龍勝基， 吳 義， 張 楠， 李偉航， 胡承興

(1.貴州省黔西南州環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)站，貴州 興義 562400； 2.貴州省黔西南州環(huán)境工程評(píng)估中心，貴州 興義 562400； 3.天津?；h(huán)境工程有限公司，天津 300000)

噻霉酮是一種新型、高效、低毒且廣譜型的殺菌劑[1]。在國(guó)內(nèi)，噻霉酮產(chǎn)品主要用于防治煙草野火病、黃瓜霜霉病等；歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家主要用于工業(yè)殺菌、防腐及防霉等[2-4]。目前，有關(guān)噻霉酮?dú)埩舴治鰴z測(cè)和消解動(dòng)態(tài)的研究以及與噻霉酮結(jié)構(gòu)類似化合物的分析方法文獻(xiàn)報(bào)道較少。于福利等[5]報(bào)道了噻霉酮在黃瓜和土壤中的殘留分析方法。張?chǎng)6]采用高效液相色譜法測(cè)定噻霉酮含量。鄭靜等[7]運(yùn)用紫外分光光度法測(cè)定殺菌劑1,2-苯并異噻唑啉-3-酮(BIT) 的含量。 趙明仁等[8]建立了非水滴定法測(cè)定苯并異噻唑啉酮的含量。楊榮靜等[9]建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS) 法快速測(cè)定玩具中與噻霉酮結(jié)構(gòu)類似化合物異噻唑啉酮類防腐劑(2-甲基4-異噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和1,2-苯并異噻唑啉-3-酮)。龍家寰等[10]建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用快速檢測(cè)楊梅中噻嗪酮?dú)埩袅康姆椒?。段婷婷等[11]建立黃瓜、番茄和土壤中噻唑磷的殘留量檢測(cè)方法。此外，與其結(jié)構(gòu)類似的農(nóng)藥品種如克百威和多菌靈等的分析主要采用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等[12-17]。噻霉酮在煙草上施用的安全性、消解趨勢(shì)及殘留水平等方面的研究未見報(bào)道。鑒于此，分別在湖南和貴州采用田間試驗(yàn)研究噻霉酮在煙草中的消解動(dòng)態(tài)，探索其消解半衰期，以期為噻霉酮在煙草上的推廣使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 煙草采自湖南長(zhǎng)沙湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)研究基地和貴州惠水?dāng)[金鎮(zhèn)煙區(qū)，煙草品種分別為K326和葉子煙。

1.1.2 儀器Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)Waters公司；ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50 mm，1.7 μm)色譜柱，美國(guó)Waters公司；BUCHI R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司；QL-901型渦旋混合器，江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；DC-12型氮吹儀，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；ALC-210.4型電子天平，德國(guó)Sartorius公司；HY-4型調(diào)速多用震蕩器，上海浦東物理光學(xué)儀器廠。

1.1.3 試劑99.8%噻霉酮標(biāo)準(zhǔn)品，Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司；3%噻霉酮水分散粒劑，陜西西大華特科技實(shí)業(yè)有限公司研發(fā)生產(chǎn)；Celite545硅鎂吸附劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；C18，天津博納艾杰爾科技有限公司；乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂及無(wú)水硫酸鈉，均為分析純。無(wú)水硫酸鎂和無(wú)水硫酸鈉用前640℃烘烤4 h，于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制用電子天平稱取0.01 g(精確至0.000 1 g)噻霉酮標(biāo)準(zhǔn)品置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至50 mL，配制成濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品母液。將噻霉酮標(biāo)準(zhǔn)樣品母液用甲醇稀釋配制成濃度分別為0.1 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、8.0 μg/mL及10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 材料預(yù)處理

1) 消解動(dòng)態(tài)。在煙草旺長(zhǎng)期后施藥1次，施藥劑量為60 g a.i/hm2，3次重復(fù)，每個(gè)小區(qū)30 m2，處理間設(shè)保護(hù)帶，另設(shè)空白對(duì)照區(qū)，注意保證煙葉均勻著藥。分別在施藥后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d、42 d和60 d時(shí)在各小區(qū)隨機(jī)采樣。每小區(qū)每次采集生長(zhǎng)正常、無(wú)病害的煙草鮮葉80～100片左右，去除葉面附著的雜物后，切成1 cm2左右的碎葉，充分混合均勻，用四分法縮分，取150 g樣品各2份分別裝入樣品容器中，包扎妥當(dāng)、貼好標(biāo)簽，置于-20℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

2) 最終殘留。田間試驗(yàn)施藥劑量設(shè)40 g a.i/hm2和60 g a.i/hm2，以空白作對(duì)照，于收獲期分別施藥3次和4次，每次施藥間隔期為7 d，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)小區(qū)，共6個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積30 m2。于施藥后7 d、14 d及21 d分別在小區(qū)內(nèi)隨機(jī)采集煙草樣品。每小區(qū)每次采集生長(zhǎng)正常、無(wú)病害的煙草鮮葉180～240片左右，按不同處理分別編竿、掛簽和烘烤。將烤后的成品煙葉磨碎，充分混勻并用四分法縮分，取150 g樣品各2份分別裝入容器中，包扎妥當(dāng)、貼好標(biāo)簽，置于-20℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

