鄧 莉，周 劍，胡 婧，胡 斌，馬 攀

（陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400038）

茵丹顆粒為我院自制制劑，具有清熱利濕、涼血活血等功效，主治痤瘡、脂溢性皮炎，療效確切，其中連翹、黃芩、地榆、茵陳等中藥材具有抗病原微生物作用[1-6]。中成藥的不同成分和濃度對(duì)微生物有著不同程度的抑制和殺滅作用[7-10]。由于抑菌成分的干擾，采用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查，其結(jié)果不能真實(shí)反映其污染微生物的狀況[11]，因此采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄅ懦湟志煞值母蓴_，提高中成藥污染微生物的檢出率至關(guān)重要[12]。為保證微生物限度檢查法結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究中依據(jù)2015年版《中國(guó)藥典（四部）》1105非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查[13]中微生物計(jì)數(shù)法、1106非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查，控制菌檢查法中方法驗(yàn)證試驗(yàn)，以及和通則1107非無(wú)菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的要求，建立了茵丹顆粒微生物限度檢查方法，并進(jìn)行驗(yàn)證，確保檢測(cè)方法的可行性。

1 儀器與材料

1．1 儀器

Thermo Scientific-1381 A2型生物安全柜（美國(guó)Thermo公司）；BL150型電子天平（梅特勒托利多儀器＜上海＞有限公司）；LRH-150F型生化培養(yǎng)箱（重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器公司）；MJ-180-Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1．2 材料

試藥：茵丹顆粒（陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，批號(hào)為18032701，規(guī)格為每袋10 g）。

培養(yǎng)基：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)為161205），胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為1612192），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)為170815），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為1702134），麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)為161205），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為161212），均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司提供。

稀釋劑、沖洗劑：pH 7．0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，批號(hào)為170519）；0．9%氯化鈉溶液（西南藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為17034002）。

菌種：金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]，白 色 念 珠 菌[CMCC（F）98001]，黑 曲 霉 菌[CMCC（F）98003]，大腸埃希菌[CMCC（B）44102]，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，試驗(yàn)所用菌株均為第3代。

2 方法與結(jié)果

2．1 菌液制備

取經(jīng)胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌液體培養(yǎng)物，分別用0．9%氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度的菌懸液，作活菌計(jì)數(shù)備用。

取經(jīng)沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物，用0．9%氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度的菌懸液，作活菌計(jì)數(shù)備用。

取經(jīng)沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉菌斜面培養(yǎng)物，加入含0．05%（V／V）聚山梨酯80的0．9%氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液（用管口帶有薄無(wú)菌棉花或紗布能過(guò)濾菌絲的無(wú)菌毛細(xì)吸管）置無(wú)菌試管內(nèi)，用0．9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2．2 微生物限度檢查方法驗(yàn)證

2．2．1 供試液制備

取樣品10 g，加pH 7．0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，搖勻，制成1∶10的供試液。取供試液10 mL，加pH 7．0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，搖勻，制成1∶100供試液。

2．2．2 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

試驗(yàn)組[14]：分別精密吸取2．3．1項(xiàng)下1∶10供試液和1∶100供試液9．9 mL，各5份，每份中分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌及黑曲霉菌菌懸液各0．1 mL，使每1 mL含菌數(shù)不大于100 cfu，混勻，吸取各染菌供試液1 mL注入平皿中，每份平行制備2個(gè)平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，置35℃培養(yǎng)3 d，測(cè)定需氧菌總數(shù)。取2．3．1項(xiàng)下1∶10供試液9．9 mL，共2份，每份中分別加入白色念珠菌和黑曲霉菌菌懸液各0．1 mL，使每1 mL含菌數(shù)不大于100 cfu，混勻，吸取各染菌供試液1 mL注入平皿中，每份平行制備2個(gè)平皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置25℃培養(yǎng)5 d，測(cè)定霉菌及酵母菌總數(shù)。

菌液對(duì)照組：吸取pH 7．0氯化鈉-蛋白胨緩沖液9．9 mL，共5份，每份中分別加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌懸液各0．1 mL，使每1 mL含菌數(shù)不大于100 cfu，混勻，分別從試驗(yàn)菌試管中吸取1 mL注入平皿中，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另取pH 7．0氯化鈉-蛋白胨緩沖液9．9 mL，共2份，每份中分別加入白色念珠菌、黑曲霉菌菌懸液各0．1 mL，使每1 mL含菌數(shù)不大于100 cfu，混勻，分別從試驗(yàn)菌試管中吸取1 mL注入平皿中，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

