何梓鈺 陳珍 黃俊逸 廖鮮艷 徐寶才

摘 要：為提高公犢奶牛肉的附加值，研究酶解公犢奶牛肉制備抗氧化性活性肽的最佳工藝。采用中性蛋白酶和堿性蛋白酶等5 種酶對(duì)公犢奶牛肉進(jìn)行酶解，以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出酶解產(chǎn)物抗氧化性最高的最適蛋白酶。用最適蛋白酶對(duì)公犢奶牛肉進(jìn)行酶解，通過(guò)單因素試驗(yàn)，研究不同酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH值和酶添加量對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響，然后再用響應(yīng)面分析法對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：中性蛋白酶為最佳的蛋白酶，最優(yōu)酶解條件為加酶量0.61 g/100 mL、pH值6.80、酶解溫度54 ℃、酶解時(shí)間2.92 h。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果表明，公犢奶牛肉中的蛋白質(zhì)分子被成功水解為分子質(zhì)量小于7 kDa的小分子多肽和游離氨基酸;通過(guò)感官評(píng)價(jià)方法研制出一款澄清透明、淡黃色、具有牛肉風(fēng)味的抗氧化活性肽口服液。

關(guān)鍵詞：公犢奶牛肉;酶解;響應(yīng)面分析法;抗氧化;活性肽口服液

Abstract： For value-added utilization of veal， the meat from male dairy calves， the preparation of enzymatic hydrolysis with antioxidant activity from veal protein was optimized. Enzymatic hydrolysis was carried out by using five proteases， such as neutral protease and alcalase. To determine the optimal protease for the maximum antioxidant activity， the resulting hydrolysates were screened for 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） radical scavenging activity. Furthermore， the optimization of hydrolysis conditions including hydrolysis time， pH value， temperature and enzyme dose for improved DPPH radical scavenging activity was investigated by one-factor-at-a-time method and response surface methodology （RSM）. The results showed that neutral protease was the best enzyme for the hydrolysis of beef protein. The optimal hydrolysis conditions were as follows： enzyme dose 0.61 g/100 mL， pH 6.80， temperature 54 ℃ and hydrolysis time 2.92 h. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） showed that protein in meat samples was successfully hydrolyzed into small peptides with a molecular mass less than 7 kDa and free amino acids. The hydrolysate prepared under the optimized conditions was used as an ingredient for formulation of an antioxidant peptide oral liquid. According to sensory evaluation， the oral liquid was clear and yellowish in color with a beef flavor.

Keywords： veal; enzymatic hydrolysis; response surface methodology; antioxidant activity; active polypeptide oral liquid

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190210-027

中圖分類(lèi)號(hào)：TS251.52? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2019）03-0026-08

引文格式：

何梓鈺， 陳珍， 黃俊逸， 等. 酶解公犢奶牛肉制備抗氧化活性肽口服液的工藝優(yōu)化[J]. 肉類(lèi)研究， 2019， 33（3）： 26-33. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190210-027.? ? http：//www.rlyj.net.cn

HE Ziyu， CHEN Zhen， HUANG Junyi， et al. Optimization of the preparation process for enzymatic hydrolysate with antioxidant activity from veal protein and formulation of an active peptide oral liquid[J]. Meat Research， 2019， 33（3）： 26-33. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190210-027.? ? http：//www.rlyj.net.cn