3) 添加標(biāo)準(zhǔn)樣品回收試驗(yàn)。預(yù)備試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鮮煙葉基質(zhì)添加濃度低于0.09 mg/kg時(shí)未檢出噻霉酮，煙粉基質(zhì)添加濃度低于0.4 mg/kg時(shí)未檢出噻霉酮，因此，添加回收試驗(yàn)鮮煙葉基質(zhì)選取添加回收濃度分別為0.1 mg/kg、0.4 mg/kg和1.0 mg/kg，煙粉基質(zhì)選取添加回收濃度分別為0.5 mg/kg、2.0 mg/kg和5.0 mg/kg。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算鮮煙葉和煙粉基質(zhì)中添加回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍。同一濃度的回收試驗(yàn)3次重復(fù)，平行試驗(yàn)結(jié)果偏差與添加濃度相關(guān)，添加濃度愈低，容許偏差越大。因此，平均添加回收率要求為70%～110%。

1.2.3 農(nóng)藥殘留檢測(cè)

1) 鮮煙葉。稱取10 g煙葉樣品置于150 mL錐形瓶中，然后加入80 mL乙酸乙酯，振蕩提取1 h后取出。在鋪有Celite545的砂芯漏斗中抽濾，再用20 mL乙酸乙酯洗滌容器與殘?jiān)螅喜V液。濾液過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥后轉(zhuǎn)移至150 mL梨形瓶中，40℃旋蒸濃縮并用氮?dú)獯蹈伞Ｏ蚶嫘纹恐屑尤?.05 g C18和0.1 g無(wú)水MgSO4，用1 mL甲醇定容，渦旋1 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

2) 煙粉。稱取2 g煙粉樣品置于100 mL錐形瓶中，加入80 mL乙腈與水的混合溶液(V∶V為7∶3) 作為提取劑，超聲20 min。在鋪有Celite545的砂芯漏斗中抽濾，再用20 mL上述混合溶液洗滌容器與殘?jiān)?，合并濾液。將濾液轉(zhuǎn)移至150 mL梨形瓶中，45℃旋蒸濃縮。將上述除去乙腈后的水相轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中，加入20 mL飽和氯化鈉水溶液，用50 mL、40 mL及30 mL二氯甲烷分3次萃取，每次5 min，收集下層有機(jī)相；有機(jī)相過(guò)裝有無(wú)水硫酸鈉和脫脂棉的三角漏斗，將合并后的有機(jī)相在40℃旋蒸濃縮至近干，然后用氮?dú)獯蹈?。用甲醇定容? mL后用0.22 μm膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.2.4 色譜條件檢測(cè)儀器：超高效液相色譜儀；檢測(cè)器：PDA檢測(cè)器；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50 mm，1.7 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；進(jìn)樣量：1.0 μL；流速：3 mL/min；柱溫：40℃；流動(dòng)相：甲醇∶水(10∶90，V∶V)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用外標(biāo)法定量，噻霉酮的定量公式：

式中，CB為樣品中噻霉酮的含量(mg/kg)，WB為進(jìn)樣樣品中噻霉酮的檢出量(μg)，VB為定容體積(mL)，AB為進(jìn)樣體積(μL)，MB為樣品的質(zhì)量(kg)。

消解動(dòng)態(tài)方程計(jì)算公式：

C=C0e-kt

式中，C為農(nóng)藥在t時(shí)刻的殘留量(mg/kg)，C0為農(nóng)藥的初始濃度(mg/kg)，k為降解速率常數(shù)，t為降解時(shí)間(d)。

由上面公式求出農(nóng)藥的消解半衰期T1/2，即T1/2=ln2/k。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1看出，波長(zhǎng)320 nm條件下噻霉酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的含量與吸光度呈線性關(guān)系，其峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.20%～2.56%，線性方程為y=5 581.1x+57.50(R=0.999 8)，表明，線性關(guān)系良好。

圖1噻霉酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度

由表1可知，鮮煙葉添加水平為0.1～1.0 mg/kg時(shí)，平均回收率分別為73.34%～86.06%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.12%～7.28%；煙粉的添加水平為0.5～5.0 mg/kg時(shí)，平均回收率為77.41%～84.90%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.76%～5.64%。表明，鮮煙葉和煙粉中噻霉酮的最低檢測(cè)濃度分別為0.1 mg/kg和0.5 mg/kg。說(shuō)明，該方法的準(zhǔn)確度和精密度均達(dá)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 788—2004[18]，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。

表1貴州和湖南煙區(qū)鮮煙葉及煙粉中噻霉酮的添加回收率

Table 1 Adding recovery rate of benziothiazolinone in fresh tobacco leaves and tobacco powder in Guizhou and Hunan tobacco areas %

