金建麗， 劉思宇，2， 劉艷爽， 曹明星

(1.牡丹江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 黑龍江 牡丹江 157011； 2.富錦市第四中學(xué)， 黑龍江 富錦 156100)

棕黑錦蛇(Elapheschrenckii)屬脊索動(dòng)物門(mén)，爬行綱，有鱗目，游蛇科，錦蛇屬[1]，為我國(guó)北方常見(jiàn)的大型蛇種，食用價(jià)值和藥用價(jià)值高，市場(chǎng)需求量較大，而人工養(yǎng)殖的棕黑錦蛇死亡率較高，難以滿足市場(chǎng)需求，致使野生資源不斷遭到濫捕，野生資源量逐漸減少。因其種群結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，捕獲的個(gè)體越來(lái)越小，是亟須保護(hù)的對(duì)象。

消化酶是由消化道或消化腺分泌的起營(yíng)養(yǎng)消化作用的一種特殊酶類(lèi)，對(duì)于動(dòng)物的生長(zhǎng)和發(fā)育極為重要，在動(dòng)物生理生化研究中，其消化酶研究是不能缺少的重要一環(huán)。酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，決定了其酶促反應(yīng)受溫度和pH的影響，國(guó)內(nèi)外有很多關(guān)于溫度和pH對(duì)動(dòng)物消化酶活性影響的報(bào)道[2-5]。目前，有關(guān)動(dòng)物的消化酶研究主要集中于水產(chǎn)品消化酶性質(zhì)的研究、外界因素對(duì)消化酶活性的影響[6-8]等，而有關(guān)蛇類(lèi)消化酶的研究國(guó)內(nèi)外僅有少量報(bào)道[2-3，9-10]。為此，筆者以棕黑錦蛇為研究對(duì)象，研究溫度和pH對(duì)棕黑錦蛇消化酶活力的影響，以期為其消化生理研究、人工配合飼料的研制及潔凈養(yǎng)殖生產(chǎn)提供參考，以實(shí)現(xiàn)對(duì)棕黑錦蛇的有效保護(hù)及可持續(xù)利用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 棕黑錦蛇于2014年7月采集于牡丹江東京城林業(yè)局，共15條，均為健康成年個(gè)體。樣本存于超低溫冰箱中待測(cè)。

1.1.2 儀器超純水系統(tǒng)(上海和泰儀器有限公司)，高速分散均質(zhì)機(jī)(FT-200型，上海標(biāo)本模型制造)，高速冷凍離心機(jī)(Beckman64R，美國(guó))，L3S可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)，微量移液槍(Rainin Pipetlite Magnetic Assist Pipette SL-10 SL-100，德國(guó)Eppendorf公司)，超低溫冰箱(美國(guó)貝克曼公司)。

1.1.3 試劑磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、巴比妥、濃鹽酸、甘氨酸、氫氧化鈉、酪素、可溶性淀粉、碘酸鉀、碘化鉀、聚乙烯醇粉末、橄欖油、甘氨酸、福林酚、95%乙醇、碳酸鈉、三氯乙酸和酚酞等，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶液制備取棕黑錦蛇食道、胃、小腸、大腸、肝臟和胰臟，用生理鹽水清洗胃中食糜和腸道內(nèi)容物樣本。樣本與磷酸緩沖液按1∶20比例于冰浴中充分勻漿，勻漿液置于高速冷凍離心機(jī)中(4℃，12 000 r/min)離心20 min，上清液即為粗酶液。

1.2.2 反應(yīng)體系的pH和溫度設(shè)置pH：在37℃條件下，以pH間隔0.4，在5.0～10.6范圍內(nèi)設(shè)置15個(gè)pH梯度(5.0、5.4、5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8、8.2、8.6、9.0、9.4、9.8、10.2、10.6)。溫度：在最適pH條件下，以溫度間隔3℃，在23～56℃范圍內(nèi)設(shè)置12個(gè)梯度(23℃、26℃、29℃、32℃、35℃、38℃、41℃、44℃、47℃、50℃、53℃、56℃)。