據(jù)我國(guó)農(nóng)業(yè)部和歐盟的專家對(duì)牛乳需求量的分析推測(cè)，到2030年可繁殖奶牛的存欄量將達(dá)1 500 萬(wàn)頭以上，如果這些奶牛都能正常產(chǎn)犢，每年將有同等數(shù)量的牛犢出生，按公、母牛犢1∶1的比例，每年可產(chǎn)公犢奶牛約750 萬(wàn)頭[1]。目前公犢奶牛少量用作培育種公牛，其他大多被宰殺淘汰，犢牛資源嚴(yán)重浪費(fèi)[2-3]。本課題組陳珍等[4]對(duì)初生公犢奶牛肉的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)含量?jī)H次于成年牛肉，達(dá)到鮮質(zhì)量的23%，同時(shí)含有許多活性成分，如鐵、鋅、共軛亞油酸和B族維生素等，而且微量元素的含量高于成年牛肉[5-6]。公犢奶牛肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，除生產(chǎn)食用肉制品外，利用肉中的營(yíng)養(yǎng)成分生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，如功能性食品，將會(huì)大大提升公犢奶牛肉的經(jīng)濟(jì)和健康價(jià)值[7]。生物活性肽的重要來(lái)源是肉類(lèi)[8]，其具有降高血壓及其他促進(jìn)健康的功能，如用作抗氧化劑、抗血栓形成、抗癌、免疫調(diào)節(jié)和抗菌活性[9]。因此可以利用公犢奶牛肉開(kāi)發(fā)抗氧化活性生物肽，應(yīng)用于商業(yè)功能性食品和營(yíng)養(yǎng)保健品[10]。食品級(jí)外源蛋白酶可將肉類(lèi)蛋白水解為大量的生物肽。蛋白酶解技術(shù)是改造蛋白質(zhì)、實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)功能多元化、提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性最有效的途徑之一[11-13]。在牛肉蛋白質(zhì)的酶類(lèi)水解方面，陳珍等[14]曾對(duì)單一酶解和復(fù)合酶解進(jìn)行了總結(jié)與展望。除此之外，厲望等[15]采用堿性蛋白酶酶解帶魚(yú)蛋白制備抗氧化肽;洪鵬志[16]對(duì)羅非魚(yú)肉蛋白酶解液及其超濾液的抗氧化性進(jìn)行研究;Shu Guowei等[17]采用復(fù)合蛋白酶（堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶）水解山羊奶酪蛋白，制備抗氧化活性肽。由此可知，酶解蛋白制備抗氧化多肽是開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑的重要途徑之一[18]。本研究以初生公犢奶牛肉為研究對(duì)象，利用蛋白酶解技術(shù)將牛肉水解為抗氧化活性多肽和氨基酸，以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率作為抗氧化性評(píng)價(jià)的指標(biāo)，通過(guò)蛋白酶的選擇、酶解條件的單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)探討初生公犢奶牛肉酶解的最佳條件，最后通過(guò)感官評(píng)價(jià)等方法，利用水解產(chǎn)物制備功能性多肽口服液，為術(shù)后的康復(fù)病人、胃腸消化功能欠佳者、運(yùn)動(dòng)員以及需要氨基酸和多肽的老人和孩童提供更高價(jià)值的健康促進(jìn)產(chǎn)品，具有十分重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究選用的初生公犢奶牛肉為尚未喂給飼料的初生公犢奶牛肉，由上海光明乳業(yè)牧場(chǎng)提供。酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶及動(dòng)物蛋白水解復(fù)合酶 江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司;焦糖（3%～4%）、肉類(lèi)香精 湖北鑫潤(rùn)德化工有限公司;蜂蜜（3%～5%） 河南淮濱蜂蜜養(yǎng)殖基地;氫氧化鈉、乙醇、鹽酸及碳酸氫鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20 pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司;DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海華連醫(yī)療器械有限公司;UV-2000紫外分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司;3K15臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;Ag1100安捷倫液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 初生公犢奶牛肉酶解工藝

參考王玲玲[19]、成曉瑜[20]等的方法，并結(jié)合公犢奶牛的肉質(zhì)特點(diǎn)，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，確定出牛肉酶解液制作工藝。具體如下：初生公犢奶牛后腿肉清洗→去皮切塊→絞碎成肉糜狀→按比例加入水→90 ℃加熱10 min，攪拌均勻→降至55 ℃→調(diào)節(jié)pH值至7.0→加入蛋白酶→勻速攪拌，恒溫酶解3 h→滅酶→離心（8 000 r/min，4 ℃，10 min）→酶解產(chǎn)物

1.3.2 最適蛋白酶的選擇

實(shí)驗(yàn)所選用的5 種蛋白酶參見(jiàn)表1，分別在其最適反應(yīng)條件下對(duì)初生公犢奶牛肉進(jìn)行酶解，酶解工藝參考1.3.1節(jié)，并測(cè)定酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率，分析其抗氧化性。

