劉劍敏，唐靜宜，程 路，陳 凡

（湖北省武漢市第一醫(yī)院藥學部，湖北 武漢 430022）

天然活性成分川芎嗪（TMP）為常用腦血管疾病治療藥物[1-2]。目前，臨床常用川芎嗪普通制劑有片劑、膠囊劑和注射劑[3-4]。其口服制劑半衰期短（0．5～2 h）、生物利用度低（10%～30%）[5]，靜脈注射4～6 h可達血藥濃度要求，但給藥用藥不方便。與靜脈給藥相比，經鼻給藥能迅速將藥物經嗅球直接轉運至大腦和脊髓，達到相同的生物利用度[6]。ILLUM[7]報道，鼻噴霧劑給藥能有效提高TMP在腦內的轉運，這種非侵入性的高效方式對腦缺血損傷的療效顯著。脂質體作為經鼻給藥的載體具有天然優(yōu)勢，首先具有較強的生物黏附性，藥物可緩慢釋放，具有腦部靶向性[8-9]，另外還具有生物利用度高、刺激性小、不良反應少等優(yōu)點[10]。冰片常作為川芎的藥對組合用于治療心腦血管疾病，配伍冰片對腦缺血損傷的保護明顯優(yōu)于單用[11-12]，具有明顯的腦靶向優(yōu)勢，也為缺血性腦損傷防治提供了可能。本研究中探討了磷酸川芎嗪（TMPP）與冰片（B）配伍脂質體的制備方法，為該劑型藥物抗腦缺血損傷的應用提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀（島津貿易＜上海＞有限公司）；RE-5299型旋轉蒸發(fā)儀（上海振榮科學儀器有限公司）；XSP-1C型粒徑測定儀（上海精密儀器廠）；W201D型數控恒溫水浴鍋（上海申順科技有限公司）；葡聚糖凝膠-G50（北京化學試劑公司）。

1．2 試藥

磷酸川芎嗪對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為100845-201702，純度為99．2%）；冰片（四川青神康華制藥有限公司，批號為170314）；Triton-X100（進口分裝，中國碧云天公司，批號為ST795）；磷酸川芎嗪原料（北京燕京制藥廠，批號為20170123，純度＞99%）；大豆磷脂（山海太偉藥業(yè)有限公司，批號為20170307），膽固醇（北京化學試劑公司，批號為20170402）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 TMPP-B脂質體的制備

取一定比例的大豆磷脂和膽固醇，置圓底燒瓶，精密稱定，加入十八胺，以乙醇溶解，水浴減壓蒸發(fā)除去溶劑，得分布均勻的薄膜，加入一定濃度的硫酸銨溶液水化，超聲得空白脂質體混懸液[13]。將空白脂質體經葡聚糖凝膠G-50微型柱（10 cm×1 cm）以pH=7．4磷酸鹽緩沖液（PBS）進行洗脫，收集洗脫后的空白脂質體，加入固定比例的TMPP-B藥液，于水浴中孵化，即得TMPP-B脂質體。

2．2 包封率測定

2．2．1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zobox C18柱（150 mm×4．6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水（50∶50，V／V）；檢測波長：295 nm；流速：1 mL／min；柱溫：25℃；進樣量：20μL。磷酸川芎嗪保留時間為7．5 min，色譜圖見圖1，空白脂質體在此保留時間未出峰。

2．2．2 溶液制備

對照品溶液：稱取TMPP適量，精密稱定，加入甲醇-水（50∶50）溶解，制備成質量濃度為100 mg／L的貯備液，備用。

供試品溶液：取TMPP-B脂質體適量，置離心管中，以15 000 r／min的轉速離心30 min。分別取離心后的上清液和未離心脂質體溶液各適量，后者加Triton-X100溶解，即得。

2．2．3 方法學考察

圖1 高效液相色譜圖

標準曲線制備：用50%甲醇將對照品貯備液稀釋成5．0，10．0，25．0，50．0，100．0 mg／L的系列標準溶液，按擬訂色譜條件分別進樣20μL。以峰面積（A）對質量濃度（C，mg／L）進行線性回歸，得回歸方程A=0．562 1C-0．481 8，r=0．999 3（n=5）。結 果 表 明，TMPP質量濃度在5．0～100．0 mg／L范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取質量濃度為20．0 mg／L TMPP對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣6次，計算TMPP含量。結果的RSD為0．34%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：配制TMPP對照品溶液6份，分別按擬訂色譜條件進行檢測，計算6份溶液中TMPP峰面積與稱樣質量的比值。結果的RSD為0．58%（n=6），表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：分別精密吸取TMPP-B脂質體0．5mL，以Triton-X100溶解并定容至50 mL，得供試品溶液。分別于0，1，2，3，5，8 h時依法進樣測定。結果的RSD為1．26%（n=6），表明供試品溶液在8 h內穩(wěn)定。