1.2.3 酶活力測(cè)定

1) 蛋白酶。采用福林-酚法[11]測(cè)定蛋白酶活力。蛋白酶活力以比活力表示(U/mg)，即在pH 7.5和37℃條件下，1 mg蛋白酶每分鐘水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個(gè)酶活力單位(表示所用粗酶液中每毫克酶蛋白的活力單位)。

2) 淀粉酶。采用淀粉-碘法[11]測(cè)定淀粉酶活力。淀粉酶活力以比活力表示(U/mg)，即在pH 7.5和37℃條件下，30min內(nèi)，100 mL粗酶液中1 g淀粉酶能完全水解淀粉10 mg為1個(gè)酶活力單位。

3) 脂肪酶。采用聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法[11]測(cè)定脂肪酶活力。脂肪酶活力以比活力表示(U/mg)，即在pH 7.5和40℃條件下，1 mg脂肪酶水解脂肪每分鐘產(chǎn)生1 μmol脂肪酸的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用軟件Origin Pro 9.0計(jì)算酶液蛋白含量及酪氨酸含量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用軟件SPSS 16.0進(jìn)行ANOVA單因素方差分析和Duncan多重比較進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同 pH下棕黑錦蛇的消化酶活力

2.1.1 淀粉酶從表1可知，棕黑錦蛇食道、小腸、大腸淀粉酶活力在pH 5.0～6.6時(shí)呈上升趨勢(shì)，pH為6.6時(shí)最強(qiáng)，分別為56.72 U/mg、43.79 U/mg和67.15 U/mg；pH 7.0～10.6時(shí)酶活力呈下降趨勢(shì)。胃淀粉酶活力在pH 5.0～6.2時(shí)升高，pH為6.2時(shí)最強(qiáng)，為137.95 U/mg；pH 6.2～10.6時(shí)酶活力呈下降趨勢(shì)。肝臟淀粉酶活力在pH 5.0～7.0時(shí)逐漸上升，pH為7.0時(shí)酶活力最強(qiáng)，為166.61 U/mg；在7.0～10.6時(shí)酶活力逐漸下降。胰臟淀粉酶活力在pH 5.0～5.8時(shí)逐漸升高，pH為5.8時(shí)最強(qiáng)，為315.92 U/mg；pH 5.8～10.6時(shí)酶活力呈下降趨勢(shì)。表明，棕黑錦蛇消化系統(tǒng)食道、胃、小腸、大腸、肝臟、胰臟中淀粉酶活力的最適pH分別是6.6、6.2、6.6、6.6、7.0和5.8。

表1 不同 pH下棕黑錦蛇消化系統(tǒng)的淀粉酶活力

注：同列不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant difference(P<0.05).The same below.

2.1.2蛋白酶從表2看出，pH對(duì)棕黑錦蛇消化系統(tǒng)蛋白酶活力的影響無(wú)明顯規(guī)律。食道蛋白酶活力在pH 9.8時(shí)最強(qiáng)，為141.42 U/mg；胃蛋白酶活力在pH 6.6時(shí)最強(qiáng)，為132.74 U/mg；小腸蛋白酶活力在pH 9.0時(shí)最強(qiáng)，為199.54 U/mg；大腸蛋白酶活力在pH 8.6時(shí)最強(qiáng),為105.96 U/mg；肝臟蛋白酶活力在pH 5.8時(shí)最強(qiáng)，為347.97 U/mg；胰臟蛋白酶活力在pH 10.2時(shí)最強(qiáng)，為957.38 U/mg。表明，棕黑錦蛇消化系統(tǒng)食道、胃、小腸、大腸、肝臟、胰臟中蛋白酶活力的最適pH分別是9.8、6.6、9.0、8.6、5.8和10.2

