李辛雷 王佳童, 孫振元 王 潔 殷恒福 范正琪 李紀元

(1.中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，杭州 311400； 2.林木遺傳育種國家重點實驗室，中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，北京 100091)

山茶屬(Camellia)金花茶組(Section Chrysantha Chang)植物有30多種[1]，其花朵和葉片中多含有類黃酮、多糖、多酚及皂苷等活性成分，具有降血糖、降血脂和抗腫瘤、抗抑郁癥等藥理功效[2～5]。目前，利用金花茶(C.nitidissima)花朵和葉片開發(fā)的片劑、粉劑和濃縮液等產(chǎn)品已投放市場[1]。對金花茶類植物活性成分的研究有利于開發(fā)其藥用食用價值，提高其經(jīng)濟附加值，但目前相關(guān)研究多集中于類黃酮、多糖等總量分析方面[3～4]，類黃酮組分的鑒定主要集中在金花茶等少數(shù)物種上，如對金花茶花朵化學成分的研究表明，其花中含有槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-蕓香糖苷等類黃酮成分[6～7]，但其花朵、葉片中類黃酮等活性成分含量及其變化特征尚不清楚，此外，大多數(shù)金花茶組植物類黃酮成分的研究工作尚未涉及，因此，極大地限制了金花茶組植物類黃酮等活性成分的開發(fā)利用。

崇左金花茶(C.chuangtsoensis)為山茶屬金花茶組植物，不同于其他金花茶組物種，崇左金花茶花期較長，其盛花期為6～8月，但在適宜栽培條件下，一年四季都可以開花，被稱為四季金花茶[8]，因此，有望為金花茶類花朵活性成分的開發(fā)持續(xù)提供原材料。崇左金花茶花色深黃色，含有類黃酮等活性成分[1]，是提取金花茶植物類黃酮成分的優(yōu)良材料，可用于開發(fā)金花茶類黃酮藥品及食品等，但目前關(guān)于崇左金花茶的研究主要集中于栽培[9]、氨基酸成分[10]及遺傳標記開發(fā)[11]等方面，而關(guān)于其類黃酮成分含量及其變化特征尚不清楚。不同于紫外—可見分光光度法和高效液相色譜法，超高效液相色譜—四極桿—飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可提供譜峰的光譜和質(zhì)譜信息，即使沒有標準化合物，通過分析質(zhì)譜信息及對比文獻數(shù)據(jù)也可以鑒定各組分，并通過標準品進行含量分析[12]。鑒于此，本試驗利用超高效液相色譜—四極桿—飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對崇左金花茶花朵(花瓣、雄蕊)和葉片(老葉、新葉)中類黃酮成分及其含量進行分析，研究崇左金花茶類黃酮成分的變化規(guī)律，以期為崇左金花茶資源的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為崇左金花茶盛開期花朵(花瓣、雄蕊)和老葉、新葉(圖1)，所有材料均來源于中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所山茶種質(zhì)資源庫。選取生長狀況一致的崇左金花茶5株，每株采摘樹冠外圍南面枝條上老葉、當年生新葉及盛開期花朵各3朵。

1.2 試劑

標準品槲皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、山柰酚、山柰酚-3-O-葡萄苷、木犀草素、圣草素和蕓香柚皮苷購于Sigma公司，純度≥98%；兒茶素和表兒茶素購于北京索萊寶科技有限公司，純度≥98%。

1.3 儀器與設備

ACQUITYTM UPLC I-Class超高效液相色譜系統(tǒng)(Waters Corporation，Milford，MA，USA)，Xevo G2-XS QTof MS質(zhì)譜系統(tǒng)(Waters Corporation，Manchester，UK)，UNIFI 1.8軟件系統(tǒng)；Milli-Q-Gradient超純水制備系統(tǒng)。

圖1 崇左金花茶花朵和葉片 A.花朵；B.老葉；C.新葉Fig.1 Flower and leave of C.chuangtsoensis A.Flower; B.Old leaf; C.New leaf

1.4 方法

1.4.1 定性分析

崇左金花茶新鮮花瓣、雄蕊、老葉和新葉各0.6 g，液氮研磨成粉末，加甲醇∶水∶甲酸∶THF(70∶27∶2∶1，體積比)提取溶劑2 mL浸提[13]，24 h后依次用濾紙及0.22 μm濾膜過濾，濾液保存在-20℃冰箱備用[14]。