1.3.3 DPPH自由基清除率測(cè)定

參考韋獻(xiàn)雅[21]、Ozcelik[22]等的方法。準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為50 g/100 mL的DPPH自由基無(wú)水乙醇溶液，室溫靜置10 min后，取2.5 mL加入0.5 mL待測(cè)樣品溶液中，混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)20 min后，在光程為1 cm的比色皿中測(cè)定其在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度（Am），同時(shí)測(cè)定0.5 mL待測(cè)樣品溶液與2.5 mL無(wú)水乙醇混合溶液在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度（An）以及0.5 mL蒸餾水與2.5 mL 0.04 mg/mL的DPPH自由基無(wú)水乙醇溶液在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A0）。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，結(jié)果取平均值。DPPH自由基清除率按照下式計(jì)算。式中：Am為樣品溶液的吸光度;An為空白溶液的吸光度;A0為對(duì)照溶液的吸光度。

1.3.4 酶解條件的單因素試驗(yàn)

根據(jù)1.3.2節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用篩選出的中性蛋白酶對(duì)公犢奶牛肉進(jìn)行酶解，基礎(chǔ)酶解條件：加酶量為0.30 g/100 mL、溫度55.0 ℃、pH 7.0、酶解3.0 h。為了消除各因素之間的交互影響，固定其中3 個(gè)因素改變1 個(gè)因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)優(yōu)化。

1.3.4.1 酶解pH值的選擇

所選用的中性蛋白酶標(biāo)明的最適pH值范圍為5.5～8.0。選定加酶量為0.30 g/100 mL、酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間3 h，pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，測(cè)定不同pH值條件下酶解物的DPPH自由基清除率，確定最適pH值。

1.3.4.2 酶解溫度的選擇

中性蛋白酶最適反應(yīng)溫度范圍為40～65 ℃。選定加酶量為0.30 g/100 mL、pH值為最適值、酶解時(shí)間3 h，酶解溫度分別為40、45、50、55、60、65 ℃，測(cè)定不同溫度條件下酶解物的DPPH自由基清除率，確定最適溫度。

1.3.4.3 加酶量的選擇

選定酶解時(shí)間3 h，pH值和溫度分別為最適值，加酶量分別為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 g/100 mL，測(cè)定酶解物的DPPH自由基清除率，確定最適加酶量。

1.3.4.4 酶解時(shí)間的選擇

按選定的酶解pH值、酶解溫度及加酶量的最佳參數(shù)，酶解時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h，測(cè)定酶解物的DPPH自由基清除率，確定最適酶解時(shí)間。

1.3.5 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間與pH值顯著影響牛肉蛋白酶解物的抗氧化能力。因此運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以pH值（A）、酶解溫度（B）、加酶量（C）和酶解時(shí)間（D）為變量，DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用二次多項(xiàng)式回歸法處理。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，最適因子固定在2 個(gè)水平之間，高水平和低水平分別取最適因子的相鄰值。響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)如表2所示。

1.3.6 SDS-PAGE分析

參考張謙益等[23]的方法。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoeresis，SDS-PAGE），分離膠和濃縮膠分別為12%和5%;染色及蛋白質(zhì)的定量參考考馬斯亮藍(lán)法[24]。

1.3.7 活性肽口服液的制備

按照表3配方中的比例，將獲得的初生公犢奶牛肉抗氧化肽酶解液分別與白砂糖、蜂蜜、糖漿及其他配料一起加入調(diào)配罐，用攪拌器攪拌，再加入反滲透水至規(guī)定容量。過(guò)濾掉雜質(zhì)后，預(yù)熱至50 ℃進(jìn)行均質(zhì)處理，均質(zhì)壓力保持在20～25 MPa，連續(xù)均質(zhì)2 次，防止產(chǎn)品出現(xiàn)分層、沉淀現(xiàn)象;同時(shí)為了延長(zhǎng)活性肽口服液的保質(zhì)期，對(duì)料液進(jìn)行脫氣處理，脫氣壓力為0.05 MPa，最后進(jìn)行80 ℃滅菌30 min。

1.3.8 活性肽口服液的感官評(píng)價(jià)

