王 雪 趙昱瑋 南敏倫 赫玉芳 呂 娜 何忠梅▲

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院植物化學(xué)研究所，吉林長春 130012

HPLC定量指紋圖譜法評價黃藤質(zhì)量研究

王 雪1趙昱瑋2南敏倫2赫玉芳2呂 娜1何忠梅1▲

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院植物化學(xué)研究所，吉林長春 130012

目的 本實驗采用Agilent 1220高效液相色譜法建立黃藤的指紋圖譜，并建立了同時測定鹽酸巴馬汀﹑鹽酸藥根堿含量的方法。 方法 采用ACE C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，0.1%磷酸溶液（每100mL中加入0.1g十二烷基硫酸鈉）（A）-乙腈（B）為流動相梯度洗脫，流速1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長345nm。 結(jié)果 建立了黃藤的HPLC定量指紋圖譜，10批藥材的HPLC指紋圖譜共標(biāo)定12個共有峰，相似度均在0.90以上。 結(jié)論 該方法建立的黃藤HPLC指紋圖譜特征性強﹑重復(fù)性好﹑靈敏度高，為黃藤的鑒定及質(zhì)量控制提供了參考價值。

黃藤；指紋圖譜；鹽酸巴馬?。畸}酸藥根堿

黃 藤 為 防 己 科（Menispermaceae） 黃 藤（Fibraurea recisa Pierre.）的干燥藤莖，又名天仙藤﹑土黃連等，主要分布在我國廣東﹑云南﹑廣西等地。具有瀉火通便﹑清熱解毒的功效[1]，其主要化學(xué)成分為生物堿﹑內(nèi)酯等[2]，現(xiàn)代藥理作用表明黃藤的活性成分黃藤素具有顯著的抗炎﹑抑菌等活性[3]。目前，鮮見報道有關(guān)于黃藤藥材的HPLC指紋圖譜的研究，為了控制黃藤藥材的質(zhì)量，從而進行黃藤藥材的HPLC指紋圖譜研究。因此本研究旨在對不同產(chǎn)地的黃藤HPLC指紋圖譜進行建立，防止其偽品混入市場[4]，通過黃藤定量HPLC指紋圖譜的建立來進行藥材的質(zhì)量分析，以期能更為全面地控制該藥材的質(zhì)量，為其質(zhì)量評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1220高效液相色譜儀（Agilent）；KQ-100型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海精密儀器儀表有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（西安禾普生物科技有限公司）；124S電子天平（sartorius）。

1.2 試藥

乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。鹽酸巴馬汀﹑鹽酸藥根堿（純度≥98%，批號分別為：0732-200005﹑110733-201007，中國食品藥品檢定研究院）。10批黃藤藥材分別采自各個產(chǎn)地，經(jīng)鑒定為防己科黃藤（Fibraurea recisa Pierre.）的干燥藤莖。10批藥材均在2014年購買于各當(dāng)?shù)氐乃幉氖袌?，其來源見?。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent 1220液相色譜儀（美國Agilent 公司）；ACE C18（4.6mm×250mm，5μm）色 譜 柱；進 樣量：10μL；柱溫：30℃；檢測波長：345nm；流動相：0.1%磷酸溶液（每100mL中加入0.1g十二烷基硫酸鈉）（A）-乙腈（B），流速：1.0mL/min，梯度 洗 脫：0～ 10min，80% ～ 75%A；10～ 20min，75% ～ 70%A；20 ～ 30min，70% ～ 60%A；30 ～ 50min，60% ～ 55%A；50 ～ 60min，55% ～ 45%A；60 ～ 75min，45% ～ 35%A；75 ～ 80min，35% ～ 30%A；80 ～ 85min，30% ～ 20%A；85 ～ 90min，20% ～ 10%A；90～ 100min，10% ～ 80%A。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取鹽酸巴馬汀﹑鹽酸藥根堿對照品適量，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為4.12mg/mL﹑1.02mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

稱取樣品粉末0.1g，精密稱定，置50mL容量瓶中，加入1%鹽酸甲醇約40mL，超聲提取30min，放冷，用1%鹽酸甲醇定容至刻度，濾過，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品（S10）溶液，按照上述色譜條件，連續(xù)進樣測定6次，計算色譜峰及相對保留時間RSD值，實驗結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取藥材樣品（S10），制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算色譜峰及相對保留時間的RSD值，結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品（S10）溶液，分別于 0，2，4，6，8，12h 按照上述色譜條件進行測定，結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 黃藤指紋圖譜的建立與評價

2.5.1 樣品測定 取10個不同產(chǎn)地黃藤藥材樣品，制備供試品溶液，按照上述色譜條件進樣測定。2.5.2 黃藤指紋圖譜的建立 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”對10批黃藤藥材HPLC圖譜進行結(jié)果分析，共確定12個共有峰，結(jié)合保留時間指認(rèn)了其中兩個色譜峰：峰6為藥根堿，峰8為巴馬汀。因巴馬汀的色譜峰峰面積較大，保留時間穩(wěn)定，故選擇其為對照峰（即S峰），對照圖譜見圖1。

圖1 黃藤藥材HPLC對照指紋圖譜（示共有峰）峰6：藥根堿 峰8：巴馬汀

2.5.3 黃藤藥材的指紋圖譜相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”對S1-S10號黃藤藥材指紋圖譜進行疊加，并以S10為對照標(biāo)準(zhǔn)，進行相似度評價。結(jié)果表明，10批黃藤藥材的相似度均在0.90以上，表明各個產(chǎn)地的黃藤均有較高的相似度，質(zhì)量較穩(wěn)定，只是在個別產(chǎn)地的黃藤上有細(xì)微差別。結(jié)果見圖2﹑表1。