供試品對(duì)照組：分別精密吸取1∶10和1∶100供試液各1 mL注入平皿，分別平行制備4個(gè)平皿，其中4個(gè)平皿傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，作為需氧菌總數(shù)的供試品對(duì)照組；另外4個(gè)平皿傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，作為霉菌和酵母菌總數(shù)的供試品對(duì)照組。

稀釋劑組：取相應(yīng)量稀釋液替代供試品，同試驗(yàn)組方法操作，按試驗(yàn)組方法測(cè)定其菌數(shù)，平行制備2個(gè)平皿。

驗(yàn)證結(jié)果：依照下列公式，計(jì)算加菌回收率，試驗(yàn)組菌比值=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)）／菌液對(duì)照組的平均菌落數(shù)。按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》1105，1106，1107項(xiàng)下[2]規(guī)定進(jìn)行結(jié)果判斷，回收率比值應(yīng)在0．5～2．0。結(jié)果見(jiàn)表1至表2。可見(jiàn)，需氧菌總數(shù)采用稀釋法（1∶100）、霉菌和酵母菌總數(shù)采用常規(guī)法，各株菌回收率均為0．5～2．0，符合2015年版《中國(guó)藥典（四部）》微生物限度檢查微生物計(jì)數(shù)檢查驗(yàn)證要求。

2．2．3 控制菌-大腸埃希菌檢查

試驗(yàn)組：取10 mL 2．3．1項(xiàng)下1∶10供試液及每1 mL含菌量不大于100 cfu大腸埃希菌菌懸液，同時(shí)加入100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，35℃培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)24 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種至麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，35℃培養(yǎng)24 h，觀察。

表1 1∶10及1∶100供試液需氧菌總數(shù)回收率比值試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

表2 1∶10供試液霉菌和酵母菌回收率比值試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

菌液對(duì)照組：不加供試液，其余操作同試驗(yàn)組。

供試品對(duì)照組：取2．3．1項(xiàng)下1∶10供試液10 mL，以稀釋液代替菌液其余操作同試驗(yàn)組。

稀釋劑組：以稀釋液代替供試液，不加菌液，其余操作同試驗(yàn)組。觀察其菌落形態(tài)。試驗(yàn)組和菌液對(duì)照組大腸埃希菌24 h試驗(yàn)菌生長(zhǎng)良好，供試品對(duì)照組24 h無(wú)菌生長(zhǎng)，陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)?？梢?jiàn)，采用常規(guī)法控制菌能正常檢出，陰性對(duì)照未檢出。符合2015年版《中國(guó)藥典（四部）》微生物限度檢查控制菌檢查驗(yàn)證要求，故常規(guī)法可用于茵丹顆粒的控制菌檢查。

3 討論

茵丹顆粒在檢查需氧菌總數(shù)時(shí)，由于組分中黃芩、連翹、地榆、茵陳對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用[1]。由本研究結(jié)果可見(jiàn)，1∶10供試液需氧菌總數(shù)測(cè)定金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌回收率比值均未達(dá)到試驗(yàn)要求，與文獻(xiàn)[1]報(bào)道一致。通過(guò)稀釋法能有效清除抑菌成分，達(dá)到檢驗(yàn)?zāi)康模ＷC檢查方法的完整性和可靠性。同時(shí)，這4味中藥對(duì)大腸埃希菌均有抑制作用，但茵丹顆粒采用常規(guī)法能達(dá)到試驗(yàn)要求，考慮茵丹顆粒為水提法，在制備過(guò)程中，抑制大腸桿菌的成分濃度未達(dá)到有效MIC。其中連翹對(duì)大腸埃希菌作用較弱，乙醇提取物作用強(qiáng)于水提取物[15]。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，茵丹顆粒的微生物限度檢查方法需氧菌總數(shù)檢查可采用稀釋法（1∶100），霉菌和酵母菌總數(shù)檢查可采用常規(guī)法，控制菌檢查采用常規(guī)法，試驗(yàn)菌回收率及控制菌檢查結(jié)果均符合規(guī)定。