黃 晶， 葉慶生

(1.廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院， 廣東 廣州 510520； 2.華南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 廣東 廣州 510631)

金釵石斛(DendrobiumnobileLindl)是我國(guó)重要的傳統(tǒng)名貴中藥材，具益胃生津、滋陰清熱等功效，對(duì)心血管、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及眼科疾病有明顯的輔助治療作用[1-2]。因其花色鮮艷、花姿優(yōu)美而成為世界著名的觀賞花卉。金釵石斛不僅具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和較高的觀賞價(jià)值，同時(shí)因其是軟莖類石斛重要的育種親本[3]，因此還具有較高的科研價(jià)值。金釵石斛主要分布于我國(guó)臺(tái)灣、海南、貴州、福建、湖南、湖北、廣西、云南及四川等長(zhǎng)江以南的亞熱帶地區(qū)[4]，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較高，生長(zhǎng)緩慢，自然繁殖率低，加上生態(tài)環(huán)境的惡化及長(zhǎng)期過度采集，其野生資源日趨稀少[5]。作為國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材珍貴品種，研究金釵石斛的種質(zhì)保存、品種改良和快速繁殖技術(shù)在生產(chǎn)應(yīng)用上具有重要作用，采用無性繁殖技術(shù)加快人工種苗的供給已成為當(dāng)務(wù)之急。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)石斛的一些珍貴種類進(jìn)行組織培養(yǎng)及商品化生產(chǎn)研究[6-8]，但不同種或品種對(duì)萌發(fā)營(yíng)養(yǎng)的需求存在較大差異。若想達(dá)到石斛蘭的規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展目標(biāo)，需要根據(jù)種類和預(yù)期達(dá)到的觀賞目的有針對(duì)性地制定不同的組織培養(yǎng)方案。鑒于此，筆者采用組織培養(yǎng)方法研究金釵石斛原球莖及幼苗的快速繁殖體系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 金釵石斛保存于華南師范大學(xué)生命科學(xué)院蘭花中心。

1.1.2 試劑酒精、瓊脂、蔗糖、1/2MS培養(yǎng)基、6-BA、NAA、IBA和活性炭(北京鼎國(guó))。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理取當(dāng)年成熟且未開裂的蒴果，小刀切去果莢上有傷痕容易藏菌的部分后，用70%酒精浸泡5～8 min，灼燒后用解剖刀切開蒴果，得到無菌種子。將無菌種子均勻播散于1/2MS基本培養(yǎng)基上，添加瓊脂0.7%，蔗糖2%，pH 5.6。種子轉(zhuǎn)綠萌發(fā)但還未分化出頂芽時(shí)即得原球莖，原球莖分散在經(jīng)高溫滅菌的1%的瓊脂溶液中，制成一定濃度的原球莖懸浮液備用。取33 mL培養(yǎng)基置玻璃瓶中，采用121℃滅菌20 min備用。

1.2.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)原球莖增殖的影響采用3因素試驗(yàn)(表1)，其中：A，培養(yǎng)基，固體(A1)和液體(A2)的1/2MS培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基再加瓊脂0.7%；B，6-BA，濃度分別為0.5 mg/L、1 mg/L和2.0 mg/L；C，NAA，濃度分別為0.5 mg/L、1 mg/L和2.0 mg/L。每瓶培養(yǎng)基中按試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加入6-BA和NAA，然后再加入蔗糖2%，pH 5.6。每瓶培養(yǎng)基加入5 mL懸浮液(含原球莖約400粒)，每個(gè)處理8瓶，3次重復(fù)。培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度50～60 μmol/(m2·s)，光照時(shí)間 12 h/d，溫度(25±2)℃(下同)。液體培養(yǎng)基需放在震蕩培養(yǎng)箱上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120 r/min。增殖培養(yǎng)20 d后進(jìn)行稱重，觀察培養(yǎng)基物理狀態(tài)、不同激素濃度及配比對(duì)原球莖增殖和生長(zhǎng)的影響。

表1金釵石斛原球莖增殖培養(yǎng)的試驗(yàn)方案

Table 1 Experimental scheme for proliferation culture ofD.nobile

處理Treatments液態(tài)/固態(tài)培養(yǎng)基Liquid/solid culture medium6-BANAA12.00.521.00.530.51.040.52.0

1.2.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響種子在1/2MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)長(zhǎng)出綠色的原球莖，將原球莖分瓶培養(yǎng)一段時(shí)間后，取剛剛長(zhǎng)出頂芽且生長(zhǎng)一致的原球莖進(jìn)行幼苗生長(zhǎng)培養(yǎng)條件的優(yōu)化篩選。