參考王林山等[25]的感官分析評(píng)級(jí)指標(biāo)，從色澤、香味、滋味、組織狀態(tài)4 個(gè)方面對(duì)上述3 種公犢奶牛肉活性肽口服液進(jìn)行綜合評(píng)分，有差距的酌情扣分，10 分為滿分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表4所示。

由圖1可知，隨著酶解時(shí)間的增加，各酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。其中，酸性蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率在反應(yīng)5 h時(shí)達(dá)到最高，為86.24%;木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率在3 h時(shí)達(dá)到最高，為85.71%，4 h之后明顯下降;動(dòng)物蛋白水解復(fù)合酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率在3 h時(shí)達(dá)到最高，為76.10%，隨后在1 h內(nèi)，迅速降低至40%左右;堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率變化很小，且一直處在較低水平（40%以下），這是由于堿性蛋白酶是一種疏水性蛋白，不適合動(dòng)物蛋白的水解，比較適合植物蛋白水解;而中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率在反應(yīng)初期就迅速增加，在3 h時(shí)就達(dá)到最高（90.17%），并且中性蛋白酶是一種內(nèi)切酶，可用于各種蛋白質(zhì)，將各種大分子蛋白質(zhì)水解成小分子肽或氨基酸，有利于蛋白質(zhì)的有效吸收和利用。例如，陳衛(wèi)明[26]采用酶解法，篩選出中性蛋白酶為制備貽貝抗氧化肽的最適蛋白酶。

酶的選擇是本研究的關(guān)鍵，酶的種類(lèi)決定了肽鏈長(zhǎng)度和水解的作用位點(diǎn)。同時(shí)，酶的選擇決定了基團(tuán)特異性和不同酶解產(chǎn)物，決定產(chǎn)物的功能和性質(zhì)。對(duì)比酶解不同物質(zhì)的最適蛋白酶發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶更適合水解植物蛋白，而中性蛋白酶更適合水解動(dòng)物蛋白，綜合考慮反應(yīng)時(shí)間及DPPH自由基清除率，并且中性蛋白酶又是一種微生物蛋白，相對(duì)其他酶的成本更低，因此選擇中性蛋白酶作為酶法制備初生公犢奶牛肉抗氧化肽的蛋白酶，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化反應(yīng)條件。

2.2 中性蛋白酶酶解初生公犢奶牛肉的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 pH值對(duì)DPPH自由基清除率的影響

小寫(xiě)字母不同，表示差異顯著（P<0.05）。圖3～5同。

由圖2可知，在pH值為7.0時(shí)，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率達(dá)到最大（83.2%），與其他pH值條件下酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率相比具有顯著性差異（P<0.05）。在酶水解過(guò)程中，pH值是決定酶活性的重要因素之一。pH值偏酸或偏堿均會(huì)降低酶的活性，影響蛋白酶和底物的結(jié)合，使底物蛋白的水解程度下降，從而影響抗氧化活性肽的產(chǎn)生[27]。因此，確定最適pH值為7.0。

2.2.2 酶解溫度對(duì)DPPH自由基清除率的影響

由圖3可知，酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率隨著酶解溫度的升高而逐漸增大，在55 ℃達(dá)到最大值85.6%（P<0.05），然后隨酶解溫度的進(jìn)一步升高而降低。低溫條件下，酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，當(dāng)酶解溫度從40 ℃增加到55 ℃，蛋白水解反應(yīng)占據(jù)主導(dǎo)地位;隨著酶解溫度的升高，酶的活性不斷增強(qiáng)，水解反應(yīng)程度增大，抗氧化活性增強(qiáng)[28]。高溫會(huì)破壞酶的結(jié)構(gòu)，使其失活，當(dāng)酶解溫度超過(guò)60 ℃時(shí)，酶活性下降，水解速率下降，生成的抗氧化肽段減少，因此酶解物的DPPH自由基清除率下降。劉進(jìn)杰等[29]的研究結(jié)果表明，中性蛋白酶的最佳酶解溫度為55 ℃，此溫度條件下螺旋藻酶解物的抗氧化性最高，與本研究的結(jié)果一致。因此，確定中性蛋白酶的最佳酶解溫度為55 ℃。