利用超高效液相色譜—四極桿—飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對花瓣、雄蕊、老葉和新葉中類黃酮成分進行定性與定量分析。色譜柱為ACQUITY BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，以0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)為流動相，流速0.3 mL·min-1；洗脫程序為0～1.5 min，5% B；1.5～11 min，5%～40% B；11～14 min，40%～95% B；14～16.5 min，95% B；16.5～16.8 min，95%～5% B；16.8～20 min，5% B。每次進樣量為2 μL，柱溫40℃，自動進樣器溫度維持在4℃。電噴霧電離離子源(ESI)，準確質(zhì)量數(shù)用亮氨酸腦啡肽作校正液。離子化模式為正離子，離子源溫度為120℃，脫溶劑氣體為高純度氮氣，溫度為450℃，流速為600 L·h-1，毛細管電壓為1 kV，錐孔電壓為40 V，掃描范圍為50～1 200 m/z。低能量掃描時電壓為6 eV，高能量掃描時電壓為20～45 eV。數(shù)據(jù)采集模式為Continuum模式。

1.4.2 定量分析

建立兒茶素、表兒茶素、槲皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、山柰酚和山柰酚-3-O-葡萄糖苷等7種類黃酮標準曲線進行定量計算(表1)。對無標準品或無標準曲線的類黃酮成分，參考張維冰等[12]方法，以崇左金花茶中含量較高的類黃酮成分槲皮素-3-O-葡萄糖苷標準品為基準進行相對定量，其公式為：

Ci,j=(Ai,j/Ai)·(Mi,j/Mi)·Ci

(1)

式中：i表示標準品；j表示利用標準品i定量的其他成分；C表示含量；A表示色譜峰面積；M表示化合物的平均分子量。

試驗重復5次，計算各成分含量。

表1 7種類黃酮標準曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 崇左金花茶花朵和葉片類黃酮鑒定

利用UPLC-Q-TOF-MS對崇左金花茶花朵和葉片中類黃酮成分進行定性分析，根據(jù)UPLC-Q-TOF-MS和MS圖譜，參考相關(guān)文獻，對其主要成分進行結(jié)構(gòu)鑒定，共檢測到14種類黃酮成分(圖2)，其質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表2。14種類黃酮成分中，除成分C3、C4和C12外，其余11種成分均有標準品作為對照。比對標準品，C1和C2分別為兒茶素和表兒茶素。無標準品對照的C3質(zhì)譜數(shù)據(jù)為分子離子m/z 595.17，特征碎片離子m/z 287.06，與張維冰等[12]鑒定木犀草素-7-O-蕓香糖苷結(jié)果相同，推定其為木犀草素7-O-蕓香糖苷；C7質(zhì)譜數(shù)據(jù)為分子離子m/z 287.06，特征碎片離子m/z 153.02，根據(jù)標準品對照判斷其為木犀草素。

表2 崇左金花茶類黃酮質(zhì)譜數(shù)據(jù)

Table 2 UPLC-Q-TOF-MS data of flavonoids ofC.chuangtsoensis

成分No. components保留時間Retention time(min)分子離子(m/z)Molecular ions碎片離子(m/z)Fragment ions類黃酮鑒定Flavonoids identificationC13.56291.09247.06兒茶素?CatechinC24.51291.09163.03表兒茶素?EpicatechinC34.72595.17287.06木犀草素-7-O-蕓香糖苷Luteolin-7-O-rutinosideC45.13627.16303.05槲皮素-3,7-O-二葡萄糖苷Quercetin-3,7-O-diglucosideC55.77611.16303.05槲皮素-3-O-蕓香糖苷?Quercetin-3-O-rutinosideC65.93465.11303.05槲皮素-3-O-葡萄糖苷?Quercetin-3-O-glucosideC76.07287.06153.02木犀草素?LuteolinC86.40289.08153.02圣草素?EriodictyolC96.54449.11287.06山柰酚-3-O-葡萄糖苷?Kempferol-3-O-glucosideC106.63581.19427.10蕓香柚皮苷?NarirutinC116.77465.10303.05槲皮素-7-O-葡萄糖苷?Quercetin-7-O-glucosideC126.80433.11271.06染料木苷GenistinC137.08303.05289.07槲皮素?QuercetinC149.39287.06153.02山柰酚?Kaempferol

注：*為有標準品對照的成分。

Note:*represent the standard control compounds.