處理/(mg/kg)Treatment添加回收率 12345平均RSD鮮煙葉0.190.6383.0384.2790.9682.4086.065.120.466.7475.5381.0871.3272.0473.347.281.079.5978.9771.2580.4474.0776.865.20煙粉 0.588.1789.8399.0486.1777.8884.905.642.082.3372.4679.2575.9377.0977.414.765.083.8675.7380.8085.9287.3682.745.59

2.3 噻霉酮在煙草中消解動(dòng)態(tài)

由表2和圖2看出，施藥后隨時(shí)間延長(zhǎng)，貴州和湖南煙草中噻霉酮的殘留量均呈下降趨勢(shì)。施藥當(dāng)天的檢出量分別為0.512 8 mg/kg和0.432 9 mg/kg；施藥7 d后，噻霉酮在貴州和湖南煙草樣品中的殘留量均低于最低檢測(cè)濃度(0.1 mg/kg)，降解率分別>80%及>76%，且其半衰期(T1/2)分別為2.8 d和3.1 d，動(dòng)力學(xué)方程分別為C貴州=0.470 3 e-0.248 8 t(R=-0.976 9)及C湖南=0.412 8 e-0.224 4 t(R=-0.960 3)。說(shuō)明，噻霉酮在煙草中的消解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，消解速率較快。

表2貴州和湖南煙區(qū)煙草中噻霉酮的消解動(dòng)態(tài)

Table 2 Digestion dynamics of benziothiazolinone in tobacco from Guizhou and Hunan tobacco areas

采樣時(shí)間(d)Sampling time湖南省長(zhǎng)沙市Changsha City of Hunan Province殘留量/(mg/kg)降解率/%貴州省惠水縣Huishui County of Guizhou Province殘留量/(mg/kg)降解率/%00.432 9-0.512 8-10.332 723.170.407 620.5120.323 625.26--30.157 363.670.176 365.6150.118 872.560.116 577.297<0.100 0>76.90<0.100 0>80.5010<0.100 0>76.90<0.100 0>80.5014<0.100 0>76.90<0.100 0>80.5021<0.100 0>76.90<0.100 0>80.5028<0.100 0>76.90<0.100 0>80.5042<0.100 0>76.90<0.100 0>80.5060<0.100 0>76.90`<0.100 0>80.50

注：—表示無(wú)數(shù)據(jù)。

Note:— means no data.

2.4 噻霉酮在煙草中最終殘留

從圖3可見，噻霉酮標(biāo)樣色譜峰形較好，在試驗(yàn)設(shè)定檢測(cè)色譜條件下保留時(shí)間為6.2 min左右。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在該檢測(cè)色譜條件下貴州和湖南煙草和煙粉樣品中噻霉酮未出峰，即峰面積視為0，濃度為0。表明，煙草和煙粉樣品中噻霉酮的最終殘留量為未檢出(<最低檢測(cè)濃度0.1 mg/kg)。從圖4和圖5可見，根據(jù)上述樣品前處理方法及色譜條件，噻霉酮與樣品基質(zhì)峰能夠很好分離，雜質(zhì)峰對(duì)噻霉酮檢測(cè)的干擾較小。

圖2貴州和湖南煙區(qū)煙草樣品中噻霉酮的消解曲線

Fig.2 Digestion curve of benziothiazolinone in tobacco samples from Guizhou and Hunan tobacco areas

Fig.3 Chromatography of benziothiazolinone standard sample

注：a，鮮煙葉空白樣品；b，鮮煙葉樣品加標(biāo)回收；c，鮮煙葉樣品。

Note：a, fresh tobacco leaf blank control; b, fresh tobacco leaf adding recovery; c, fresh tobacco leaf sample.

圖4鮮煙葉樣品中噻霉酮的殘留量色譜

Fig.4 Residue chromatogram of benziothiazolinone in fresh tobacco samples

注：a，煙粉空白樣品；b，煙粉樣品加標(biāo)回收;C,煙粉樣品。

Note: a, tobacco powder blank control; b, tobacco powder adding recovery；C,tobacco powder smple.

圖5煙粉樣品中噻霉酮的殘留量色譜

Fig.5 Residue chromatogram of benziothiazolinone in tobacco powder samples

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，貴州和湖南煙區(qū)煙草中噻霉酮的消解半衰期為2.8～3.1 d。施藥7 d后，噻霉酮?dú)埩袅烤陀谧畹蜋z測(cè)濃度 (0.1 mg/kg)，消解速率較快。3%噻霉酮水分散粒劑施藥量為40～60 g a.i/hm2，每次施藥間隔期為7 d，煙草樣品在距末次施藥7 d、14 d及21 d時(shí)噻霉酮的殘留量均低于0.5 mg/kg，表明3%噻霉酮水分散粒劑在推薦劑量下使用安全。建議：3%噻霉酮水分散粒劑在煙草野火病發(fā)病前或發(fā)病初期或煙草旺長(zhǎng)期使用，最高使用劑量為60 g a.i/hm2，每季最多使用3次。