劉元元，龐學(xué)兵，李 國(guó)，劉珊珊，余彬彬，王愛(ài)英

(石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832000)

棉花黃萎病素有“棉花癌癥”之稱[1]，在世界各植棉地區(qū)均有報(bào)道。作為土傳性真菌病害且具有寄主范圍廣、傳播途徑多、致病機(jī)理復(fù)雜、變異性強(qiáng)、防治難度大等特點(diǎn)，使黃萎病成為棉花主要病害之一[2-3]。隨著全球變暖趨勢(shì)的不斷加重，土壤上層溫度會(huì)不斷提高，勢(shì)必導(dǎo)致黃萎菌生活周期延長(zhǎng)，對(duì)全球作物的危害性也會(huì)不斷加重[4-5]。目前，棉花黃萎菌的防治主要有化學(xué)防治、輪耕倒茬、非化學(xué)農(nóng)藥熏蒸等方法，由于傳統(tǒng)輪耕倒方法的局限性及化學(xué)防治污染大等問(wèn)題，輪耕倒茬和化學(xué)防治逐漸被摒棄，生物防治因具低成本、污染性小、可持續(xù)發(fā)展等特點(diǎn)逐漸被人們所重視[6]。

生物防治多使用植物根際細(xì)菌和植物內(nèi)生細(xì)菌：內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量龐大，在與植物協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中形成多種互利共生關(guān)系，通過(guò)拮抗、競(jìng)爭(zhēng)、誘導(dǎo)植物抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)，起到抑制病原菌侵害的作用；根際細(xì)菌在植物根部形成微生物菌膜，搶占生態(tài)位使植物免受病原菌侵害。內(nèi)生細(xì)菌和根際細(xì)菌都具有定殖率高、對(duì)寄主植物危害小等特點(diǎn)適合做生物防治劑。目前，已有許多關(guān)于植物內(nèi)生細(xì)菌和根際細(xì)菌用于防治植物病蟲(chóng)害的報(bào)道。如Mazzola等[7]在根際土壤分離得到的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)SS10菌株對(duì)風(fēng)信子根腐病、瓜果腐霉病和辣椒疫霉病等有良好的防治效果，從柑橘中分離的萎蔫短小桿菌(Curtobacteriumflaccumfaciens)可以提高柑橘對(duì)葉緣焦枯病菌的拮抗作用[8]。其中，芽胞桿菌具有繁殖能力強(qiáng)、種群數(shù)量大、抗逆能力強(qiáng)、抑菌譜廣泛、能產(chǎn)生多種揮發(fā)性抗菌物質(zhì)等特點(diǎn)，成為良好的生物防治資源[9]。曹君等[10]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌BS菌株對(duì)棉花枯萎病的抑菌率在70%以上；李寶慶等[11]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌BAB-1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能夠抑制番茄灰霉菌的生長(zhǎng)；據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道，從一株芽孢桿菌分離得到多種揮發(fā)性物質(zhì)，它們能抑制核盤菌菌絲的生長(zhǎng)和菌核的生成；也有報(bào)道[13-14]稱，蘇云金芽胞桿菌和短小芽孢桿菌能產(chǎn)生多種對(duì)芒果炭疽病具有抑制作用的揮發(fā)性物質(zhì)。

芽孢桿菌揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)多種病原菌有拮抗作用，而對(duì)黃萎菌抑制的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究從棉花、玉米、向日葵根際分離植物根際細(xì)菌63株，苦豆子植株內(nèi)分離得到2株內(nèi)生細(xì)菌N2和N4，經(jīng)初篩、復(fù)篩及分子鑒定得到對(duì)黃萎菌具有強(qiáng)烈抑制作用的根際芽孢桿菌X4和內(nèi)生芽孢桿菌N4；通過(guò)對(duì)黃萎菌菌絲形態(tài)、孢子萌發(fā)、微菌核萌發(fā)及毒素分泌能力的抑制效果來(lái)綜合評(píng)價(jià)2株拮抗菌的生防能力；利用GC-MS分析發(fā)酵液中揮發(fā)性成分，并驗(yàn)證揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)黃萎菌抑制效果，為生物防治提供新的拮抗資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌株 棉花黃萎菌：石河子大學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離得到的大麗輪枝菌VD-278，生理型為非落葉型，培養(yǎng)類型為絲核型菌株。