圖2 崇左金花茶類黃酮成分HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of flavonoid components of C.chuangtsoensis

圖3 崇左金花茶花朵和葉片類黃酮成分含量(μg·g-1)C1.兒茶素;C2.表兒茶素;C3.木犀草素-7-O-蕓香糖苷;C4.槲皮素-3,7-O-二葡萄糖苷;C5.槲皮素-3-O-蕓香糖苷;C6.槲皮素-3-O-葡萄糖苷;C7.木犀草素;C8.圣草素;C9.山柰酚-3-O-葡萄糖苷;C10.蕓香柚皮苷;C11.槲皮素-7-O-葡萄糖苷;C12.染料木苷;C13.槲皮素;C14.山柰酚Fig.3 Contents offlavonoidcomponents in flowers and leaves of C.chuangtsoensis C1.Catechin; C2.Epicatechin; C3.Luteolin-7-O-rutinoside; C4.Quercetin-3,7-O-diglucoside; C5.Quercetin-3-O-rutinoside; C6.Quercetin-3-O-glucoside; C7.Luteolin; C8.Eriodictyol; C9.Kempferol-3-O-glucoside; C10.Narirutin; C11.Quercetin-7-O-glucoside; C12.Genistin; C13.Quercetin; C14.Kaempferol

無標準品對照的C4質(zhì)譜數(shù)據(jù)為分子離子m/z 627.16，特征碎片離子m/z 303.05，與Ceska和Styles[15]鑒定槲皮素-3,7-O-二葡萄糖苷結(jié)果相同，推定其為槲皮素-3,7-O-二葡萄糖苷；具有標準品對照的C5、C6、C11和C13分別為槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷和槲皮素。具標準品對照的C9和C14為山萘酚-3-O-葡萄糖苷和山柰酚，C8和C10為圣草素和蕓香柚皮苷；無標準品的C12質(zhì)譜數(shù)據(jù)為分子離子m/z 433.11，特征碎片離子為m/z 271.06，與李蓓佳等[16]鑒定染料木苷結(jié)果相同，推定其為染料木苷。

2.2 崇左金花茶花朵和葉片類黃酮成分含量

崇左金花茶花朵和葉片中類黃酮成分含量見圖3，崇左金花茶雄蕊中兒茶素、表兒茶素含量均遠高于花瓣、葉片，花瓣中兒茶素含量遠高于葉片。雄蕊中木犀草素、木犀草素-7-O-蕓香糖苷含量均遠高于花瓣、葉片，花瓣中木犀草素含量遠高于葉片而木犀草素-7-O-蕓香糖苷含量高于老葉但低于新葉?；ò旰托廴镏虚纹に?3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3,7-O-二葡萄糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖苷等5種類黃酮含量均遠高于老葉和新葉，且花瓣中相應含量均高于雄蕊，分別是雄蕊的1.74、1.35、3.09、4.21和1.74倍。蕓香柚皮苷、圣草素和燃料木苷主要存在于花朵中，且蕓香柚皮苷和圣草素在雄蕊中含量遠高于花瓣，燃料木苷在花瓣中含量遠高于雄蕊。

崇左金花茶花朵和葉片中類黃酮成分比例見表3，花瓣中類黃酮成分含量較高的依次為槲皮素-3-O-葡萄糖苷、表兒茶素和木犀草素，分別占其類黃酮總量的26.06%、23.91%和11.25%，合計61.23%；其次為槲皮素-7-O-葡萄糖苷，占9.00%。雄蕊中類黃酮含量較高的依次為表兒茶素、木犀草素和槲皮素-3-O-葡萄糖苷，分別占其類黃酮總量的37.28%、17.73%和11.44%，合計66.45%；其次為兒茶素，占10.25%。老葉中含量較高的為表兒茶素、木犀草素和木犀草素-7-O-蕓香糖苷，分別占其類黃酮總量的76.25%、11.37%和6.19%，合計93.81%；其次為槲皮素-3-O-葡萄糖苷，占2.21%。新葉中含量較高的為表兒茶素、木犀草素-7-O-蕓香糖苷和木犀草素，分別占64.85%、12.34%和10.35%，合計87.54%；其次為槲皮素-3-O-葡萄糖苷，占4.68%?？梢姡缱蠼鸹ú杌ǘ渲泻枯^高的類黃酮成分主要是表兒茶素、木犀草素和槲皮素-3-O-葡萄糖苷，葉片中主要是表兒茶素、木犀草素和木犀草素-7-O-蕓香糖苷。

