陳小衛(wèi),周睿卿,王順清*

(1.暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院血液科， 廣東廣州510630；2.廣州市第一人民醫(yī)院(華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院)血液科， 廣東廣州510080)

彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤是臨床常見的非霍奇金淋巴瘤的組織類型之一[1]，流行病學(xué)調(diào)查顯示[2]，彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤在成人的非霍奇金淋巴瘤約占35 %～50 %，在臨床治療方面，雖然隨著治療方案的不斷優(yōu)化，患者的預(yù)后已經(jīng)得到有效進(jìn)步，但是仍有40 %的患者死于彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤復(fù)發(fā)[3]。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNAs，lncRNAs)在基因的表達(dá)和調(diào)控中發(fā)揮重要作用，有研究報道顯示，lncRNAs在X染色體沉默、染色體修飾、轉(zhuǎn)錄干擾以及核內(nèi)運輸中發(fā)揮重要作用[4]。在彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，lncRNAs也發(fā)揮著重要作用。臨床發(fā)現(xiàn)，lncRNAs MUC5B-AS1在彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)高于其他癌旁組織[5]，關(guān)于彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤中l(wèi)ncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)的生物學(xué)意義也有待遇進(jìn)一步研究。本研究通過對LncRNA MUC5B-AS1在彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及臨床意義分析，為臨床治療以及分子生物學(xué)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1 一般資料

本次研究對象均來自于2014年6月至2016年7月在我院治療的彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者106例作為研究對象，其中男性患者59例，女性患者47例，年齡平均為(56.72±2.37)歲，原發(fā)于淋巴結(jié)內(nèi)患者39例，原發(fā)于淋巴結(jié)外患者67例，臨床分期，Ⅰ-Ⅱ期患者55例，Ⅲ-Ⅳ期患者51例，臨床實驗室檢查，乳酸脫氫酶異常患者66例， GCB型患者67例，non-GCB型患者39例，另選取淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者106例最為對照組，其中，男性患者55，女性患者51例，年齡平均為(56.63±2.44)歲，兩組患者的性別(χ2=0.301，P=0.582)、年齡(t=0.272，P=0.786)之間的差異不存在統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。所有患者均簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會論證通過。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者符合彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②所有患者CD20(+),治療方案均為利妥昔單抗、阿霉素、長春地辛、環(huán)磷酰胺以及潑尼松聯(lián)合治療；③所有患者影像學(xué)檢查其最少有一個病灶部位可測量在2 cm以上；④患者預(yù)計生存期大于3個月。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤患者；②存在凝血功能障礙患者；③嚴(yán)重心臟、肝、腎功能障礙的患者；④對本研究藥物過敏的患者。

1.2 研究方法

lncRNAs MUC5B-AS1檢測：獲取患者的病灶部位組織后，對病灶部位組織進(jìn)行研磨，研磨細(xì)胞中加入1mlTrizol試劑后，使用冰上裂解法對所有細(xì)胞進(jìn)行裂解，直至觀察不到細(xì)胞結(jié)構(gòu)為止，收集裂解液后分別進(jìn)行離心后，加入200 μl氯仿后，劇烈震蕩后室溫放置5 min，采用12 000 r/min離心15min后，離心結(jié)束后吸取溶解有RNA的氯仿溶液，加入預(yù)冷異丙醇200 μl后再次離心15 min，待離心管管壁張上出現(xiàn)白色沉淀物后即為提取的總RNA，5‘-TGTATGGACTTTGCCCACTGAG3’作為上游引物，以5′TTCAATGAGATTGTGGGAGGAG3′作為下游引物，對提取RNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min，58 ℃30s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。采用2-△△Ct法對細(xì)胞株的lncRNAs MUC5B-AS1含量檢測。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 兩組患者的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)比較。

以疾病組為觀察組，淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者為對照組，比較兩組患者的病灶組織lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)之間的差異。

1.3.2 不同病理類型觀察組患者的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)比較。

分別對觀察組患者的不同疾病分期、性別、年齡、原發(fā)病灶、疾病類型、腫瘤最大直徑、國際預(yù)后指數(shù)(IPI)以及乳酸脫氫酶含量的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況之間的差異進(jìn)行比較。本研究中，以lncRNAs MUC5B-AS1相對表達(dá)量為3.11以上為高表達(dá)，3.11以下為低表達(dá)。

1.3.3 不同lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況的生存期比較。

分別對lncRNAs MUC5B-AS1高表達(dá)患者以及低表達(dá)患者的總生存期以及無進(jìn)展生存期進(jìn)行比較。

1.3.4 不同生存狀態(tài)患者的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況比較。

分別對生存組患者以及死亡組患者的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況進(jìn)行比較。

1.3.5 彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤的COX生存分析。

采用COX生存分析對患者的不同的原發(fā)病灶、疾病類型、腫瘤最大直徑、國際預(yù)后指數(shù)(IPI)、lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況以及乳酸脫氫酶含量的影響進(jìn)行多因素分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)比較

與對照組相比(3.67±1.01)，觀察組患者的lncRNAs MUC5B-AS1相對表達(dá)量(8.55±2.33)顯著提升，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.785，P=0.000)。