2.1.3 脂肪酶從表3可知，食道脂肪酶活力在pH 5.0～6.2時(shí)逐漸升高，pH 6.2時(shí)最強(qiáng)，為0.034 U/mg；pH 6.2～10.6時(shí)酶活力逐漸下降。胃脂肪酶活力在pH 5.4時(shí)最強(qiáng)，為0.036 U/mg；pH 5.4～10.6時(shí)呈下降趨勢(shì)。小腸、胰臟脂肪酶活力在pH 5.8時(shí)最強(qiáng)，分別為0.036 U/mg和0.038 U/mg；pH 5.8～10.6時(shí)呈下降趨勢(shì)。大腸脂肪酶活力在pH 5.0～6.6時(shí)逐漸升高，pH 6.6時(shí)最強(qiáng)，為0.035 U/mg；pH 7.0～10.6時(shí)酶活力逐漸下降。肝臟脂肪酶活力在pH 5.0～7.4時(shí)呈上升趨勢(shì)，pH 7.4時(shí)最強(qiáng)，為0.039 U/mg；pH 7.4～10.6時(shí)酶活力逐漸下降。表明，棕黑錦蛇消化系統(tǒng)食道、胃、小腸、大腸、肝臟、胰臟中脂肪酶活力的最適pH分別是6.2、5.4、5.8、6.6、7.4和5.8。

2.2 不同溫度下棕黑錦蛇的消化酶活性

2.2.1 淀粉酶從表4可知，棕黑錦蛇食道、胃、小腸、大腸、肝臟、胰臟淀粉酶活力分別在32℃、35℃、35℃、35℃、38℃、29℃時(shí)最強(qiáng)，分別為83.56 U/mg、52.45 U/mg、49.47 U/mg、35.22 U/mg、72.09 U/mg和91.68 U/mg。在最適溫度條件下，6種組織中淀粉酶活力胰臟>食道>肝臟>胃>小腸>大腸，且差異顯著(P<0.05)。

表2 不同 pH下棕黑錦蛇消化系統(tǒng)的蛋白酶活力

表3 不同 pH下棕黑錦蛇消化系統(tǒng)的脂肪酶活力

表4 不同溫度下棕黑錦蛇消化系統(tǒng)的淀粉酶活力

2.2.2 蛋白酶從表5看出，棕黑錦蛇食道、胃、小腸、大腸、肝臟、胰臟蛋白酶活力分別在38℃、41℃、38℃、44℃、47℃、53℃時(shí)最強(qiáng)，分別為128.13 U/mg、88.70 U/mg、194.53 U/mg、84.52 U/mg、135.30 U/mg和133.54 U/mg。在最適溫度條件下，6種組織中蛋白酶活力小腸>肝臟>胰臟>食道>胃>大腸，且差異顯著(P<0.05)。

2.2.3 脂肪酶從表6看出，棕黑錦蛇食道、胃、小腸、大腸、肝臟、胰臟脂肪酶活力分別在38℃、47℃、38℃、35℃、41℃、44℃時(shí)最強(qiáng)，分別為0.27 U/mg、0.31 U/mg、0.42 U/mg、0.03 U/mg、0.51 U/mg、0.51 U/mg。在最適溫度條件下，6種組織中脂肪酶活力胰臟=肝臟>小腸>胃>食道>大腸，且差異顯著(P<0.05)。

