薛葉薇，曾俊祥，趙 樂(lè)，李昊遠(yuǎn)，黃 勇，李桂銀

(桂林電子科技大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，廣西桂林 541004)

0 引言

糖尿病特征在于血糖水平升高(高血糖)，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，如中風(fēng)、肥胖、 腎衰竭和冠心病的風(fēng)險(xiǎn)增加[1-3]。因此靈敏地檢測(cè)血液中的葡萄糖有利于相關(guān)疾病的治療[4-5]。在許多不同的葡萄糖檢測(cè)技術(shù)中，電化學(xué)傳感器被認(rèn)為是目前最成功的葡萄糖檢測(cè)方法[6-7]。近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，利用各種納米材料(如納米金、銀、鉑、量子點(diǎn)、碳納米管、石墨烯等)來(lái)構(gòu)建生物傳感器，提高傳感器靈敏度,實(shí)現(xiàn)化學(xué)信號(hào)到電子信號(hào)的轉(zhuǎn)變[8-10]。但是，針對(duì)其關(guān)鍵的技術(shù)研究仍然無(wú)法滿足市場(chǎng)的需求，尤其是葡萄糖傳感器[11]。還原氧化石墨烯(RGO)是一種性能優(yōu)異的碳納米材料，具有獨(dú)特的電子、物理、機(jī)械和化學(xué)性質(zhì)，因此被廣泛用于物理和化學(xué)領(lǐng)域[12-13]。然而，由于其分子間π-π堆積較強(qiáng)，RGO容易產(chǎn)生團(tuán)聚和夾層，從而影響分散，阻礙了進(jìn)一步的應(yīng)用[14]。柿單寧(PT)提取于柿子，是一種水溶性和低成本的天然生物聚合物，可通過(guò)π-π和靜電相互作用吸附在RGO表面上，以防止聚集來(lái)獲得更好的穩(wěn)定性[15-16]。

本研究通過(guò)抗壞血酸還原法制備柿單寧-還原型氧化石墨烯-鉑-鈀合金(PT-RGO -Pt-Pd)納米復(fù)合材料。然后用滴涂法將PT-RGO-Pt-Pd修飾到金電極表面，構(gòu)建了基于PT-RGO-Pt-Pd納米復(fù)合材料的新型無(wú)酶血糖傳感器，對(duì)葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)柿單寧來(lái)阻止石墨烯產(chǎn)生團(tuán)聚促進(jìn)其分散，從而提高了Pt-Pd納米粒子對(duì)葡萄糖的催化活性。利用Pt-Pd納米粒子良好的電催化能力，RGO的高導(dǎo)電性和PT的良好生物相容性，通過(guò)相互協(xié)同作用獲得更優(yōu)異的性能。該傳感器對(duì)葡萄糖的檢測(cè)具有靈敏度高、選擇性、穩(wěn)定性好和響應(yīng)時(shí)間短等特點(diǎn)，可用于對(duì)臨床樣品的檢驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；電化學(xué)測(cè)量采用三電極系統(tǒng)：修飾的金電極為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極；掃描電子顯微鏡(SEM，Quanta 200，Elementar，德國(guó))；X射線衍射(XRD，D8 Advance，德國(guó))。柿單寧(廣西德坤農(nóng)品有限公司)，氧化石墨烯(GO)(南京先豐納米材料科技公司)，氯鉑酸(H2PtCl6)、硝酸鈀(Pd(NO3)2)和抗壞血酸(AA)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 PT-RGO-Pt-Pd納米復(fù)合材料的制備

將10 mL 0.1 mg/mL的GO超聲攪拌2 h形成勻的懸浮液，然后緩慢加入10 mg AA并攪拌12 h獲得還原氧化石墨烯。接著將20 mg的柿單寧加入10 mL 0.1 mg/mL RGO分散液，超聲約90 min獲得均勻良好分布的PT-RGO懸浮液。最后，將2 mL 0.01 g / mL H2PtCl6和2 mL 0.05 g/mL Pd(NO3)2溶液加入到RGO-PT懸浮液中，再緩慢加入10 mg AA并攪拌20 h，隨后將混合溶液離心15 min 10 000 r/min，去除上清液，用超純水洗滌3次，得到PT-RGO-Pt-Pd納米復(fù)合材料，干燥后儲(chǔ)存4 ℃的冰箱中備用。

1.3 無(wú)酶葡萄糖傳感器的構(gòu)建

首先將金電極依次用粒徑為1.0 μm、0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末拋光，在乙醇和蒸餾水中分別超聲5 min，沖洗后置于0.5M的H2SO4溶液中進(jìn)行電化學(xué)循環(huán)伏安掃描活化10圈，再用0.1M的 PBS充分洗滌；將5 μL 0.1mg /mL PT- RGO-Pt-Pd 溶液滴加到拋光后的金電極表面并在室溫下晾干；滴加3次PT- RGO-Pt-Pd溶液后，得到基于PT-RGO-Pt-Pd復(fù)合納米材料的無(wú)酶葡萄糖生物傳感器。

