趙彩呈， 洪英娣， 劉 麗， 張珍蔭， 熊正勇， 伍建榕*

(1.西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224； 2.西南林業(yè)大學(xué) 云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224； 3.云南省玉龍納西族自治縣森林病蟲(chóng)防治檢疫站，云南 麗江 674100； 4.云南省寧蒗縣林業(yè)局，云南 寧蒗 674300)

滇重樓(Parispolyphyllavar.yunnanensis)也稱七葉一枝花，屬百合科，具有消腫止痛、清熱解毒和抑菌的作用，可以用于醫(yī)治咽喉腫痛、跌打損傷、止血祛痰等癥狀，臨床上可有效止血，治療外科炎癥、神經(jīng)性皮炎等。白芨(Bletillastriata)為蘭科白芨屬植物，花葉可供觀賞，莖含大量具有特殊黏度特性的白芨膠，可應(yīng)用于化妝品中，根則是珍貴的中藥材原料，能夠有止血凝血、消腫止痛等作用。隨著滇重樓、白芨的集約化種植，品種退化和病蟲(chóng)害嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和質(zhì)量[1-6]。目前，對(duì)滇重樓的研究大多在分類、栽培技術(shù)、化學(xué)成分和藥理作用等方面[7]，在病蟲(chóng)害防治方面特別是病害國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少[8-10]，而滇重樓和白芨根腐病在生產(chǎn)中發(fā)生普遍，是危害滇重樓和白芨的主要病害之一。因此，對(duì)滇重樓和白芨根腐病病原進(jìn)行鑒定，以期為該病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 滇重樓和白芨樣品采于麗江市玉龍縣太安鄉(xiāng)和寧蒗縣甘海子村的重樓及白芨種植基地。

1.1.2 主要試劑真菌試劑盒為E.Z.N.ATMFungal DNA Kit(100)和D3390-01 (Omega Biotek)；ITS1、ITS4通用引物；PCR擴(kuò)增混合液為2×Power Taq PCR Master Mix，BM2000 DNA Marker；DM0101(Biomed)；DDH2O；1×TAE緩沖液；瓊脂糖；DNA stains。

1.1.3 儀器及工具 電泳儀、微波爐、凝膠成像儀、冷凍離心機(jī)、數(shù)顯恒溫水浴鍋、分析天平、旋渦混合器、液氮罐(10 L)、PCR自動(dòng)化系列分析儀、制冰機(jī)、基因槍等病原菌的分離和鑒定

1.1.4 培養(yǎng)基馬鈴薯瓊膠培養(yǎng)基(PDA)，配方：洗凈去皮馬鈴薯200 g，煮30 min，用紗布濾去馬鈴薯，加蒸餾水補(bǔ)足1 000 mL，加入葡萄糖或蔗糖20 g、瓊膠20 g加熱至完全融化后，于121℃高壓滅菌20 min，冷卻至55℃左右加入0.03 g/L鏈霉素，混合均勻后倒平板待用。

1.2 病原菌的分離與培養(yǎng)

1.2.1 根樣處理將根部樣品流水沖洗4 h，用毛刷輕輕刷去表面泥土，在超凈工作臺(tái)上將病根置于75%酒精浸泡30 s進(jìn)行表面消毒后，置于0.1%升汞消毒3 min，無(wú)菌水沖洗數(shù)次后置于滅菌濾紙吸干，最后放于PDA培養(yǎng)基25oC下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 病原真菌的純化病原菌在25℃黑暗條件下培養(yǎng)5～7 d，待菌絲從病根上長(zhǎng)出后，將長(zhǎng)出的菌絲挑至PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d，獲得純化菌株，接種在試管PDA斜面上，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定對(duì)純化后的病原菌拍照、記錄分離到的菌株數(shù)，參考MCLEAN等對(duì)菌落特征進(jìn)行描述，測(cè)量菌落大小、記錄菌落顏色、質(zhì)地等形態(tài)特征。根據(jù)菌落形態(tài)特征，參考《真菌鑒定手冊(cè)》和《真菌分類學(xué)》，對(duì)分離到的病原菌進(jìn)行初步的分類、鑒定。

1.2.4 病原菌 ITS-分子序列鑒定

1) 菌株培養(yǎng)及采集。將-4℃條件下保存的純化菌株轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上活化，于25℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3～7 d。待菌絲生長(zhǎng)充足后于超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌簽刮下1～2 g菌絲放入1.5 mL離心管中，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2) 菌株DNA的提取。利用真菌試劑盒提取分離菌的DNA：將裝有菌絲的1.5 mL離心管置于液氮中，速凍后用研磨棒迅速將菌絲研磨至粉末狀備用，DNA提取方法參照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)。

3) PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系25 μL：DNA 模板5 μL約50 ng，Mg2+濃度為1.5 mmol/L，dNTPs 濃度為0.2 mmol/L，引物稀釋為5 pmol，Taq DNA聚合酶為0.75 U。反應(yīng)程序： 94℃下預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min， 30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

4) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。架好清洗干凈的制膠模板，將0.5 g瓊脂糖粉、50 mL 1×TAE緩沖液倒入干凈的三角瓶中，于微波爐中加熱使瓊脂糖融化，冷卻至45℃左右時(shí)加0.4 μL核酸染料(4℃)并搖晃混勻。慢慢倒入制膠模板中，不應(yīng)有氣泡。放置20 min，待膠凝固后，將其取出并放入裝有1×TAE緩沖液的電泳槽中。用基因槍分別將5 μL PCR樣品、DNA Maker加入點(diǎn)樣孔中，于100 V電壓下電泳30 min。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察500～700 bp的基因片段長(zhǎng)度，將PCR產(chǎn)物送往測(cè)序公司測(cè)序。