表5 不同溫度下棕黑錦蛇消化系統(tǒng)的蛋白酶活力

表6 不同溫度下棕黑錦蛇消化系統(tǒng)的脂肪酶活力

3 討論

3.1 pH 對(duì)棕黑錦蛇3種酶活力的影響

蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶是與動(dòng)物消化作用緊密相關(guān)的酶類(lèi)，對(duì)動(dòng)物的消化營(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)發(fā)育起關(guān)鍵作用。同種動(dòng)物消化系統(tǒng)不同部位不同消化酶的活性具有較大差異，不同動(dòng)物消化系統(tǒng)同一部位消化酶的活性也存在差異。pH是酶促反應(yīng)過(guò)程中的重要因素之一，酶促反應(yīng)均在一定pH條件下進(jìn)行，pH能改變酶的活性中心或者有關(guān)基團(tuán)的狀態(tài)[12]。當(dāng)酶處于某一特定pH環(huán)境時(shí)，其活性達(dá)到最大，即為該酶的最適pH，當(dāng)?shù)陀诨蚋哂谠損H值時(shí)酶活性都會(huì)下降，過(guò)酸或過(guò)堿會(huì)使酶的活性改變或喪失，酶活性隨pH值變化呈倒“V”字形。

試驗(yàn)結(jié)果表明，棕黑錦蛇消化系統(tǒng)6種組織中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力的最適pH不同，其食道、胃、小腸、大腸、肝臟、胰臟中淀粉酶活力的最適pH分別為6.6、6.2、6.6、6.6、6.6和6.2，蛋白酶活力的最適pH分別為6.2、6.8、6.2、5.9、6.2和6.2，脂肪酶活力的最適pH分別為6.2、5.2、5.4、6.2、7.4和4.6。在pH 5.0～8.2時(shí)胰臟中淀粉酶活力較高，尤其在pH 5.8～7.8時(shí)其活力是其他組織的數(shù)倍；同時(shí)，在pH 5.0～8.2時(shí)肝臟中淀粉酶活性除在pH 6.2時(shí)低于胰臟和胃外，其余pH下僅次于胰臟、高于其余組織。表明，胰臟在淀粉的消化與吸收過(guò)程中發(fā)揮主要作用，其次為肝臟。棕黑錦蛇消化系統(tǒng)各組織的蛋白酶活性整體在中性偏酸性時(shí)較高，在偏酸性條件下肝臟蛋白酶活力最強(qiáng)，其次為胰臟，在中性和堿性條件下胰臟蛋白酶活力最強(qiáng)，其次為肝臟。表明，肝臟和胰臟在蛋白質(zhì)的消化及吸收過(guò)程起主要作用。棕黑錦蛇消化系統(tǒng)各組織的脂肪酶在接近中性弱酸時(shí)活性最強(qiáng)，在中性偏堿條件下脂肪酶活性呈遞減趨勢(shì)，在試驗(yàn)設(shè)置的最大pH 10.6時(shí)最低，呈即將失活狀態(tài)，同時(shí)在最小pH 5.0時(shí)活性也較低，與pH對(duì)酶活性影響的典型特點(diǎn)(倒“V”字形)相符。因此，在棕黑錦蛇養(yǎng)殖過(guò)程中要對(duì)飼料成分適當(dāng)調(diào)整，以促進(jìn)棕黑錦蛇對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高飼料的能量利用率，以達(dá)到促進(jìn)生長(zhǎng)及節(jié)約成本的目的。

3.2 溫度對(duì)棕黑錦蛇3種酶活力的影響

溫度是影響酶促反應(yīng)的重要因素之一。酶表現(xiàn)最大活力時(shí)的溫度即為該酶的最適溫度，溫度過(guò)高會(huì)使酶失活，低溫只會(huì)降低酶的活力而不會(huì)使酶失活。酶的最適溫度也不是酶的特征常數(shù)，與底物濃度、作用時(shí)間等因素有關(guān)[12]。在動(dòng)物消化系統(tǒng)的不同消化部位，因酸堿度和酶的種類(lèi)不同其最適pH和最適溫度也不同。