1.4 葡萄糖的檢測(cè)

采用三電極體系，鉑電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極，修飾后的金電極為工作電極，0.1 M PBS (pH為7.4、含0.1 M KCl)為電解質(zhì)溶液，利用電化學(xué)工作站，采用電流-時(shí)間法(i-t)進(jìn)行葡萄糖的計(jì)時(shí)響應(yīng)測(cè)量。在測(cè)量過(guò)程中，連續(xù)滴加一定濃度的葡萄糖，工作時(shí)間為300 s，間隔時(shí)間50 s，同時(shí)通過(guò)磁力攪拌器攪拌溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 PT-RGO-Pt-Pd材料及傳感器的表征

圖1為石墨烯和PT-RGO-Pt-Pd納米復(fù)合材料的掃描電鏡圖。由圖1(a)可以觀察到石墨烯材料呈片狀結(jié)構(gòu)，圖1(b)可以看到膜狀的物質(zhì)包裹著許多白色的球狀物體，該薄膜為PT-RGO復(fù)合材料，而白色球狀顆粒則為Pt，Pd納米粒子且尺寸在100 nm左右，兩圖對(duì)比說(shuō)明PT-RGO-Pt-Pd納米復(fù)合成材料的成功制備，且分散地較均勻。

(a)石墨烯

(b)PT-RGO-Pt-Pd

為進(jìn)一步驗(yàn)證PT-RGO-Pt-Pd納米復(fù)合材料的制備成功，用XRD衍射儀對(duì)PT-RGO-Pt-Pd復(fù)合材料的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，見(jiàn)圖2。由圖2可知，2θ= 24.9°的衍射峰對(duì)應(yīng)于石墨烯的C(002)晶面。在2θ=39.7°、46.1°和67.4°處的衍射峰分別對(duì)應(yīng)于Pt和Pd NPs的(111)、(200)和(220)面。由于Pt和Pd納米粒子與同一族相匹配，因此具有相同的晶體結(jié)構(gòu)。從圖中可以看出，C(002)峰較強(qiáng)，而Pt和Pd納米粒子衍射峰的峰值較弱，進(jìn)一步確定Pt和Pd納米粒子已經(jīng)吸附在石墨烯表面，衍射峰越尖銳，表明結(jié)晶度越好。

圖2 PT-RGO-Pt-Pd納米復(fù)合材料的XRD圖譜

圖3 無(wú)酶血糖傳感器的CV曲線

傳感器的表征以5 mmol/L K4Fe(CV)6/K3Fe(CV)6- 0.1 mol/L KCl溶液為電解質(zhì)，采用循環(huán)伏安法(CV)對(duì)裸金電極和PT- RGO-Pt-Pd復(fù)合材料修飾后的金電極進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃描速率為0.01 V/s，掃描電壓為-0.2～0.6 V，所得循環(huán)伏安曲線如圖3所示。從圖3中可以看出，與裸金電極相比，PT-RGO-Pt-Pd納米復(fù)合材料修飾后的金電極氧化還原峰電流值增大，電流更強(qiáng)。圖3證明了修飾后的電極比裸電極的電子傳遞速率增強(qiáng)，PT-RGO-Pt-Pd無(wú)酶血糖傳感器的構(gòu)建是成功的。

2.2 檢測(cè)條件對(duì)傳感器性能的影響

2.2.1 體系pH對(duì)傳感器性能的影響

電解質(zhì)的酸堿度會(huì)影響葡萄糖的催化氧化，分別以pH=6(曲線 a)、7(曲線b)、8(曲線c)、9(曲線d)、10(曲線e)的PBS緩沖溶液作為支持電解質(zhì)，采用電流-時(shí)間法(i-t)進(jìn)行檢測(cè)，每隔50 s滴加100 μL 0.1M 的葡萄糖溶液，所得i-t曲線如圖4所示。從圖4中可以看出，PBS緩沖溶液的pH在5～7之間時(shí)，相應(yīng)電流值隨pH的升高而增大，PBS緩沖溶液的pH在8～10之間時(shí)，雖也有電流變化，但電流逐漸變小且曲線波動(dòng)較大。由此得出結(jié)論，PT-RGO-Pt-Pd/GE無(wú)酶血糖傳感器的最佳體系pH值在7～8之間。