2.2.3 加酶量對(duì)DPPH自由基清除率的影響

由圖4可知：加酶量為0.3～0.6 g/100 mL時(shí)，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)（P<0.05）;當(dāng)加酶量從0.6 g/100 mL增加到1.2 g/100 mL時(shí)，DPPH自由基清除率基本無(wú)變化（P>0.05）;當(dāng)加酶量超過(guò)0.6 g/100 mL后，DPPH自由基清除率顯著下降（P<0.05）。隨著加酶量的增加，酶解產(chǎn)物的抗氧化活性逐漸增加，但當(dāng)酶添加量達(dá)到一定水平時(shí)，酶解產(chǎn)物的抗氧化活性降低。這主要是由于加酶量增加，酶解能力增強(qiáng)，體系初始反應(yīng)速率很快，大多數(shù)蛋白質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)降解成肽[30];當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度降低到一定水平時(shí)，蛋白質(zhì)水解速率減緩，DPPH自由基清除率的增加變得緩慢。酶質(zhì)量濃度過(guò)大時(shí)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水解成多肽后，這些具有抗氧化性的多肽繼續(xù)被降解為無(wú)抗氧化性的小肽段及游離氨基酸，造成酶解物DPPH自由基清除率降低。為了節(jié)約酶用量、降低成本，確定水解初生公犢奶牛肉蛋白質(zhì)的酶用量為0.6 g/100 mL。

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的影響

由圖5可知，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率隨酶解時(shí)間的增加而顯著上升（P<0.05）;酶解時(shí)間3～4 h時(shí)，DPPH自由基清除率無(wú)明顯變化（P>0.05）;酶解時(shí)間超過(guò)4 h后，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率明顯下降（P<0.05）。這是由于隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，抗氧化肽可能會(huì)過(guò)度水解，短肽和氨基酸含量增加[31]，從而使酶解物的DPPH自由基清除率下降。為了節(jié)約成本，確定酶解初生公犢奶牛肉蛋白質(zhì)的時(shí)間為3 h。

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化初生公犢奶牛肉酶解條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇pH值、酶解溫度、加酶量和酶解時(shí)間4 個(gè)因素，以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。中性蛋白酶水解公犢奶牛肉的條件優(yōu)化采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行29 組試驗(yàn)，其中1～24組為分析試驗(yàn)和零點(diǎn)試驗(yàn)，25～29組為中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)。試驗(yàn)方案如表5所示，顯著性檢驗(yàn)和方差分析如表6所示。

對(duì)表5的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到公犢奶牛肉酶解物DPPH自由基清除率（Y）對(duì)pH值（A）、酶解溫度（B）、加酶量（C）及酶解時(shí)間（D）的二次多項(xiàng)式回歸方程：Y=89.83-4.55A-2.73B-0.62C-1.32D+11.25AB-1.73AC+3.50AD-3.00BC-9.58BD-0.48CD-8.30A2-19.95B2-10.19C2-7.08D2。

由表6可知，模型中的失擬項(xiàng)P=0.11>0.05（不顯著），表明該設(shè)計(jì)模型擬合程度較好。模型的F=4.99，P=0.002<0.01，表明該模型極顯著[32]。綜合以上分析結(jié)果，說(shuō)明模型方程可以較好地反映其真實(shí)性[33]，可用于研究所選4 個(gè)因素的變化對(duì)公犢奶牛肉酶解液DPPH自由基清除率的影響，得到最佳工藝條件。4 個(gè)因素對(duì)酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率大小的影響順序?yàn)閜H值>酶解溫度>酶解時(shí)間>加酶量。因素A以及AB、BC、BD、CD的兩兩因素交互作用對(duì)酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率的影響顯著（P<0.05）。