棉花黃萎菌孢子液的制備參見(jiàn)文獻(xiàn)[15]。

拮抗菌：從棉花、玉米、向日葵根際土壤中分離得到63株細(xì)菌，從苦豆子植株內(nèi)部分離得到2株內(nèi)生菌N2和N4。

1.1.2培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、瓊脂20g、蒸餾水定容至1000mL，pH7.0。

PDA固體培養(yǎng)基：稱取洗凈去皮馬鈴薯200g切成1cm3小塊，加蒸餾水煮到玻璃棒戳破，立即用8層紗布過(guò)濾得到濾液，加蔗糖20g、瓊脂20g，蒸餾水定容至1000mL，pH7.0。

PDA液體培養(yǎng)基：稱取洗凈去皮馬鈴薯200g，蒸餾水煮10～20min,立即用8層紗布過(guò)濾得到濾液,加蔗糖20g，蒸餾水定容至1000mL，pH7.0。

1.2 研究方法

1.2.1 拮抗菌分離與篩選 準(zhǔn)確稱取植物根際土壤10 g，放入已裝有90 mL無(wú)菌水的錐形瓶中[16]，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)30 min，于超凈工作臺(tái)中吸取100 μL土壤菌懸液，加入900 μL無(wú)菌水，并依次稀釋至10-4、10-5和10-6,平板涂布法涂布在LB固體培養(yǎng)基上，分離得到植物根際單菌落，純化單菌株。

苦豆子植株用自來(lái)水清洗干凈，莖稈截成 2～3 cm小段，體積分?jǐn)?shù)φ=75%的酒精中浸泡消毒30 s,1 g/L的升汞溶液消毒8 min無(wú)菌水漂洗3～5次，用無(wú)菌研缽研磨成勻漿并稀釋成10-4、10-5和10-6，平板涂布法涂布在LB固體培養(yǎng)基上分離純化得到苦豆子內(nèi)生單菌株。

采用平板共培養(yǎng)法篩選拮抗菌，在棉花黃萎菌菌落邊緣用打孔器打取直徑為5 mm的菌餅，置于PDA平板正中央。在距中心菌餅4 cm的4個(gè)對(duì)角接種供試菌株，對(duì)照組僅接種棉花黃萎菌菌餅，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10 d，采用十字交叉法測(cè)量并計(jì)算抑菌率[17-18]，按照下式計(jì)算抑菌直徑和抑制率:

菌落直徑=測(cè)量菌落直徑-0.5

抑菌直徑=對(duì)照病原菌直徑-與拮抗菌對(duì)峙的病原菌直徑

抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-0.5)×100%

采用培養(yǎng)皿對(duì)扣法檢驗(yàn)拮抗菌揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌能力，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2 拮抗菌分子鑒定 CTAB法提取細(xì)菌總DNA，引物采用細(xì)菌鑒定通用引物。27f:5′-AGAGTTTGTCCTGGCTCAG-3′，1492r:5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′[19]，以細(xì)菌總DNA為模板擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè),目的條帶純化后送華大公司測(cè)序。序列提交到NCBI進(jìn)行BLAST，用軟件MEGA 5.05以鄰位法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化 分析。

1.2.3 拮抗菌對(duì)棉花黃萎菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)、微菌核萌發(fā)的影響 采用平板共培養(yǎng)法將棉花黃萎菌和拮抗菌N4和X4接種在PDA固體培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)10 d，挑取黃萎菌菌落邊緣靠近拮抗菌的菌絲，于顯微鏡下觀察菌絲生長(zhǎng)狀況。

將防治效果較好的生防菌株N4和X4進(jìn)行搖瓶發(fā)酵后過(guò)濾除菌，得到的發(fā)酵濾液與黃萎菌孢子懸液(2×103cfu/mL)按照體積比1∶1混合，置于25 ℃搖床振蕩培養(yǎng)24～48 h，待未被生防菌脅迫處理的黃萎菌孢子萌發(fā)率超過(guò)80%后，在40倍顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況[20]，以PDA液體培養(yǎng)液與孢子懸浮液的等體積混合液為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。

