黨士坤 王勝芳 史 森 韓淑蘭 王慧梅

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

木豆(Cajanuscajan(L.) Millsp.)為豆科(Leguminosae)木豆屬(Cajanus)植物，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是一種多用途木本豆類作物，可食用?，F(xiàn)代研究表明木豆具有多種藥理活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗癌等。黃酮類化合物是木豆中主要的有效藥用成分，其中染料木素是木豆根中一種重要的異黃酮類化合物[1～2]，作為臨床治療藥物，食品添加劑和營(yíng)養(yǎng)制品得到了廣泛應(yīng)用[3～4]。

不定根培養(yǎng)具有高效率，材料來(lái)源穩(wěn)定，培養(yǎng)條件可控及高重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)。將不定根培養(yǎng)用于藥用植物培養(yǎng)上可以克服藥用植物有效成分含量低，不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，同時(shí)可源源不斷地為生產(chǎn)提供原料。研究表明在植物組織培養(yǎng)中添加誘導(dǎo)子可以改變細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，提高植物細(xì)胞中特定次生代謝產(chǎn)物含量。誘導(dǎo)子被用于各類植物細(xì)胞培養(yǎng)中，以促進(jìn)代謝產(chǎn)物的合成[5]。茉莉酸甲酯(MJ)作為一種常用的誘導(dǎo)子，對(duì)多種代謝產(chǎn)物合成具有促進(jìn)作用[6～7]，MJ處理提高了丹參毛狀根中丹參酮的含量，促進(jìn)了黃芩毛狀根中黃芩苷的合成，使刺五加不定根中的刺五加苷含量增加[8～10]。

本研究在已建立木豆不定根培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，研究了誘導(dǎo)子MJ對(duì)木豆不定根中染料木素含量的影響，并對(duì)其抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行了研究，以期為木豆不定根的大規(guī)模培養(yǎng)提供理論指導(dǎo)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 研究材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 木豆不定根來(lái)源

將木豆種子用70%酒精消毒30 s，然后在4%的次氯酸鈉中消毒2 min，無(wú)菌水沖洗3次，并用無(wú)菌濾紙吸干木豆表面水分，接種于MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，待無(wú)菌苗生長(zhǎng)到12 d剪取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的不定根，用無(wú)菌水沖洗掉表面的瓊脂并接種于1/2MS液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)，進(jìn)行誘導(dǎo)子實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 木豆不定根處理

準(zhǔn)確稱取1.1.1中培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的不定根0.5 g接種在新鮮的1/2MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后，分別加入0,50,100,200 μmol·L-1MJ，培養(yǎng)0，24，48，72，96 h后分別取樣，將一部分不定根烘干，用于檢測(cè)染料木素含量，另一部分迅速在液氮中冷凍，然后放入-80℃的冰箱中進(jìn)行保存，用于生理生化指標(biāo)的測(cè)定，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2 研究方法

1.2.1 木豆不定根中染料木素的測(cè)定

干重為0.2 g的木豆不定根樣品加入8 mL 70%乙醇超聲提取1 h，重復(fù)提取3次，離心后合并上清液，濃縮后利用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。

使用的HPLC系統(tǒng)由Waters1525高效液相色譜儀、Waters2478檢測(cè)器和Waters SunFireC18色譜柱(250 nm×4.6 mm，5 μm)組成。流動(dòng)相為甲醇∶水∶甲酸=65∶34.935∶0.065(V∶V∶V)，流速為1 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=152.68X+1 086.8(R2=0.996 2)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程來(lái)計(jì)算染料木素的含量[13]。

1.2.3 不定根中抗氧化酶活性的測(cè)定

粗酶液的提?。悍Q取0.4 g鮮樣，加入8 mL pH為7.8的50 mmol·L-1的磷酸緩沖液。冰浴研磨后，4℃，6 000 r離心10 min，上清液即為酶液，轉(zhuǎn)移到另一試管備用。