由圖6～11可知，各因素之間兩兩交互作用的響應(yīng)面圖呈拋物線形狀。其中AB、BD、BC、CD的兩因素交互作用響應(yīng)面坡度較為陡峭，其橢圓形的等高線表明兩因素具有顯著的交互作用[28]。AC、AD的響應(yīng)曲面較為平緩，其圓形的等高線表明兩因素交互作用不顯著。響應(yīng)曲面及等高線圖結(jié)果與回歸模型方差分析的結(jié)果基本一致。利用Design Expert 8.05b軟件得出最優(yōu)酶解條件為pH值6.80、酶解溫度54.17 ℃、加酶量0.61 g/100 mL、酶解時(shí)間2.92 h。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)考慮實(shí)際操作過(guò)程中的實(shí)施情況，可修正酶解參數(shù)為pH值6.80、酶解溫度54 ℃、加酶量0.61 g/100 mL、酶解時(shí)間2.92 h。在此條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得DPPH自由基清除率為（92.25±0.51）%，與預(yù)測(cè)值91.03%相比誤差為1.22%，表明預(yù)測(cè)值和實(shí)際值有很好的擬合性，說(shuō)明模型優(yōu)化出的條件較為準(zhǔn)確，證明中性蛋白酶水解制備初生公犢奶牛肉酶解產(chǎn)物時(shí)最佳水解條件的可靠性和預(yù)測(cè)結(jié)果的實(shí)際可行性。

2.5 酶解產(chǎn)物的SDS-PAGE分析M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白（Marker）;1～9分別為水解0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h的酶解產(chǎn)物。

由圖12可知：上清液中的蛋白質(zhì)都是大分子蛋白質(zhì)，其分子質(zhì)量基本上都大于75 kDa;加入蛋白酶后，隨著水解反應(yīng)的進(jìn)行，大分子蛋白質(zhì)被水解完全，不再出現(xiàn)清晰的條帶;酶解產(chǎn)物電泳圖的條帶主要集中在11 kDa以下的位置，并且隨著反應(yīng)的進(jìn)行，條帶顏色越來(lái)越深。通過(guò)蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率計(jì)算多肽的分子質(zhì)量，可以判斷出隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，牛肉大分子蛋白質(zhì)被水解成分子質(zhì)量小于7 kDa的肽段或游離氨基酸。

2.6 初生公犢奶牛肉活性肽口服液的制備

本實(shí)驗(yàn)室的前期工作已對(duì)初生公犢奶牛肉酶解產(chǎn)物中的氨基酸進(jìn)行了檢測(cè)，酶解產(chǎn)物中含有大量的游離氨基酸，其中8 種必需氨基酸占酶解產(chǎn)物總游離氨基酸的51.65%[4]。此外，還在酶解產(chǎn)物中檢測(cè)到0.176 mg/mL的?；撬醄34]。研究表明，?；撬峋哂姓{(diào)節(jié)心肌細(xì)胞膜功能、抗氧化、解毒和維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓等作用[35]。

以公犢奶牛肉酶解產(chǎn)物調(diào)配的功能性口服液，按照其色澤、香味、滋味和組織狀態(tài)為考核指標(biāo)，召集30 名評(píng)價(jià)員，采用盲標(biāo)的形式按照感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)3 種口服液進(jìn)行打分，并比較不同因素及水平產(chǎn)品的質(zhì)量狀況。

由表7可知，得分最高的為配方3，加入蜂蜜使口服液的滋味及組織狀態(tài)最好。通過(guò)感觀評(píng)價(jià)得出口服液的最適配方為蜂蜜60 g/L、食鹽0.6 g/L、氯化鉀0.1 g/L，調(diào)配出來(lái)的口服液為色澤均勻一致、呈棕黃色的透明液體，味甘甜，具有牛肉風(fēng)味，無(wú)外來(lái)不良?xì)馕?，無(wú)異物和沉淀物。

3 結(jié) 論

選擇中性蛋白酶作為酶法制備初生公犢奶牛肉抗氧化肽的最適蛋白酶，并對(duì)水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率進(jìn)行測(cè)定和分析，并通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化分析方法對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最適的反應(yīng)條件，即pH值6.80、加酶量0.61 g/100 mL、酶解溫度54 ℃、酶解時(shí)間2.92 h。通過(guò)初生公犢奶牛肉水解產(chǎn)物的SDS-PAGE分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了在中性蛋白酶作用下初生公犢奶牛肉水解為分子質(zhì)量小于7 kDa的多肽。最終，利用酶解得到的產(chǎn)物制備了一種具有抗氧化活性的多肽口服液，并通過(guò)感觀評(píng)價(jià)優(yōu)化了口感，使其更受大眾的歡迎。

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