用無(wú)菌水沖洗生長(zhǎng)15 d左右的黃萎菌平板 5～7次，在微菌核致密處用5 mm打孔器打孔，將打下的菌餅轉(zhuǎn)移至無(wú)菌研缽中，研磨至勻漿，用移液器轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，47 ℃水浴5 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清，收集沉淀，即為微菌核，在PDA固體平板上分別加200 μL發(fā)酵72 h的X4及N4發(fā)酵濾液，用涂布器涂勻，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種20枚菌核，5 d后觀察微菌核的萌發(fā)情況，以添加等量的PDA液體為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.4 拮抗菌無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎菌毒素分泌的影響 將N4及X4的無(wú)菌發(fā)酵液各10 mL，分別在90 mL PDA液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)，以不加N4和X4的無(wú)菌發(fā)酵液的100 mL PDA培養(yǎng)基為CK，采用5 mm 孔徑的打孔器打取新鮮黃萎菌菌落邊緣菌絲，接種至上述兩種培養(yǎng)基中。180 r/min、25 ℃的搖床中培養(yǎng)7 d后，8層無(wú)菌紗布過(guò)濾去除菌體，用 0.45 μm濾膜過(guò)濾[21]，采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)濾液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度[22]，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.5 拮抗菌揮發(fā)性抑菌物質(zhì)GC-MS檢測(cè) 菌株X4和N4揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)采用乙酸乙酯萃取法[23]。

揮發(fā)性活性物質(zhì)用GC/MS聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。分析條件為：上樣提取液20～30 mL，柱溫50 ℃(保留2 min)，以5 ℃ /min升溫至280 ℃，保持2 min；氣化室溫度為250 ℃；載氣為高純He，載氣流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL；分流比為40∶1；離子源為EI源，離子溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度為150 ℃；電子能量為70 eV；發(fā)射電流34.6 mA；倍增器電壓2 047 V；接口溫度 280 ℃；溶劑延遲3 min；質(zhì)量為10～550 u[24]，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.6 純品抑菌效果檢測(cè) 將揮發(fā)性物質(zhì)純品試劑稀釋不同濃度，采用瓊脂擴(kuò)散法[25]檢測(cè)其抑菌效果，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的初篩

從棉花、玉米、向日葵根際及苦豆子植株內(nèi)分離出共65株菌，檢測(cè)對(duì)棉花黃萎菌具有拮抗活性的菌株共有15株，占供試菌株的27.80%，其中從棉花根際分離得到的菌株A3和H1對(duì)黃萎菌的抑制率分別為56.64%和55.94%。從向日葵根際分離得到的菌株X4對(duì)黃萎菌的抑制率為67.83%，從苦豆子植株內(nèi)分離得到的菌株N4對(duì)黃萎菌的抑制率為65.03%(表1)。

表1 拮抗菌株對(duì)棉花黃萎菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effects of the antagonistic strains on the growth of Verticillium dahliae

2.2 拮抗菌復(fù)篩

將初篩得到的抑菌率大于50% 的4株菌A3、H1、X4T和N4進(jìn)行復(fù)篩，4株菌經(jīng)發(fā)酵離心后用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，用發(fā)酵濾液對(duì)黃萎菌做抑菌試驗(yàn)。結(jié)果表明，菌株A3、X4和N4的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎菌孢子的萌發(fā)有抑制作用，菌株H1對(duì)黃萎菌孢子萌發(fā)沒(méi)有抑制作用。其中菌株X4和N4對(duì)黃萎菌孢子萌發(fā)抑制效果最強(qiáng)，抑菌圈分別達(dá)到3.37和3.77 cm(圖1)。

2.3 揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性測(cè)定

棉花黃萎菌和接種拮抗菌培養(yǎng)皿對(duì)扣共培養(yǎng)15 d，對(duì)照組黃萎菌菌落直徑為5.85 cm，經(jīng)拮抗菌X4及N4揮發(fā)性物質(zhì)處理的黃萎菌菌落直徑分別為3.35 cm與3.70 cm，抑制率分別為 42.74%與36.75%，而且黃萎菌菌落形態(tài)發(fā)生變化，經(jīng)處理后的黃萎菌基本不產(chǎn)微菌核，由絲核型轉(zhuǎn)變成菌絲型(圖2)。

