(yōu)化提取高質(zhì)量黃瓜基因組DNA技術(shù)。采用CTAB和SDS兩種提取方法試驗(yàn)，瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示：CTAB法去多糖的效果好，提取的DNA純度高。進(jìn)一步優(yōu)化CTAB提取液成分，發(fā)現(xiàn) 2% CTAB提取緩沖液加pvp和β- 巰基乙醇提取DNA的效果較好，純度高。

關(guān)鍵詞：黃瓜;基因組;提取方法;優(yōu)化研究

中圖分類號(hào)： S642.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2019.12.025

不同植物的核酸結(jié)合蛋白情況各不相同，因此，植物基因組DNA的制備采取的提取方法不同，再有植物中多酚類合物以及多糖的污染會(huì)影響植物DNA的進(jìn)一步利用，要從富含多酚和多糖植物組織中分離獲得高質(zhì)量的基因組DNA也并非易事。本文使用最常用的CTAB法和SDS法提取黃瓜基因組DNA，以優(yōu)化提取方法，為黃瓜種質(zhì)資源保護(hù)、鑒定以及分子育種等試驗(yàn)提供技術(shù)支持。

1材料方法

稱取新鮮黃瓜葉片0.5g，流水沖洗干凈、晾干，用液氮研磨成粉末后分別轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。CTAB提取緩沖液、SDS提取緩沖液的配方，見表1。

1.1 CTAB法和SDS法提取黃瓜基因組DNA

CTAB法：于1.5ml離心管中加入600μl 預(yù)熱65℃的2 % CTAB提取緩沖液，旋渦振蕩混勻，將離心管置于65℃水浴保持30min，每10min輕輕搖晃離心管，使之充分混勻;冷卻2min后，12000rpm離心10min，取上清放在新的離心管中，加入600μl氯仿，輕搖離心管使兩者混合均勻;12000rpm離心10min，取上清轉(zhuǎn)入含有乙醇的離心管中，將離心管上下?lián)u動(dòng)，有絮狀DNA產(chǎn)生;12000rpm離心5min后，倒掉上清液，底部即DNA沉淀，加入無菌水使DNA溶解，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

SDS法：加入600μl 2% SDS提取緩沖液，65℃水浴中保溫30min，每10min輕輕搖晃離心管，使之充分混勻，取出后加入0.7倍5mol·L-1KAc，冰浴30min;12000rpm離心10min;取上清轉(zhuǎn)入另一1.5ml離心管中，然后加入600μl氯仿：異戊醇（24∶1）搖勻，室溫下12000rpm離心10min;取上清加入2/3倍體積的乙醇，顛倒離心管使混勻，靜置10min，12000rpm離心10min;棄上清，室溫下晾干加無菌水使沉淀完全溶解，放入 -20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 不同組分CTAB提取液，提取黃瓜基因組DNA比較

將8個(gè)研磨好的樣品分別加入1.2%CTAB提取緩沖液;2.2%CTAB提取緩沖液和2% pvp;3.2% CTAB提取緩沖液和1%β-巰基乙醇;4.2%CTAB提取緩沖液加1%β-巰基乙醇加2%pvp;5.4%CTAB提取緩沖液;6.4%CTAB提取緩沖液和2% pvp;7.4%CTAB提取緩沖液和1%β-巰基乙醇;8.4%CTAB提取緩沖液加2%pvp加1%β-巰基乙醇;DNA提取步驟同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTAB法和SDS法提取黃瓜DNA的電泳檢測結(jié)果

圖1（A）為CTAB法和SDS法的DNA提取結(jié)果比較，1和2為CTAB法提取黃瓜DNA，3和4為SDS法提取黃瓜DNA。由圖可以看出SDS法提取的DNA電泳帶沒有CTAB法的亮，說明DNA含量高，并且對于多糖的去除效果明顯。SDS提取的DNA量少，但DNA 純度較高。蛋白污染需要進(jìn)一步酚氯仿抽提。考慮到DNA產(chǎn)量問題，認(rèn)為CTAB法提取要優(yōu)于SDS方法。

A：CTAB法和SDS法提取黃瓜基因組DNA

B：不同組分CTAB提取液提取黃瓜基因組DNA

2.2 不同組分CTAB提取液提取黃瓜DNA的電泳檢測結(jié)果

圖1（B）顯示2% CTAB提取緩沖液提取效果較好，4% CTAB提取緩沖液提取的DNA量很少，幾乎沒有電泳帶，說明4%CTAB不適合用于黃瓜DNA的提取。處理1和2的葉片勻漿翠綠透明;處理3透明但顏色較處理1和處理2 稍暗;處理4較1和處理2暗，但比處理3顏色綠。勻漿顏色綠且透明是DNA 提取質(zhì)量高的標(biāo)志。雖然處理A 的葉片勻漿比處理4的更綠，但處理1 中模糊不均一的DNA 條帶都有不同程度的拖尾，說明有程度不同的降解，處理2有膠狀物聚集于點(diǎn)樣孔形成亮帶，說明有多糖和蛋白質(zhì)污染。處理4的DNA條帶清晰，且點(diǎn)樣孔內(nèi)沒有亮帶，說明沒有蛋白質(zhì)和多糖污染，提取黃瓜DNA的效果最好。

黃瓜葉片上的葉脈越多越難研磨，而研磨時(shí)間越長，將導(dǎo)致DNA降解和褐化。2% CTAB法提取的黃瓜葉片的DNA帶整齊明亮。NaCl、巰基乙醇和可溶性PVP能夠有效地去除多糖和多酚類等雜質(zhì)的干擾;若缺少此步驟，即使用酚、氯仿、異戊醇、NaCl和乙醇等物質(zhì)多次抽提或沉淀也無法達(dá)到理想的純化效果。使用CTAB法提取DNA時(shí)，水浴時(shí)間過短會(huì)造成DNA得率的下降，如超過1h，則可能會(huì)引起DNA的降解，因此，適宜的水浴時(shí)間當(dāng)為40～60min。

3 結(jié)論

將CTAB和SDS兩種提取方法對比，CTAB法提取出的DNA較純，產(chǎn)量較高，并且在2%CTAB提取緩沖液中加1% β-巰基乙醇加2%pvp提取效果最好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。