加樣回收試驗：取20．0 mg／L對照品溶液1，2，3 mL，加入空白脂質體，以Triton-X100溶解并定容至20 mL，按擬訂色譜條件進樣測定。結果TMPP的平均回收率為101．38%，RSD為1．09%（n=3）。

2．2．4 樣品含量測定

取2．2．2項下供試品溶液和對照品溶液適量，按2．2．1項下條件測定TMPP含量，得到WT和WF，計算包封率（E，%）=（WT-WF）／WT×100%。

2．3 制備工藝優(yōu)化

根據前期單因素考察預試驗結果，以磷脂-膽固醇質量比（因素A）、TMPP-（磷脂＋膽固醇）質量比（因素B）、水化時間（因素C）及（NH4）2SO4濃度（因素D）為考察因素，進行正交設計。采用乙醇注入式（NH4）2SO4梯度法制備TMPP-B脂質體，以包封率為考察指標，分別對試驗結果進行直觀分析和方差分析。結果見表1和表2。

由表1可知，這4項因素對TMPP-B包封率的影響程度為A＞D＞B＞C，且最佳工藝條件為A1B2C1D2，即磷脂-膽固醇（2∶1），（磷脂＋膽固醇）-TMPP（15∶1），水化時間為30 min，（NH4）2SO4質量濃度為0．2μmol／L。由表2可知，因素A，B，D影響顯著。以最優(yōu)工藝制備3批TMPP-B脂質體，計算得包封率為（73．14±0．71）%，該工藝穩(wěn)定可行。

表1 TMPP-B脂質體制備L9（34）正交設計及直觀分析

表2 方差分析結果

2．4 其他評價指標

TMPP-B脂質體粒徑，以XSP-1C型粒徑測定儀進行粒徑分布測定，粒徑分布在113～145 nm范圍內，平均粒徑為（136．10±6．30）nm，分布均勻；Zeta電位為（-35．70±3．60）mV。取最優(yōu)工藝制備3批TMPP-B脂質體，置4℃冰箱，放置4周，未見分層、變色、沉淀和破乳等改變，表明該工藝質量穩(wěn)定。

3 討論

3．1 脂質體制備方法

常規(guī)的制備方法有被動載藥法中的薄膜分散、注入法等，主動載藥法中的pH梯度法、（NH4）2SO4梯度法等[9]。新型制備方法較多，如超臨界反相蒸發(fā)法、冷凍干燥法、溫度敏感脂質體、配體靶向修飾脂質體等[9]。常規(guī)制備方法雖存在脂質體包封率較低、粒徑不均一、有機溶劑殘留等缺點，但由于對所需設備要求低、生產周期較短、具體方法簡單易行、所得產品性質穩(wěn)定性良好等眾多優(yōu)勢而應用廣泛。

TMPP水溶性良好，故選用改進的乙醇注入式（NH4）2SO4梯度法，制備條件溫和，避免了高溫對磷脂的氧化，且有機溶劑殘留少，所得TMPP-B脂質體包封率達（73．14±0．71）%，且載藥量適宜，穩(wěn)定性良好。在包封率測定方法的選擇上，預試驗中對比分析了凝膠過濾法和離心法2種測定方法，結果發(fā)現以15 000 r／min離心30 min分離游離TMPP和脂質體，所得結果與凝膠過濾法無明顯差異，故本研究中選擇操作更方便快速的離心法進行。

3．2 物料比例

TMPP-B脂質體制備時，預試驗考察了影響最終產品質量的諸多因素，發(fā)現磷脂-膽固醇質量比、TMPP-（磷脂＋膽固醇）質量比、（NH4）2SO4濃度及水化時間為主要影響因素。磷脂與膽固醇合適比例對穩(wěn)定脂質體結構和提高包封率起至關重要的作用，磷脂濃度增加，藥物包封率隨之提高。但磷脂用量過大會造成水化不完全，且易凝聚，不利于產品穩(wěn)定性。膽固醇比例過大會使脂質體易破裂，造成藥物的滲漏；而過少又會增加脂質體的膜流動性。磷脂與膽固醇的比例控制在2～7比較好[14]。

3．3 研究價值

正交設計、直觀分析和方差分析結果顯示，以包封率為考察指標，考察四因素不同水平對TMPP包封率的影響，結果表明，該制備工藝的脂質體包封率高，分布均勻，形態(tài)好，質量穩(wěn)定，該方法簡單、合理。

冰片可促進川芎嗪在腦部的分布[11-12]，兩者聯用治療腦血管疾病更快速。隨著新劑型的開發(fā)，藥物生物利用度的提高，穿透血腦屏障實現腦靶向成為可能，為后期的腦缺血損失治療研究提供參考。