1) 瓊脂。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，即在1/2MS基本培養(yǎng)基中，蔗糖濃度為2%，瓊脂濃度分別為0.5%、0.6%、0.7%和0.8%。

2) 蔗糖。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，即在1/2MS基本培養(yǎng)基中，瓊脂濃度為0.7%，蔗糖濃度分別為1%、2%、3%和4%。

3) 椰汁。在1/2MS基本培養(yǎng)基中，瓊脂濃度為0.7%，蔗糖濃度為2%，椰汁濃度分別為0、10%和20%，以未添加椰汁為對(duì)照(CK)。配好后的培養(yǎng)基pH 5.6。

取33 mL上述培養(yǎng)基于玻璃瓶中，將原球莖長(zhǎng)成的幼苗每瓶接種5株，每個(gè)處理8瓶，3次重復(fù)。每月更換培養(yǎng)基，記錄幼苗生長(zhǎng)情況。3個(gè)月后統(tǒng)計(jì)小苗莖高、莖粗、葉片數(shù)、葉長(zhǎng)、生根數(shù)、根長(zhǎng)及根粗等指標(biāo)，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析篩選幼苗生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)方案。

1.2.4 激素和活性炭對(duì)幼苗生根的影響原球莖在未添加椰汁和植物激素的1/2MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個(gè)月，當(dāng)苗生長(zhǎng)達(dá)1 cm左右時(shí)，取生長(zhǎng)一致、健壯的小苗進(jìn)行生根培養(yǎng)條件的優(yōu)化篩選。以1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，瓊脂濃度0.7%，蔗糖濃度2%，pH 5.6。

1) NAA。設(shè)3個(gè)處理N1～N3，在培養(yǎng)基中加入NAA濃度分別為0.2 mg/L、0.5 mg/L和1.0 mg/L。以未添加NAA、IBA以及活性炭處理作對(duì)照(CK1)。

2) IBA。設(shè)3個(gè)處理T1～T3，在培養(yǎng)基中加入IBA濃度分別為0.2 mg/L、0.5 mg/L和1.0 mg/L。以未添加NAA、IBA以及活性炭處理作對(duì)照(CK2)。

3) 活性炭(AC)。設(shè)4個(gè)處理A1～A4，在培養(yǎng)基中加入活性炭濃度分別為0.2 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L和2.0 g/L。以未添加NAA、IBA以及活性炭處理作對(duì)照(CK3)。

采用盛有33 mL培養(yǎng)基的玻璃瓶培養(yǎng)，每瓶5株，每個(gè)處理8瓶，3次重復(fù)。每45 d更換培養(yǎng)基，記錄幼苗生長(zhǎng)情況。3個(gè)月后，統(tǒng)計(jì)小苗生根數(shù)、根長(zhǎng)和根粗，通過統(tǒng)計(jì)分析篩選幼苗生根的最佳培養(yǎng)方案。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用EXCEL和SPSS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并采用Duncan最小顯著差數(shù)測(cè)驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件原球莖的增殖培養(yǎng)

從圖1可見，金釵石斛的種子呈淡黃綠色，播種4周后，胚膨大脹破種皮，長(zhǎng)成綠色圓球莖。液體和固體培養(yǎng)基對(duì)原球莖生長(zhǎng)有很大的影響，二者間差異極顯著。液體培養(yǎng)基明顯地促進(jìn)原球莖的生長(zhǎng)，在液體培養(yǎng)基中長(zhǎng)成的原球莖體積約為固體培養(yǎng)基中的5～10倍，顏色嫩綠，雖然在搖床上培養(yǎng)，但仍能呈現(xiàn)形態(tài)極性，培養(yǎng)20 d后球莖頂端分化出芽，側(cè)部突起產(chǎn)生第一葉原基；相比之下，固體培養(yǎng)基中的原球莖生長(zhǎng)很慢，個(gè)體較小。從表2看出，不同激素濃度和配比對(duì)原球莖的生長(zhǎng)也有影響。其中，固體培養(yǎng)基不同激素配比對(duì)原球莖生長(zhǎng)的影響處理間差異較小，除處理3(即6-BA、NAA濃度分別為0.5 mg/L和1.0 mg/L)原球莖的生長(zhǎng)顯著優(yōu)于其余3個(gè)處理外，其余3個(gè)處理間差異不顯著；液體培養(yǎng)基不同激素配比對(duì)原球莖生長(zhǎng)的影響處理間差異相對(duì)較大，各處理原球莖的生長(zhǎng)量依次為處理3(即6-BA、NAA濃度分別為0.5 mg/L和1.0 mg/L)>處理4(6-BA、NAA分別為0.5 mg/L和2.0 mg/L)>處理1(6-BA、NAA分別為2.0 mg/L和0.5 mg/L)>處理2(6-BA、NAA分別為1.0 mg/L和0.5 mg/L)，處理3原球莖的生長(zhǎng)量最大，為0.355 g，顯著高于處理1和處理2，處理4顯著高于處理2。