圖2 不同產(chǎn)地黃藤藥材HPLC指紋圖譜

表1 10批黃藤藥材產(chǎn)地及相似度

3 黃藤中生物堿類化合物的含量測定

3.1 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2”項中混合對照品溶液0.1﹑0.2﹑0.5﹑1.0﹑2.0mL分別置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，按上述色譜條件測定，以各對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)﹑峰面積為縱坐標(biāo)，計算得線性方程，結(jié)果見表2，表明各對照品在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 對照品的線性方程

表3 黃藤藥材中鹽酸巴馬汀﹑鹽酸藥根堿的加樣回收試驗

3.2 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品（S10）溶液，分別于 0﹑2﹑4﹑6﹑8﹑12h按照上述色譜條件進行測定，結(jié)果鹽酸巴馬汀﹑鹽酸藥根堿的RSD分別為0.6%，1.1%。

3.3 精密度試驗

取同一供試品（S10）溶液，按照上述色譜條件連續(xù)進樣6次，結(jié)果鹽酸巴馬汀﹑鹽酸藥根堿含量的RSD分別為0.8%，1.0%。

3.4 重復(fù)性試驗

取供試品（S10）制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，結(jié)果鹽酸巴馬汀﹑鹽酸藥根堿的含量的RSD分別0.8%，1.3%。

3.5 加樣回收率試驗

取已知含量的同一批黃藤藥材（S2）6份各約0.1g，精密稱定，分別加入鹽酸巴馬汀﹑鹽酸藥根堿，制備供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，進行回收率考察，鹽酸巴馬汀﹑鹽酸藥根堿平均回收率結(jié)果見表3。

3.6 含量測定

分別取10批黃藤藥材粉末約0.1g，精密稱定，制備供試品溶液，按上述色譜條件分析，計算10批樣品中3種成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 10批黃藤藥材中鹽酸巴馬汀﹑鹽酸藥根堿的含量測定

4 討論

本實驗對黃藤藥材的提取溶劑進行考察，分別比較了甲醇﹑1%鹽酸甲醇和2%鹽酸甲醇﹑70%乙醇作為提取溶劑，以回流提取﹑超聲提取作為提取方法進行了考察，同時對提取的時間也進行考察，結(jié)果表明，以1%鹽酸甲醇超聲提取30min的樣品，色譜峰個數(shù)較多，峰面積較大，分離度能達到要求，故此作為提取方法[5-7]。

本試驗分別對乙腈-水﹑乙腈-磷酸溶液﹑甲醇-水及甲醇-磷酸溶液等流動相進行了考察，最終確定乙腈-0.1%磷酸溶液（每100mL中加入0.1g十二烷基硫酸鈉）為流動相的梯度洗脫系統(tǒng)。分別對ACE C18﹑DM C18進行了耐用性考察，從中選定了ACE C18（4.6mm×250mm，5μm），該色譜柱對黃藤藥材有較好的分離效果[8-11]。

指紋圖譜的建立，具有其每個峰具體為何種物質(zhì)尚不明確，卻能給出可靠而又充分的信息，對藥材的質(zhì)量進行控制的優(yōu)勢。本實驗通過對10批不同產(chǎn)地黃藤的指紋圖譜進行分析，各黃藤藥材指紋圖譜間具有較高的相似程度，相似度均在0.90以上，并標(biāo)定了12個共有峰，較好的反映了黃藤藥材的整體性和特異性。各色譜峰的保留時間匹配較好，說明黃藤化學(xué)成分類型較為一致，但各成分的含量差異較大。利用指紋圖譜相似度評價的差異，可控制藥材對成品的影響[12-15]。

本文利用HPLC法建立了黃藤藥材的指紋圖譜，同時測定黃藤中鹽酸巴馬汀﹑鹽酸藥根堿的含量，并進行了相似性分析，系統(tǒng)而又全面的反映了中藥黃藤有效成分信息，本試驗方法簡便﹑易行﹑可靠，為綜合評價黃藤藥材質(zhì)量提供了參考依據(jù)。同時，中藥指紋圖譜對于黃藤藥材及其方劑的生產(chǎn)和研發(fā)中也有著較為廣闊的應(yīng)用前景。

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Full-quantified hplc fingerprint for quality evaluation of fibraurea recisa pierre

WANG Xue ZHAO Yuwei NAN Minlun HE Yufang LV Na HE Zhongmei
1.College of Chinese Medicinal Herbs, Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China; 2.Academy of Chinese Medical Sciences of Jilin Province, Changchun 130012,China

Objective The experiment adopted Agilent 1220 HPLC to establish the fingerprint of Fibraurea recisa Pierre, and establish the way that simultaneously determined the content of palmatine hydrochloride and jatrorrhizine hydrochloride. Methods The analytical column was ACE C18(4.6mm×250mm,5μm).The mobile phase was acetonitrile-water(containing 0.1% phosphoric acid and 0.1% sodium dodecyl sulfate) with gradient elution,and the detection wavelength was set at 345nm.The flow rate was 1.0mL/min,and the column temperature was set at 30℃.Results The HPLC ration fingerprint of Fibraurea recisa Pierre was established.12 common peaks were defined among the 10 batches in the HPLC fingerprint, and the similarity is above 0.90. Conclusion The fingerprint of Fibraurea recisa Pierre that the method has strong features, repeatability and high sensitivity,which provides reference value for the identification and the quality control of Fibraurea recisa Pierre.

Fibraurea recisa Pierre; Full-quantified fingerprint; Palmatine hydrochloride; Jatrorrhizine hydrochloride

R927.2

A < class="emphasis_bold"> [文章編號]]

] 2095-0616（2017）21-40-04122211

▲通訊作者

2017-06-15）