2.4 拮抗菌分子鑒定

經(jīng)測(cè)序分析，菌株X4與N4的16S rDNA序列長(zhǎng)度分別為1 402 bp和 1 398 bp，分別將測(cè)序結(jié)果輸入NCBI 網(wǎng)站 GenBank中的16S rDNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線Blast，結(jié)果表明，菌株X4與莫哈韋芽胞桿菌Bacillusmojavensisstrain ifo 15718同源性最高，達(dá)99.5%；菌株N4與芽孢桿菌Bacillussp. KNUC8108同源性達(dá)99.8%。因此，鑒定菌株X4和N4均屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp.)(圖3)。

圖1 拮抗菌N4和X4對(duì)棉花黃萎菌的抑菌效果Fig.1 Inhibitory effects of the strain N4 and X4 on the growth of Verticillium dahliae

圖2 拮抗菌揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)黃萎菌菌落形態(tài)的影響Fig.2 The effects of volatile substances from antagonistic bacteria against Verticilliumd ahliaeoncolony morphology

圖3 拮抗菌 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetictree of 16S rDNA among antagonistic bacteria

2.5 拮抗菌對(duì)棉花黃萎菌菌絲、孢子以及微菌核萌發(fā)的影響

拮抗菌X4和N4分別于棉花黃萎菌平板共培養(yǎng)法共培養(yǎng)7 d，挑取黃萎菌菌絲鏡檢，發(fā)現(xiàn)黃萎菌菌絲均發(fā)生不同程度的畸變。經(jīng)拮抗菌X4抑制后的棉花黃萎菌菌絲變短且異常彎曲，經(jīng)拮抗菌N4抑制后的黃萎菌菌絲彭大且出現(xiàn)明顯的溶壁現(xiàn)象(圖4-A)。拮抗菌X4及N4無(wú)菌發(fā)酵液處理24 h后對(duì)黃萎菌孢子鏡檢，對(duì)照組黃萎菌孢子萌發(fā)率為88.00%，而經(jīng)拮抗菌X4和N4發(fā)酵濾液處理后黃萎菌孢子萌發(fā)率僅為14.60% 和14.00%。研究結(jié)果表明，拮抗菌X4和N4對(duì)黃萎菌孢子的萌發(fā)有強(qiáng)烈抑制作用，抑制率分別達(dá)83.41%和84.09%(圖4-B)。將黃萎菌微菌核接種到涂布有拮抗菌發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基上共培養(yǎng)5 d后，對(duì)照組黃萎菌微菌核萌發(fā)率為100%，經(jīng)拮抗菌X4和N4處理后黃萎菌微菌核不萌發(fā)，抑制率為100%(圖4-C)。

A.拮抗菌X4和N4無(wú)菌發(fā)酵液抑制黃萎菌菌絲鏡檢圖 The growth of hyphae morphology treated with the aseptic fermentation broth bacteria；B.拮抗菌X4和N4無(wú)菌發(fā)酵液抑制黃萎菌孢子萌發(fā)鏡檢圖 The germination of spore treated with the aseptic fermentation broth；C.拮抗菌X4和N4無(wú)菌發(fā)酵液抑制黃萎菌微菌核萌發(fā)效果圖 The germination of microsclerotium treated with the aseptic fermentation broth

圖4 拮抗菌X4和N4處理后黃萎菌菌絲、孢子及微菌核萌發(fā)情況
Fig.4 Effects of two antagonistic strain X4,N4 on hyphae morphology,spore
and microsclerotium germination ofVerticilliumwilt

2.6 拮抗菌對(duì)黃萎菌毒素分泌的影響

經(jīng)拮抗菌X4和N4無(wú)菌發(fā)酵液處理的黃萎菌產(chǎn)毒力蛋白的能力顯著降低，X4處理后黃萎菌產(chǎn)毒力蛋白僅為對(duì)照的4.53%，抑制率為 95.47%，N4處理后黃萎菌產(chǎn)毒力蛋白僅為對(duì)照的17.01%，抑制率為82.99%。說(shuō)明拮抗菌X4和N4對(duì)黃萎菌產(chǎn)毒力蛋白能力有顯著抑制作用(圖 5)。