注：A，未進(jìn)行增殖培養(yǎng)的原球莖；B，液體和固體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)20 d后的原球莖(左邊為固體培養(yǎng)基，右邊為液體培養(yǎng)基)；C，不同6-BA和NAA濃度的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)20 d后的原球莖，從左到右6-BA、NAA濃度依次為2 mg/L和0.5 mg/L，1 mg/L和0.5 mg/L，0.5 mg/L和1 mg/L，0.5 mg/L和2 mg/L。

Note: A，protocorms before proliferation culture; B，protocorm after 20 days proliferation on liquid or solid culture medium (left，solid culture medium; right，liquid culture medium); C，protocorm after 20 days proliferation on liquid culture medium with different concentration of 6-BA/NAA，concentrations of 6-BA/NAA are 2/0.5，1/0.5，0.5/1 and 0.5/2 mg/L from left to right，respectively.

圖 1不同培養(yǎng)條件金釵石斛原球莖的增殖狀況

Fig.1 Proliferation ofD.nobileprotocorm in different culture conditions

表26-BA、NAA各濃度配比及不同培養(yǎng)基物理狀態(tài)處理金釵石斛原球莖的生長(zhǎng)

Table 2 Growth status ofD.nobileprotocorm with various 6-BA, NAA concentration ratio and physical condition of different medium

g

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；同列不同小寫字母表示P<0.05水平上的差異顯著性。下同。

Note: Data in the table are average ± standard error; Values with different small letter in the same column have significant difference (P<0.05). The same below.

2.2 不同培養(yǎng)條件幼苗的生長(zhǎng)

從表3看出，不同培養(yǎng)條件下金釵石斛幼苗生長(zhǎng)存在一定差異。

2.2.1 瓊脂培養(yǎng)基中添加不同含量的瓊脂金釵石斛幼苗的生長(zhǎng)存在差異。隨著瓊脂含量增加，金釵石斛幼苗的莖高、莖粗、葉數(shù)、葉長(zhǎng)、生根數(shù)、根長(zhǎng)及根粗均呈減少趨勢(shì)。其中，當(dāng)瓊脂含量為0.5%時(shí)，培養(yǎng)基水分含量高，此時(shí)幼苗生長(zhǎng)最快，培養(yǎng)3個(gè)月后其莖高、莖粗、葉長(zhǎng)、生根數(shù)及根長(zhǎng)分別為2.34 cm、0.288 cm、1.67 cm、5.25根和3.56 cm，均顯著高于其余3個(gè)處理，且葉片生長(zhǎng)快，顏色鮮綠，光澤度好。說明，瓊脂濃度越低，培養(yǎng)基越軟，越有利于金釵石斛幼苗莖葉和根的生長(zhǎng)。

2.2.2 蔗糖培養(yǎng)基中添加蔗糖的濃度不同對(duì)金釵石斛幼苗莖和葉的生長(zhǎng)影響不顯著，但對(duì)根的生長(zhǎng)有影響明顯。當(dāng)蔗糖濃度低至1%時(shí)，葉片生長(zhǎng)較快，但水分含量高，植株較脆弱且有玻璃化的現(xiàn)象；當(dāng)蔗糖濃度為2%時(shí)，其葉長(zhǎng)為1.28 cm，顯著高于其余3個(gè)處理；當(dāng)蔗糖濃度升至4%時(shí)，葉的生長(zhǎng)受阻，葉片短小，呈現(xiàn)一定的黃化狀態(tài)。蔗糖濃度為2%或3%時(shí)，幼苗莖葉生長(zhǎng)較好。隨著蔗糖濃度增加，金釵石斛幼苗的生根數(shù)、根長(zhǎng)及根粗均呈增加趨勢(shì)，高濃度的蔗糖雖然抑制地上部分生長(zhǎng)但卻有利于根生長(zhǎng)。蔗糖濃度為4%時(shí)金釵石斛幼苗的生根數(shù)、根長(zhǎng)及根粗均最大，分別為6.38條、3.47 cm和0.100 cm，其生根數(shù)顯著高于其余3個(gè)處理，根長(zhǎng)及根粗顯著高于濃度1%和濃度2%處理。綜合莖、葉和根的生長(zhǎng)考慮，金釵石斛幼苗培養(yǎng)最佳蔗糖濃度為3%。