蛇是變溫動(dòng)物，其體溫隨環(huán)境溫度變化而變化，直接影響到體內(nèi)消化酶的活力。試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度對(duì)棕黑錦蛇消化酶活性有顯著影響。食道、胃、小腸、大腸、肝臟、胰臟中淀粉酶活力的最適溫度分別是32℃、35℃、35℃、35℃、38℃和29℃，蛋白酶活力的最適溫度分別是38℃、41℃、38℃、44℃、47℃和53℃，脂肪酶活力的最適溫度為38℃、47℃、38℃、35℃、41℃和44℃。棕黑錦蛇胃淀粉酶活力的最適溫度是35℃，與虎斑頸槽蛇的研究結(jié)果一致[3]。胃、小腸、大腸淀粉酶活力的最適溫度均是35℃，食道淀粉酶活力的最適溫度是32℃，說(shuō)明消化道內(nèi)淀粉酶的功能具有一致性。同時(shí)，在試驗(yàn)所設(shè)溫度范圍內(nèi)，胰臟淀粉酶的活力最強(qiáng)，與pH對(duì)淀粉酶活力的影響結(jié)果一致。胃、小腸中蛋白酶活力的最適溫度分別為38℃和41℃，與對(duì)虎斑頸槽蛇的研究結(jié)果[3]相近。在23～41℃時(shí)小腸的蛋白酶活力最強(qiáng)，其次是肝臟；在44℃和47℃下肝臟的蛋白酶活力最強(qiáng)，在50℃及以上時(shí)胰臟的最強(qiáng)。在23～38℃各組織蛋白酶活力隨溫度增加呈上升趨勢(shì)，在47～56℃隨溫度增加呈下降趨勢(shì)。表明，溫度對(duì)棕黑錦蛇消化系統(tǒng)各組織中蛋白酶活力的影響基本一致。在6種組織中，除大腸脂肪酶活力隨溫度變化波動(dòng)不大外，其余組織均呈典型的倒“V”字形變化。棕黑錦蛇小腸脂肪酶活力的最適溫度為35℃，與對(duì)虎斑頸槽蛇的研究結(jié)果[3]相近。除大腸外其余5種組織脂肪酶活力的最適溫度都偏高，同時(shí)，從整體看，肝臟和胰臟的脂肪酶活力強(qiáng)于其余組織，說(shuō)明肝臟和胰臟在脂肪的消化吸收方面起重要作用。

蛇類(lèi)屬于喜涼動(dòng)物，當(dāng)環(huán)境溫度在40℃以上時(shí)極易死亡[13]，在離體條件下測(cè)定得到的結(jié)果表明，棕黑錦蛇部分組織個(gè)別消化酶的最適溫度超過(guò)致死溫度。因此，測(cè)定結(jié)果在一定程度上反映了消化酶的耐熱性和適應(yīng)性，可為棕黑錦蛇人工飼養(yǎng)的溫度控制提供借鑒。

4 結(jié)論

棕黑錦蛇食道、胃、小腸、大腸、肝臟、胰臟中淀粉酶活力的最適pH分別是6.6、6.2、6.6、6.6、7.0和5.8；蛋白酶的最適pH分別是9.8、6.6、9.0、8.6、5.8和10.2；脂肪酶的最適pH分別是6.2、5.4、5.8、6.6、7.4和5.8。棕黑錦蛇食道、胃、小腸、大腸、肝臟、胰臟中淀粉酶活力的最適溫度分別是32℃、35℃、35℃、35℃、38℃和29℃；蛋白酶的最適溫度分別是38℃、41℃、38℃、44℃、47℃和53℃；脂肪酶的最適溫度分別是38℃、47℃、38℃、35℃、41℃和44℃。

在最適pH和最適溫度條件下，棕黑錦蛇食道、胃、小腸、大腸、肝臟、胰臟中淀粉酶活力胰臟>食道>肝臟>胃>小腸>大腸，且差異顯著(P<0.05)；蛋白酶活力小腸>肝臟>胰臟>食道>胃>大腸，且差異顯著(P<0.05)；脂肪酶活力胰臟>肝臟>小腸>胃>食道>大腸，且差異顯著(P<0.05)。