2.3 崇左金花茶花朵和葉片類黃酮分類

崇左金花茶中類黃酮成分主要為兒茶素類、木犀草素類、槲皮素類、山萘酚類和其他類型(表4)。花瓣中含量較高的依次為槲皮素類、兒茶素類和木犀草素類，分別占其類黃酮總量的47.25%、30.91%和14.29%，合計92.45%。雄蕊中含量較高的依次為兒茶素類、木犀草素類和槲皮素類，分別占類黃酮總量的47.53%、26.15%和18.33%，合計92.01%。老葉和新葉中兒茶素類含量均最高，分別占其類黃酮總量的77.81%和68.05%；其次為木犀草素類，分別占其類黃酮總量的17.56%和22.69%；兒茶素類和木犀草素類合計占老葉和新葉類黃酮總量的95.37%和90.74%?？梢?，崇左金花茶花朵中類黃酮成分類型主要為兒茶素類、木犀草素類和槲皮素類，葉片中主要為兒茶素類和木犀草素類。

表3 崇左金花茶花朵和葉片類黃酮成分比例(%)

Table 3 Proportions off lavonoid components in flowers and leaves ofC.chuangtsoensis

類黃酮Flavonoids花瓣P(guān)etals雄蕊Stamens老葉Old leaves新葉New leaves兒茶素Catechin7.0010.251.563.20表兒茶素Epicatechin23.9137.2876.2564.85木犀草素Luteolin11.2517.7311.3710.35木犀草素-7-O-蕓香糖苷Luteolin-7-O-rutinosid3.048.426.1912.34槲皮素Quercetin0.010.000.670.73槲皮素-3-O-葡萄糖苷Quercetin-3-O-glucoside26.0611.442.214.68槲皮素-3-O-蕓香糖苷Quercetin-3-O-rutinoside6.363.611.272.91槲皮素-7-O-葡萄糖苷Quercetin-7-O-glucoside9.002.220.030.12槲皮素-3,7-O-二葡萄糖苷Quercetin-3,7-O-diglucoside5.811.06——山柰酚Kempferol0.110.080.020.14山柰酚-3-O-葡萄糖苷Kempferol-3-O-glucoside2.591.140.080.39蕓香柚皮苷Narirutin1.231.900.010.00圣草素Eriodictyol2.994.690.020.08染料木苷Genistin0.640.180.300.21

注：“—”表示未鑒定出。

Note:“—” not identified.

表4 崇左金花茶花朵和葉片類黃酮分類(μg·g-1)

崇左金花茶花瓣和雄蕊中類黃酮總量分別為555.77和727.59 μg·g-1，兩者遠高于老葉的209.01 μg·g-1和新葉的227.85 μg·g-1；花瓣中類黃酮總量分別為老葉和新葉的2.66和2.44倍，雄蕊中類黃酮總量分別為老葉和新葉的3.48和3.19倍。兒茶素類在雄蕊中含量最高，分別為花瓣、老葉和新葉的2.01、2.13和2.23倍。木犀草素類在雄蕊中含量最高，分別為花瓣、老葉和新葉的的2.40、5.19和3.68倍；花瓣中木犀草素類含量為老葉的2.16和1.54倍。槲皮素類在花瓣中含量最高，分別為雄蕊、老葉和新葉的1.97、29.98和13.66倍；雄蕊中槲皮素類含量分別為老葉的15.22和6.94倍?；ò?、雄蕊中山萘酚類和其他成分含量遠高于葉片，且花瓣中山萘酚類含量高于雄蕊?？梢姡缱蠼鸹ú杌ò旰托廴镏袃翰杷仡?、木犀草素類及類黃酮總量均高于葉片，且雄蕊高于花瓣；花瓣和雄蕊中槲皮素類遠高于葉片，且花瓣中遠高于雄蕊。

3 討論

本試驗利用超高效液相色譜—四極桿—飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對崇左金花茶花朵和葉片進行定性定量分析，共檢測到14種類黃酮成分，其中兒茶素類2種、槲皮素類5種、山萘酚類2種、木犀草素類2種、蕓香柚皮苷等其他成分3種。在對類黃酮成分定量分析時，張維冰等[12]利用超高效液相色譜-二級管陣列檢測-串聯(lián)質(zhì)譜法對菊花(Dendranthemamorifolium)中多酚類物質(zhì)的研究表明，由于缺乏所有化合物的標準品，在定量分析中可選取幾種在菊花中含量較高的組分為標準進行定量分析，而其他多酚類物質(zhì)以其為基準進行相對定量。本試驗在定量分析時利用已有標準樣品建立了7種標準曲線，對無標準品或無標準曲線的類黃酮成分，參考張維冰等[12]方法，以崇左金花茶中含量較高的類黃酮成分槲皮素-3-O-葡萄糖苷標準品為基準，利用公式Ci,j=(Ai,j/Ai)·(Mi,j/Mi)·Ci進行相對定量，試驗重復5次，計算各成分含量。結(jié)果表明，各成分含量均在標準曲線的線性范圍內(nèi)，R2達0.999以上，說明本試驗建立的類黃酮成分定量分析方法能有效定量各成分含量。