2.7 GC-MS結(jié)果分析

通過(guò)GC-MS在菌株X4的無(wú)菌發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物中共檢測(cè)出16種揮發(fā)性物質(zhì)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的為醇類物質(zhì)，其中2,3-丁二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80.80%，3-己醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.31%；其次為有機(jī)酸，其中異丁酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.30%，3-甲基丁酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.49%，2-甲基乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) 4.09%，還包括一些脂類、烷類和酚類等物質(zhì)(表2)。

通過(guò)GC-MS在菌株N4的無(wú)菌發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物中共檢測(cè)出11種揮發(fā)性物質(zhì)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的為醇類物質(zhì)，其中2,3-丁二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.56%，1-乙氧基-2-丙醇為0.26%，2-庚醇為 0.14%；其次為有機(jī)酸，其中異丁酸為1.26%，3-甲基丁酸為0.42%，2-甲基丁酸為1.1%；還包括一些脂類等物質(zhì)(表3)。

2.8 揮發(fā)性純品物質(zhì)抑菌檢測(cè)

購(gòu)置揮發(fā)性物質(zhì)2，3-丁二醇、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸和異丁酸，分別將其稀釋5、50、150、500倍檢測(cè)對(duì)黃萎菌的抑制效果。

結(jié)果表明：2，3-丁二醇沒(méi)有抑菌活性，2-甲基丁酸、3-甲基丁酸和異丁酸對(duì)棉花黃萎菌有較強(qiáng)的抑菌活性，其中2-甲基丁酸對(duì)黃萎菌的抑制作用最強(qiáng)，在稀釋5倍后，其抑菌圈達(dá)7.4 cm，這3種物質(zhì)在稀釋500倍后基本對(duì)黃萎菌不產(chǎn)生抑制作用(圖6)。

柱形圖上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercase letters on the column chart indicate significant differences among different column(P<0.05)

圖5 拮抗菌對(duì)黃萎菌胞泌蛋白分泌的影響
Fig.5 The effects of antagonistic bacteria against theprotein secretion ofVerticiliumdahliae

表2 芽孢桿菌菌株X4揮發(fā)性物質(zhì)成分檢測(cè)分析Table 2 Analysis of volatile constituents from Bacillus strain X4

注：“-”表示該物質(zhì)已檢出，可以查詢到對(duì)應(yīng)的英文名稱，但因沒(méi)有相對(duì)應(yīng)的中文名，故用“-”代替。下表同。

Note:“-” means that the compound has been detected in the table, and the corresponding English name can be found, but because there is no corresponding Chinese name,“-” is used instead of the Chinese name.The same below.

表3 芽孢桿菌菌株N4揮發(fā)性物質(zhì)成分檢測(cè)分析Table 3 Analysis of volatile constituents from Bacillus strain N4

A、B、C分別為2-甲基丁酸稀釋5、50、150倍的抑菌效果 A, B, and C represent antibacterial effect of 2-methyl-butyric aciddiluted into 5,50 and 150 times respectively；D、E、F分別為3-甲基丁酸稀釋5、50、150倍的抑菌效果 D, E and F represent antibacterial effect of isovaleric aciddiluted into 5, 50 and 150 times respectively；G、H、I分別為異丁酸稀釋5、50、150倍的抑菌效果 G, H and I represent antibacterial effect of isobutyric aciddiluted into 5, 50 and 150 times respectively

圖6 揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌效果
Fig.6 Inhibitory effect of volatile reagents onVerticiliumdahliae

3 討 論

內(nèi)生拮抗芽孢桿菌的分離篩選是棉花黃萎病生物防治的重要來(lái)源之一，多從棉花根系內(nèi)和莖稈中分離得到[26-28]?？喽棺又仓陜?nèi)存在大量的內(nèi)生菌，芽孢桿菌最多且均對(duì)黃萎菌具有拮抗作用[29]。本研究中的菌株N4是從苦豆子植株內(nèi)分離得到，其拮抗性均優(yōu)于棉花植株根際微生物的拮抗芽孢桿菌?？喽棺觾?nèi)存在高拮抗性芽孢桿菌可能是拮抗黃萎病的原因之一。本試驗(yàn)篩選的高拮抗性根際拮抗菌X4是防治棉花黃萎病的重要微生物資源。