2.2.3 椰汁培養(yǎng)基中添加椰汁對(duì)金釵石斛幼苗生長(zhǎng)有很大的促進(jìn)作用，即隨著椰汁濃度升高，金釵石斛幼苗的莖高、莖粗、葉數(shù)、葉長(zhǎng)、生根數(shù)、根長(zhǎng)及根粗均呈增加趨勢(shì)。相比對(duì)照而言，添加椰汁的培養(yǎng)基，金釵石斛幼苗生長(zhǎng)更快。培養(yǎng)3個(gè)月后，20%椰汁培養(yǎng)基中幼苗的莖高、葉長(zhǎng)、生根數(shù)和根長(zhǎng)明顯高于其余2個(gè)處理；其莖粗和葉數(shù)與10%椰汁處理差異不顯著，但明顯高于對(duì)照。

注：A，從左到右分別為培養(yǎng)3個(gè)月后瓊脂濃度0.5%、0.6%、0.7%和0.8%培養(yǎng)基中的幼苗；B，從左到右分別為培養(yǎng)3個(gè)月后蔗糖濃度1%、2%、3%、4%培養(yǎng)基中的幼苗；C，從左到右分別為培養(yǎng)3個(gè)月后椰汁濃度20%、10%和0培養(yǎng)基中的幼苗。

Note: A，Seedling after 3-month culture on 0.5%，0.6%，0.7% and 0.8% agar culture medium from left to right; B，Seedling after 3-month culture on solid culture medium with sucrose concentration of 1%，2%，3% and 4% from left to right; C，Seedling after 3-month culture on solid culture medium with coconut juice concentration of 20%，10% and 0 from left to right.

圖2不同培養(yǎng)條件金釵石斛幼苗的生長(zhǎng)狀況

Fig.2 Growth status ofD.nobileseedlings with different culture conditions

表3 不同培養(yǎng)條件金釵石斛幼苗的生長(zhǎng)

2.3 激素和活性炭對(duì)幼苗生根的影響

由表4看出，培養(yǎng)基是添加NAA、IBA和活性炭均能夠顯著促進(jìn)金釵石斛幼苗根的生長(zhǎng)。

2.3.1 激素隨著NAA和IBA濃度升高，根的生長(zhǎng)更加旺盛，生根數(shù)和根長(zhǎng)均呈增加趨勢(shì)。NAA濃度為1 mg/L時(shí)，生根數(shù)和根長(zhǎng)、根粗均達(dá)最大值，分別為5.25條、7.19 cm和0.084 cm，其中，生根數(shù)和根長(zhǎng)顯著高于無添加和0.2 mg/L處理。IBA濃度為1 mg/L時(shí)，生根數(shù)和根長(zhǎng)、根粗均達(dá)最大值，分別為6.13條、5.41 cm和0.086 cm，但與0、0.2 mg/L和0.5 mg/L處理差異不顯著，僅與無添加處理差異顯著。NAA與IBA相比較而言，NAA更有利于根長(zhǎng)的生長(zhǎng)，而IBA更有利于生根數(shù)的增加。

表4不同激素和活性炭處理金釵石斛幼苗根的生長(zhǎng)

Table 4 Growth ofD.nobileseedling root protocorm treated with different hormone and active carbon

處理濃度Concentration生根數(shù)/條Rooting number根長(zhǎng)/cmRoot length根粗/cmRoot diameterNAA CK13.13±0.44 b2.67±0.39 b0.070±0.003 bN13.75±0.41 b3.53±0.30 b0.085±0.003 aN24.25±0.37 ab6.71±0.44 a0.079±0.004 abN35.25±0.41 a7.19±1.17 a0.084±0.002 aIBA CK23.13±0.44 b2.67±0.39 b0.070±0.003 bT14.50±0.57 ab4.74±0.62 a0.078±0.004 abT25.38±0.71 a4.64±0.47 a0.082±0.005 abT36.13±0.90 a5.41±0.50 a0.086±0.006 aACCK33.13±0.44 b2.67±0.39 b0.070±0.003 cA14.00±0.33 ab3.16±0.35 c0.068±0.004 cA24.50±0.33 a4.15±0.67 bc0.076±0.003 cA34.88±0.55 a5.19±0.51 ab0.099±0.004 bA45.25±0.31 a6.25±0.52 a0.112±0.005 a