圖4 不同pH值對(duì)傳感器性能的影響

2.2.2 檢測(cè)電位對(duì)傳感器性能的影響

檢測(cè)電位的大小同樣會(huì)影響葡萄糖的催化，以PBS(pH7.4)緩沖溶液作為支持電解質(zhì)，采用i-t進(jìn)行檢測(cè)，每隔50 s滴加100 μL 0.1M的葡萄糖溶液，檢測(cè)電位分別為-0.1 V(曲線 a)、-0.2 V(曲線b)、-0.3 V(曲線c)、-0.4 V(曲線d)，所得i-t曲線見(jiàn)圖5。當(dāng)檢測(cè)電位為-0.1 V時(shí)，電流值幾乎無(wú)變化；當(dāng)檢測(cè)電位為-0.2 V時(shí)，電流值變化較弱，在圖中不明顯。當(dāng)電流值為-0.3 V時(shí)，電流值變化明顯且較為穩(wěn)定；當(dāng)檢測(cè)電位為-0.4 V時(shí)，電流值雖有變化，但由于電流波動(dòng)較大，所以電流變化在圖中不明顯，原因可能是基線不平。因此PT-RGO-Pt-Pd/GE無(wú)酶血糖傳感器的最佳檢測(cè)電位為-0.3 V，后續(xù)檢測(cè)都在-0.3 V電位下進(jìn)行。

圖5 不同檢測(cè)電位對(duì)傳感器性能的影響

2.3 工作曲線的繪制

在PT-RGO-Pt-Pd復(fù)合材料基礎(chǔ)上，采用無(wú)酶生物傳感器促進(jìn)葡萄糖的氧化，并測(cè)定在恒電位下通過(guò)i-t方法獲得催化氧化電流。圖6顯示PT-RGO-Pt -Pd/GE在-0.3 V電位下對(duì)葡萄糖催化的電流響應(yīng)曲線，50 s間隔連續(xù)添加至0.1M PBS(5次添加)。加入葡萄糖后電極迅速反應(yīng)，達(dá)到95%的穩(wěn)態(tài)電流小于2 s(見(jiàn)圖6)，表明傳感器對(duì)葡萄糖的反應(yīng)迅速和敏感。圖7顯示了無(wú)酶葡萄糖生物傳感器的工作曲線。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，分別對(duì)不同濃度的葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)，響應(yīng)電流與葡萄糖濃度在0.01～0.4 mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=1.304 6x-0.001 86(y為傳感器響應(yīng)電流值，x為葡萄糖濃度)，相關(guān)系數(shù)為0.998 73，最低檢測(cè)限為1.43 μmol/L(S/N=3)。

圖6 PT-RGO-Pt-Pd/GE傳感器對(duì)葡萄糖的電流響應(yīng)曲線

圖7 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 傳感器的特異性及穩(wěn)定性

以抗壞血酸(AA)、多巴胺(DA)、尿酸(UA)、二羥基苯乙酸(DOPAC)等為干擾物質(zhì)，將其添加到葡萄糖溶液中，按照最佳條件進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，并計(jì)算干擾物質(zhì)對(duì)葡萄糖響應(yīng)電流值的影響，如圖8所示。結(jié)果表明，在特異性實(shí)驗(yàn)中，抗壞血酸對(duì)響應(yīng)電流值的影響為1.66%，L-多巴胺對(duì)響應(yīng)電流值的影響為2.25%，尿酸對(duì)響應(yīng)電流值的影響為0.60%，二羥基苯乙酸對(duì)響應(yīng)電流值的影響為2.25%。所加入的干擾物質(zhì)對(duì)構(gòu)建的無(wú)酶血糖傳感器的影響較小，尤其是尿酸，對(duì)電流的干擾僅僅為0.60%，表明該傳感器有較強(qiáng)的抗干擾能力。

圖8 干擾物質(zhì)對(duì)PT-RGO-Pt-Pd/ GE無(wú)酶血糖傳感器的影響

在最優(yōu)條件下將3個(gè)在相同條件下制備的PT-RGO-Pt-Pd納米復(fù)合材料修飾的金電極，置于濕潤(rùn)環(huán)境下4 ℃冰箱保藏，隔5 d測(cè)試，檢測(cè)其對(duì)葡萄糖的安培響應(yīng)，結(jié)果顯示在儲(chǔ)備時(shí)間達(dá)到20 d時(shí)，響應(yīng)電流僅下降到初始值的80%，表明該傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

以柿單寧為成膜物質(zhì)，通過(guò)抗壞血酸直接還原制備PT-RGO-Pt-Pd納米復(fù)合材料?；赗GO-PT納米雜化體的良好的生物相容性和電子轉(zhuǎn)移能力以及Pt-Pd納米粒子高效的催化性能，開(kāi)發(fā)了一種基于PT-RGO- Pt-Pd/GE新型的無(wú)酶葡萄糖生物傳感器。該無(wú)酶葡萄糖傳感器的響應(yīng)電流與葡萄糖濃度在0.01～0.40 mol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，最低檢測(cè)限為1.43 μmol/L，響應(yīng)時(shí)間2 s。這種新穎的無(wú)酶血糖生物傳感器靈敏度高、選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，有望應(yīng)用于臨床實(shí)際樣本的檢測(cè)，為糖尿病中的血糖檢測(cè)提供高靈敏度、高選擇性的快速檢測(cè)方法。