最近的研究表明，大多數(shù)拮抗菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)可能是對(duì)病原菌發(fā)揮抑制作用的主要原因，而非傳統(tǒng)認(rèn)為的非揮發(fā)性抑菌物質(zhì)[30]。研究發(fā)現(xiàn)大部分拮抗細(xì)菌可以產(chǎn)生多種揮發(fā)性物質(zhì)[31],部分揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌具有拮抗作用[32-33]。Rybakova等[34]認(rèn)為，拮抗菌代謝產(chǎn)生的這些揮發(fā)性抑菌物質(zhì)才是抑制病原菌的主要原因，其抑制機(jī)理是基于病原菌對(duì)拮抗菌產(chǎn)生的揮發(fā)性抑菌物質(zhì)的反應(yīng)，揮發(fā)性物質(zhì)可以作為一種化學(xué)信號(hào)分子作用于病原菌，導(dǎo)致病原菌細(xì)胞代謝紊亂死亡或者通過(guò)形成休眠體抵御來(lái)自拮抗菌的壓力。具有拮抗作用的揮發(fā)性物質(zhì)可以作為拮抗菌、寄主植物以及病原菌三者之間相互作用的重要信號(hào)分子，拮抗菌通過(guò)抑制病原菌生長(zhǎng)繁殖，直接或者間接增加寄主植物的生物量，增強(qiáng)植物的抗病性以及對(duì)非生物脅迫的耐受性[35]。

本研究通過(guò)培養(yǎng)皿對(duì)扣試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌X4和N4的分泌揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)黃萎菌也具有強(qiáng)烈的抑制作用，且導(dǎo)致黃萎菌的菌落形態(tài)產(chǎn)生變化，證明拮抗菌揮發(fā)性物質(zhì)也具有抑菌效果。據(jù)報(bào)道[36]，多粘類芽孢桿菌Sb-1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)2-壬酮、2-甲基-1-丁醇、十六烷醛對(duì)尖孢鐮刀菌具有拮抗作用；蠟狀芽胞桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性抗菌物質(zhì)AFVs可抑制綠色木霉的活性[37]；Candidaintermedia產(chǎn)生的揮發(fā)性抗菌物質(zhì)2-壬酮可抑制草莓采后灰霉病菌的活性[38]。拮抗菌X4和N4產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)GC-MS檢測(cè)分析，X4檢測(cè)到16揮發(fā)性物質(zhì)，N4檢測(cè)到11種揮發(fā)性物質(zhì)。2，3-丁二醇、3-甲基丁酸、異丁酸2株菌均可產(chǎn)生，2-甲基丁酸只有N4能產(chǎn)生，2，3-丁二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別占揮2株菌揮發(fā)性物質(zhì)的 83.27%和93.97%。揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌試驗(yàn)表明，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多的2，3-丁二醇沒(méi)有抑菌活性，2-甲基丁酸、3-甲基丁酸以及異丁酸屬于有機(jī)酸類具有刺鼻難聞的味道，對(duì)黃萎菌均有較強(qiáng)抑菌活性。這3種揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)黃萎菌具有抑制作用是首次發(fā)現(xiàn)，其抑菌作用可能是由PH導(dǎo)致或者揮發(fā)性物質(zhì)作為小的信號(hào)分子調(diào)節(jié)黃萎菌的生長(zhǎng)繁殖。研究表明，植物根際分離的菌株X4和苦豆子內(nèi)生菌N4都產(chǎn)生具有較強(qiáng)抑菌活性的2-甲基丁酸、3-甲基丁酸以及異丁酸等揮發(fā)性物質(zhì)，說(shuō)明2株菌都是棉花黃萎菌潛在的生防菌資源，可為生防菌劑的研發(fā)提供優(yōu)良菌種。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上可以從微生物代謝物中分離純化或人工化學(xué)合成這幾種抑菌物質(zhì)用于農(nóng)作物病蟲(chóng)害防治，為防治黃萎菌提供新的辦法。目前，關(guān)于這3種揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)黃萎菌的抑制效果尚未見(jiàn)報(bào)道，關(guān)于其抑菌機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。