2.3.2 活性炭隨著活性炭濃度升高，根的生長(zhǎng)更加旺盛，生根數(shù)、根長(zhǎng)和根粗均呈增加趨勢(shì)。當(dāng)活性炭濃度為2 g/L時(shí)，培養(yǎng)基透明度最低，生根數(shù)、根長(zhǎng)和根粗達(dá)最大，分別為5.25條、6.25 cm和0.112 cm，生根數(shù)顯著高于無添加處理，根長(zhǎng)顯著高于除1 g/L處理的其余處理，根粗顯著高于其余處理。說明，活性炭濃度越高，越有利于生根。

3 結(jié)論與討論

瓊脂的凝固能力與原料、生產(chǎn)廠家的加工方式、高壓滅菌的溫度、時(shí)間及pH等因素有關(guān)。瓊脂本身不提供任何營(yíng)養(yǎng)而只起支持作用[9]。瓊脂濃度太低，不能很好地起支持作用，但如果濃度太高則硬化，植株不能與培養(yǎng)基很好地接觸，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)難以擴(kuò)散被植株吸收。一般來說，瓊脂含量為0.3%～0.5%時(shí)形成半固體，即較軟的固體，含量在0.7%以上形成較硬的固體。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在較軟的培養(yǎng)基上培養(yǎng)石斛蘭生長(zhǎng)旺盛。

糖作為碳源，為細(xì)胞提供合成新化合物的骨架，并為其呼吸代謝提供底物和能源，還可以維持滲透壓。蘭花的組織培養(yǎng)普遍使用蔗糖作為碳源。該研究表明，低濃度蔗糖作為碳源，可致石斛幼苗發(fā)生玻璃化現(xiàn)象，而高濃度雖然有利于根的生長(zhǎng)，但葉片生長(zhǎng)受到一定抑制?？赡苁且?yàn)檫^低的糖不能滿足細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)、代謝和生長(zhǎng)的需要，過高的糖又可能會(huì)干擾正常糖代謝，使培養(yǎng)系統(tǒng)滲透壓增加，阻礙了細(xì)胞對(duì)水分的吸收，明顯抑制地上部分的生長(zhǎng)。綜合考慮莖、葉和根的生長(zhǎng)認(rèn)為，金釵石斛幼苗培養(yǎng)最佳蔗糖濃度為3%。

天然提取物是除基礎(chǔ)培養(yǎng)基中已加入的有機(jī)質(zhì)外額外添加的一些有機(jī)物，在石斛繁殖研究中常用椰汁、香蕉汁和馬鈴薯勻漿等作為天然提取物來源[10-11]。椰汁養(yǎng)分豐富且復(fù)雜，含有玉米素等植物激素，還具有緩沖培養(yǎng)基pH的功能。該試驗(yàn)采用椰汁為添加物顯著促進(jìn)了金釵石斛幼苗的生長(zhǎng)，說明，椰汁對(duì)石斛的生長(zhǎng)十分有利。

趙天榜等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)，激素NAA和IBA對(duì)植物根再生誘導(dǎo)效果顯著。該研究表明，NAA和IBA對(duì)石斛幼苗生根有促進(jìn)作用，且濃度越高促進(jìn)效果越明顯，二者均以濃度為1 mg/L時(shí)生根數(shù)和根長(zhǎng)最大。

活性炭常用于植物組織培養(yǎng)中促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育?；钚蕴?AC)的作用可能在于可以不可逆的吸附培養(yǎng)基中一些抑制性化合物，降解一些有毒代謝物，如酚類化合物和褐化物質(zhì)[14]。單獨(dú)的AC或聯(lián)合生長(zhǎng)素可以促進(jìn)很多組培植物生根[15]。該研究表明，添加AC有助于石斛幼苗生根。關(guān)于AC促進(jìn)根生長(zhǎng)的機(jī)理并不十分清楚，一般認(rèn)為與AC減弱光照有關(guān)。由此推測(cè)，可能是由于根頂端能產(chǎn)生IAA，促進(jìn)了根的生長(zhǎng)，但I(xiàn)AA易受可見光的光氧化而被破壞，因此，AC的主要作用可能在于通過減弱光照保護(hù)IAA，從而間接促進(jìn)根的生長(zhǎng)。