5) 菌株比對(duì)鑒定。序列測(cè)定結(jié)果采用NCBI進(jìn)行比對(duì)，得到同源性99%及以上的序列，再利用ClustalX1.83、BioEdit、Sequence Alignment Editor、PAUP、Tree View等軟件對(duì)所得序列進(jìn)行分析，建造系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 根腐病病狀

滇重樓從染病部位開(kāi)始根莖逐漸腐爛，但在發(fā)病早期滇重樓病癥表現(xiàn)不顯著，后期地上部分葉片因根部吸收水分及養(yǎng)分能力減弱，邊緣變黃焦枯，萎焉易拔起，最后整株萎蔫，根莖部腐爛變軟。白芨染病從塊莖處開(kāi)始出現(xiàn)水漬狀腐爛，后塊根徹底變黑腐爛，地上部莖葉先表現(xiàn)葉尖枯黃葉片失綠，后出現(xiàn)大面積褐色枯斑枯死(圖1)。

圖1滇重樓(左)和白芨(右)根腐病地上部分癥狀

Fig.1 Aboveground symptom of root rot ofParispolyphyllavar.yunnanensis(left) andBletillastriata(right)

2.2 病原菌的形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀

從圖2看出，分離菌(DB-R)菌體呈規(guī)則圓形，生長(zhǎng)迅速，不易被污染，菌絲初期為白色絲狀，后變?yōu)樽霞t色。

圖2 DB-R培養(yǎng) 3 d(左)和7 d(右)后的性狀

Fig.2 Morphological characteristics of DB-R after 3 days (left) and 7 days (right)

2.3 病原菌的分子鑒定

利用通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增DB-R的rDNA-ITS序列，獲得500～750 bp長(zhǎng)度的DNA片段(圖3)。將序列測(cè)定結(jié)果利用NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，找到同源性達(dá)99%的序列(GenBank登錄號(hào)為MK156762)，在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，DB-R與尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum(MK156762)相聚一群，且自舉值達(dá)100%(圖4)。因此，確定引起滇重樓和白芨根腐病的病原真菌為尖孢鐮刀菌。

注：M為2 000 bp的DNA Maker，1為菌株DB-R。

Note: M， 2 000 bp DNA Marker; 1,strain DB-R.

圖3菌株DB-R 的 rDNA-ITS基因序列 PCR產(chǎn)物電泳圖譜

Fig.3 Electrophoretograms for PCR products of rDNA-ITS gene sequences of DB-R strain

圖4基于 rDNA-ITS序列構(gòu)建的菌株 DB-R系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

Fig.4 Phylogenetic tree of DB-R strain constructed based on rDNA-ITS sequences

3 結(jié)論與討論

尖孢鐮刀菌可危害茄科、豆科、林果及花卉等100多種植物，寄主范圍廣泛，種內(nèi)含多個(gè)寄主專化型，在致病性上具有豐富的遺傳多樣性[11-12]。雖然試驗(yàn)確定引起滇重樓和白芨根腐病的病原真菌是尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)，但該菌株是否是滇重樓、白芨?；瓦€需通過(guò)與其他相關(guān)植物進(jìn)行對(duì)比接種試驗(yàn)。

傳統(tǒng)真菌學(xué)分類以形態(tài)學(xué)特征為主要依據(jù)，并遵循柯赫氏法則進(jìn)行病原真菌的鑒定。但僅以病原真菌形態(tài)特征為分類依據(jù)，外界環(huán)境條件的影響很大，有時(shí)也很難獲得其有性無(wú)性孢子形態(tài)，甚至有些真菌不易或不形成繁殖器官，不僅不便于真菌的分類鑒定，而且不能充分反映出物種進(jìn)化及種群間親緣關(guān)系。rDNA-ITS介于18SrDNA和28SrDNA之間， ITS在真菌種間變異豐富，但在同種內(nèi)不同真菌間高度保守，可以提供豐富的遺傳信息，應(yīng)用分子生物學(xué)方法鑒定真菌性病害已經(jīng)成為一種重要手段[13-15]。研究結(jié)合傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS序列分析，鑒定出危害滇重樓和白芨根腐病的病原真菌。參閱植物病原真菌學(xué)的相關(guān)研究[16-18]，不僅對(duì)DB-R的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了比對(duì)，而且在構(gòu)建的基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)樹(shù)中，DB-R與尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum(MK156762) 自舉值達(dá)100%的聚在一起，確定引起滇重樓和白芨根腐病的病原真菌為能夠?yàn)榧怄哏牭毒?/p>

滇重樓和白芨都是土生土長(zhǎng)的藥材，長(zhǎng)期的自然選擇，使得其適應(yīng)于該產(chǎn)地環(huán)境及植物的病原日益增多，而通過(guò)人工馴化后，植物的抗性往往降低，加之不當(dāng)?shù)脑耘喙芾砑夹g(shù)，使得種植區(qū)病害發(fā)生嚴(yán)重，甚至絕收。滇重樓及白芨的經(jīng)濟(jì)價(jià)值主要為根部，尖刀鐮孢菌的危害不但能直接造成根部腐爛，還影響地上部的生長(zhǎng)發(fā)育，間接地對(duì)其根部膨大成長(zhǎng)產(chǎn)生影響，以此造成惡性循壞，導(dǎo)致絕收，嚴(yán)重阻礙當(dāng)?shù)厮幉纳a(chǎn)發(fā)展。對(duì)于滇重樓、白芨根腐病病原菌的確定，不但能夠幫助尋求滇重樓和白芨根腐病病害有效的防治方法，并為后續(xù)生防菌農(nóng)藥制劑的生產(chǎn)及其他生物防治的選擇提供基礎(chǔ)資料，還為種植地的經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出貢獻(xiàn)。