2.2 不同病理類型觀察組患者的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)比較。

通過對不同病理類型觀察組患者的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)進(jìn)行比較，不同的原發(fā)病灶、疾病類型、腫瘤最大直徑、國際預(yù)后指數(shù)(IPI)以及乳酸脫氫酶含量的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況之間的差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 不同病理類型觀察組患者的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)比較Tab.1 Expression of lncRNAs MUC5B-AS1 in different pathological types of observation group was compared

2.3 不同lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況的生存期比較。

通過對患者開展為期3年的隨訪?；颊唠S訪率為100 %，lncRNAs MUC5B-AS1高表達(dá)組患者的總生存期以及無進(jìn)展生存期顯著低于lncRNAs MUC5B-AS1低表達(dá)組，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 不同lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況的生存期比較Tab.2 Survival time comparison of different expression of lncRNAs MUC5B-AS1

2.4 不同生存狀態(tài)患者的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況比較。

通過隨訪，觀察組患者發(fā)生死亡患者75例，生存患者31例，MUC5B-AS1高表達(dá)組患者的死亡率顯著高于MUC5B-AS1低表達(dá)組患者，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3。

表3 不同生存狀態(tài)患者的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況比較Tab.3 Expression of lncRNAs MUC5B-AS1 in patients with different survival status was compared

2.5 彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤的COX生存風(fēng)險分析

通過對彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤的COX比例風(fēng)險回歸模型的多因素風(fēng)險分析，患者的原發(fā)病灶、疾病類型、腫瘤最大直徑、國際預(yù)后指數(shù)(IPI)、lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況以及乳酸脫氫酶含量均為彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者生存的獨立影響因素，詳見表4。

表4 彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤的COX生存風(fēng)險分析Tab.4 COX survival risk analysis of diffuse large B-cell lymphoma

3 討論

彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤之一[7]，有研究報道顯示[8]，彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展過程中基因表達(dá)的異常發(fā)揮重要作用。所以在臨床研究中，及時對患者的靶向基因的篩選以及鑒定對于患者的治療以及診斷具有積極的意義[9]。所以在臨床上，及時對彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的基因型表達(dá)具有重要意義。分子生物學(xué)研究認(rèn)為[10]，lncRNAs在多種腫瘤性疾病的異常表達(dá)已經(jīng)得到證實，同時臨床證實，lncRNAs與患者的預(yù)后顯著相關(guān)[11]。lncRNAs MUC5B-AS1主要通過對患者的細(xì)胞周期蛋白D1進(jìn)行調(diào)監(jiān)控，促進(jìn)患者的腫瘤細(xì)胞的增殖，有研究報道顯示[12]，彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤的遷移、侵襲以及轉(zhuǎn)移是造成患者不良預(yù)后的關(guān)鍵因素。

在本研究中，彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的lncRNAs MUC5B-AS1顯著高于對照組，同時，通過對患者的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況與病理情況的分析中，不同的原發(fā)病灶、疾病類型、腫瘤最大直徑、國際預(yù)后指數(shù)(IPI)以及乳酸脫氫酶含量的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況之間的差異存在統(tǒng)計學(xué)意義，具體分析中，患者的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、GCB型、腫瘤最大徑在5cm以上，IPI指數(shù)在3-5之間均為lncRNAs MUC5B-AS1高表達(dá)的影響因素。而對不同的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況與患者的生存情況之間的分析中，隨著患者的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況的升高，患者的生存期顯著降低，分析認(rèn)為，lncRNAs 在總的RNAs占比為80 %[13]，可通過對患者的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNAs的加工，在彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。有研究報道顯示，在正常人體中，在lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況較低，但是lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)具有較強(qiáng)的組織特異性，參與機(jī)體織以及細(xì)胞功能的精密調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，lncRNAs MUC5B-AS1作為腫瘤基因在疾病的增殖以及遷移過程中發(fā)揮重要作用。王貴露等[14]在對lncRNAs MUC5B-AS1與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)系中指出， lncRNAs MUC5B-AS1與肺腺癌患者的發(fā)生發(fā)展過程中的增殖、遷移以及浸潤密切相關(guān)，而本研究中發(fā)現(xiàn)， lncRNAs MUC5B-AS1與患者的彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的疾病分型、疾病分期以及生存狀態(tài)顯著相關(guān)，進(jìn)一步證實，lncRNAs MUC5B-AS1與多種腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展顯著相關(guān)。

同時，通過對彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的生存COX比例風(fēng)險回歸模型的多因素風(fēng)險分析，患者的原發(fā)病灶、疾病類型、腫瘤最大直徑、國際預(yù)后指數(shù)(IPI)、lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況以及乳酸脫氫酶含量均為彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者生存的獨立影響因素，提示，在疾病的治療過程中，可針對患者的治療，將lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)作為治療的靶點[15]，同時，通過對患者的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況對患者的治療效果進(jìn)行評價。

本研究還存在一定的局限性，僅僅對患者的lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況與疾病的遷移以及浸潤情況進(jìn)行比較，但是并未對lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)與疾病的具體分子機(jī)制展開分析，有待在日后的研究中進(jìn)行。

綜上所述，lncRNAs MUC5B-AS1表達(dá)情況在彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，在彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的增殖過程中可能發(fā)揮促進(jìn)作用，其可作為彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的未來治療的靶點。