本試驗檢測到的14種類黃酮成分中木犀草素、木犀草素-7-O-蕓香糖苷、槲皮素-3,7-O-二葡萄糖苷、蕓香柚皮苷、圣草素和染料木苷等6種類黃酮成分均為金花茶組植物中首次發(fā)現(xiàn)，且木犀草素、木犀草素-7-O-蕓香糖苷在花朵和葉片中含量均較高，而槲皮素-3,7-O-二葡萄糖苷、蕓香柚皮苷、圣草素和染料木苷等主要存在于花朵中。崇左金花茶中槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖苷是金花茶花瓣中主要類黃酮成分[7,17]，但其在崇左金花茶葉片中的發(fā)現(xiàn)為首次報道[3]。崇左金花茶花朵和葉片中兒茶素類成分僅檢測到兒茶素和表兒茶素，且以表兒茶素為主。

本試驗中崇左金花茶花朵類黃酮含量遠高于葉片，花瓣中含量較高的依次為槲皮素類、兒茶素類和木犀草素類，雄蕊中含量較高的依次為兒茶素類、木犀草素類和槲皮素類，老葉和新葉中兒茶素類含量分別占類黃酮總量的77.81%和68.05%，而槲皮素類、木犀草素類等含量相對較低，這可能主要與類黃酮的合成途徑相關(guān)，槲皮素類、木犀草素類前體通過還原酶合成兒茶素，導致葉片中槲皮素類、木犀草素類含量降低具體原因有待于進一步研究。新葉中木犀草素類、槲皮素類和山萘酚類含量明顯高于老葉，可能主要由于新葉為生長活躍區(qū)域，次生代謝旺盛，導致類黃酮等次生代謝產(chǎn)物增加，具體原因有待于進一步研究。

已有研究認為，矢車菊素類花青苷是紅色山茶花瓣中主要的花青苷成分[18～20]，而槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-蕓香糖苷等類黃酮是金花茶類花朵呈現(xiàn)黃色的主要原因[21～22]。本試驗崇左金花茶花瓣中兒茶素類含量約為雄蕊一半但和葉片相差不大，且兒茶素類占花瓣類黃酮30.91%；而花瓣中槲皮素類含量約為雄蕊兩倍但遠大于葉片，且槲皮素類占花瓣類黃酮47.25%，尤其槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-蕓香糖苷等含量較高，說明槲皮素類為崇左金花茶花瓣呈現(xiàn)黃色的主要原因，這與前人對金花茶研究結(jié)果一致[21～22]。

研究表明，植物中類黃酮成分具有生物活性，可用于消炎、殺菌、增強心腦血管和抗腫瘤等方面[3,23～24]。崇左金花茶花期長、花量多，原料豐富，花朵和葉片中含有槲皮素類、兒茶素類等類黃酮成分，研究認為相關(guān)類黃酮成分具有抑制腫瘤、降“三高”、抗氧化、增強心血管和人體免疫力等生理功效[3,25～26]，因此，崇左金花茶中類黃酮具有廣泛應用前景，是開發(fā)金花茶類黃酮的良好材料，可用于醫(yī)藥、保健及食品等。本試驗利用超高效液相色譜—四極桿—飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對崇左金花茶中主要類黃酮成分進行了研究，明確了崇左金花茶花朵和葉片中類黃酮成分、含量及其變化特征，為進一步開發(fā)利用提供了科學依據(jù)。

崇左金花茶花朵中含量較高的類黃酮為兒茶素類、木犀草素類和槲皮素類，主要是表兒茶素、木犀草素和槲皮素-3-O-葡萄糖苷；葉片中為兒茶素類和木犀草素類，主要是表兒茶素、木犀草素和木犀草素-7-O-蕓香糖苷。崇左金花茶花瓣和雄蕊中兒茶素類、木犀草素類及類黃酮總量高于葉片，且雄蕊高于花瓣；花瓣和雄蕊中槲皮素類遠高于葉片，且花瓣中遠高于雄蕊。槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-蕓香糖苷等為崇左金花茶花瓣呈現(xiàn)黃色的主要原因。