POD酶活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定[15]，CAT酶活性測(cè)定采用過(guò)氧化氫還原法測(cè)定，SOD酶活性測(cè)定采用NBT還原法測(cè)定[16]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用Duncan法，利用excel軟件繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 MJ對(duì)木豆不定根次生代謝產(chǎn)物的影響

2.1.1 不同濃度與時(shí)間的MJ對(duì)木豆不定根染料木素的影響

由圖1可以看出，MJ對(duì)木豆不定根染料木素的合成有明顯的促進(jìn)作用，同時(shí)也可以發(fā)現(xiàn)其濃度和處理時(shí)間對(duì)染料木素合成有重要影響，200 μmol·L-1MJ處理和對(duì)照相比，作用效果不明顯。50與100 μmol·L-1的MJ處理對(duì)不定根染料木素合成有明顯促進(jìn)作用，100 μmol·L-1的MJ處理48 h時(shí),不定根中染料木素積累量達(dá)到最大值為1.39 mg·g-1，約為對(duì)照組的4.03倍。

圖1 MJ不同濃度與不同時(shí)間的處理對(duì)木豆不定根染料木素含量的影響Fig.1 Effects of different concentrationand time of MJ treatment on genistein content in the adventitious roots of pigeon pea

圖2 MJ處理對(duì)木豆不定根活性氧的影響Fig.2 Effect of MJ treatment on reactive oxygen speciesin adventitious roots of pigeon pea

2.2 MJ對(duì)木豆不定根活性氧產(chǎn)生和抗氧化酶活性的影響

2.2.1 MJ處理對(duì)木豆不定根中活性氧的影響

2.2.2 MJ處理對(duì)不定根中抗氧化酶的影響

如圖3所示，當(dāng)MJ濃度為100 μmol·L-1時(shí)，隨著處理時(shí)間的增加，POD活性從24 h開始增加明顯，在此之后隨處理時(shí)間的增加，POD活性維持在較高水平，在48 h時(shí)達(dá)到最大值為13.17 U·g-1·min-1為對(duì)照組的1.6倍。CAT活性也有所提高，在處理時(shí)間為72 h時(shí)，達(dá)到最大值77.12 U·g-1·min-1為對(duì)照組的1.38倍。SOD活性隨處理時(shí)間的增長(zhǎng)先升高后下降，在48 h時(shí)達(dá)到酶活性的最大值82.54 U·g-1為對(duì)照組的1.2倍。

圖3 MJ處理對(duì)木豆不定根POD、CAT及SOD酶活性的影響Fig.3 Effect of MJ treatment on POD, CAT and SOD activity in adventitious roots of pigeon pea

2.3 討論

次生代謝產(chǎn)物是植物在進(jìn)化中與環(huán)境相互作用產(chǎn)生的保護(hù)自身的物質(zhì)，近年來(lái)大量研究表明，非生物誘導(dǎo)子可以調(diào)節(jié)特定基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)植物代謝過(guò)程[17～18]。通過(guò)在植物組織培養(yǎng)中添加誘導(dǎo)子進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的合成已經(jīng)引起越來(lái)越多國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[19]。MJ處理后人參毛狀根中三萜皂苷含量提高[20]。MJ處理喜樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液增加了喜樹堿的積累[21]。我們的研究也得到了類似的結(jié)果，MJ明顯促進(jìn)了木豆不定根染料木素的合成，而且這種促進(jìn)作用受MJ的濃度和作用時(shí)間的影響，當(dāng)MJ的濃度達(dá)到200 μmol·L-1時(shí)，和50和100 μmol·L-1的處理相比，染料木素的合成能力明顯降低，說(shuō)明較高濃度的MJ對(duì)木豆不定根染料木素的合成起到了一定的抑制作用。

3 結(jié)論

誘導(dǎo)子MJ能明顯促進(jìn)木豆不定根染料木素的合成，且受濃度和處理時(shí)間的影響，誘導(dǎo)子MJ處理過(guò)程中，木豆的不定根發(fā)生了明顯的氧化脅迫，抗氧化酶起到了一定的保護(hù)作用，但不足以消除活性氧的影響，這種氧化脅迫導(dǎo)致了次生代謝產(chǎn)物的合成。