陳 潔，劉一然

(1. 武漢職業(yè)技術(shù)學院生物工程學院，武漢 430074； 2. 湖北省中醫(yī)院針灸科，武漢 430061)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)屬于常見臨床慢性代謝疾病，其發(fā)病率占原發(fā)性糖尿病的90%，嚴重威脅身體健康[1]。磷脂酰肌醇激酶-3(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號通路在胰島素調(diào)控葡萄糖代謝中發(fā)揮重要的作用，與T2DM發(fā)病密切相關(guān)[2]。此外研究顯示機體組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運能力下降與胰島素抵抗發(fā)生有關(guān)[3]。姜黃素是從姜黃中提取的植物多酚，有抗氧化、消炎、抗腫瘤等作用，近期臨床研究顯示其能夠改善胰島素抵抗進而發(fā)揮降血糖作用[4]。姜黃素是否可通過PI3K/Akt信號通路調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運，目前研究較少。本研究制備T2DM大鼠，并給予姜黃素治療，以探究對PI3K/Akt信號通路以及葡萄糖轉(zhuǎn)運的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雌性大鼠90只，體重75～100 g，4周齡，由武漢職業(yè)技術(shù)學院生物工程學院動物飼養(yǎng)中心提供[SCXK(皖)2016-0003]，飼養(yǎng)于本院實驗動物中心屏障環(huán)境中[SYXK(皖)2016-0002]，室溫25℃，濕度50%，自由飲食飲水。所有實驗均按實驗動物中心規(guī)范操作進行，并得到管理委員會批準(IACUC批準號：IACUC-09-2016)。

1.2 主要試劑與儀器

姜黃素粉末購自美國Sigma公司；羅格列酮片(成都恒瑞制藥有限公司，批號：D14202003034)；鏈脲佐菌素、枸櫞酸-磷酸氫二鈉購自于Amresco 公司；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)、β-actin兔抗鼠單抗、GluT4熒光抗體均購自于英國Abcam生物公司；p-PI3K、胰島素受體底物2(insulin receptor substrate-2，Irs2)、p-Akt 兔抗鼠單抗購自于美國SantaCruz公司；羊抗鼠IgG二抗購自于上海容創(chuàng)生物科技有限公司；BCA試劑盒購自于上海經(jīng)科化學科技有限公司；RNA提取試劑盒購自于北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于美國Genecopoeia公司；CFX96 PCR儀購自于美國Bio-Rad公司；CX23熒光顯微鏡購自于奧林巴斯公司；GIS-500凝膠成像儀購自于Miulab公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 T2DM模型制備

75只大鼠造模，在正常喂養(yǎng)的基礎上給予高脂肪飲食(正常飼料66.5%、膽固醇2.5%，脫氧膽酸鈉1%，豬油30%)，喂養(yǎng)八周，于八周末禁食12 h后，腹腔注射30 mg/kg鏈脲佐菌素，72 h后斷尾取血，對空腹血糖(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)進行檢測，以FBG水平≥16.7 mmol/L評定模型大鼠制備成功[5]。剩余15只作為正常組，注射同體積枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液。在不影響實驗要求和結(jié)果基礎上，按照3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.3.2 大鼠一般情況觀察及體重測量

于造模前、造模期間、給藥期間、給藥2周、給藥8周對大鼠進食及飲水、體表情況、精神狀態(tài)等進行觀察，并于末次給藥后即刻、給藥后2周末、給藥后8周末測量并記錄大鼠體重。

1.3.3 動物分組、給藥

造模完成后，參照動物與人體表面積比等效劑量給藥[6]。將大鼠隨機分為6組，每組15只：正常組以及模型組給予同劑量的生理鹽水；姜黃素低、中、高劑量組分別給予姜黃素50、150、250 mg/kg；羅格列酮組給予羅格列酮為1.35 mg/kg。各組大鼠每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥8周。

1.3.4 血清采集與檢測

所有大鼠在最末次給藥后(給藥8周后)禁食12 h，采集尾靜脈取血1 mL，置于離心機3000 rpm離心10 min，分離血清后于-20℃保存，采用羅氏全血糖儀檢測FBG、酶聯(lián)免疫法檢測空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)，計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR)；全自動生化儀檢測甘油三酯(triglyceride，TG)、低/高密度脂蛋白膽固醇(low/high density lipoprotein cholesterol，LDC-C/HDL-C)、總膽固醇(total cholesterol，TC)。

1.3.5 正糖鉗實驗

血液標本采集后，各組隨機選取5只大鼠參照Keaegen法[7]進行正糖鉗實驗。起始灌注胰島素、10%葡萄糖速率為24 mU/kg/min，每10分鐘進行斷尾取血測定血糖濃度，根據(jù)所測值調(diào)整注射速率至平穩(wěn)，記錄穩(wěn)態(tài)下1 h內(nèi)葡萄糖灌注速度，重復測量6次。

1.3.6 脂肪組織采集

各組每組剩余大鼠選取5只大鼠麻醉處死，分離腹部大網(wǎng)膜獲取脂肪組織，置于4%多聚甲醛固定用于熒光檢測。

1.3.7 熒光免疫實驗檢測脂肪細胞GluT4移位情況

將剩余5只大鼠麻醉處死，分離腹部大網(wǎng)膜獲取脂肪組織，于-80℃凍存，用于組織檢測。取部分組織常規(guī)制備脂肪組織石蠟切片，采用熒光免疫實驗檢測脂肪細胞GluT4移位情況。

1.3.8 Real-time PCR檢測脂肪細胞中GluT4 mRNA表達

稱1.3.6部分組織，加40 mL TES緩沖液，剪碎后置于4℃下勻漿，置于冷凍離心機離心，用TRIzol法提取細胞膜總RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GADPH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCq算法進行計算脂肪細胞中 mRNA表達量。RT-PCR引物序列詳見表1。

1.3.9 Western blot檢測脂肪細胞內(nèi)、外膜中GluT4、p-PI3K、Irs2、p-Akt蛋白表達

稱1.3.6部分組織，加40 mL TES緩沖液，剪碎后置于4℃下勻漿，置于冷凍離心機離心收集上清液，下層為脂肪細胞外膜，加入1 mL TES溶液進行重懸。將上一步上清液在28 000 r/min離心15 min，保留上清液繼續(xù)離心75 min，沉淀即為脂肪細胞內(nèi)膜，加入1 mL TES溶液進行重懸，收集脂肪細胞膜。應用Western blot技術(shù)檢測脂肪細胞內(nèi)、外膜中GluT4、p-PI3K、PI3K、Irs2、p-Akt、Akt蛋白表達，采用Image-J軟件對各蛋白條帶進行量化分析。

表1 Real-time PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況以及體重變化

正常組大鼠造模前后精神狀態(tài)較好，進食正常，體表毛光澤，尿量正常；模型組大鼠體表毛暗沉粗糙，進食量、飲水量均較大，精神不佳，反應遲鈍；姜黃素治療組體表毛色與正常組相比暗沉粗糙，與模型組相比，精神狀態(tài)較好。與正常組相比，模型組給藥即刻、給藥2周體重升高，給藥8周體重下降；與模型組相比，給藥即刻、給藥2周、給藥8周姜黃素治療組、羅格列酮組體重均降低(P<0.05)。見表2。

2.2 各組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR測定結(jié)果

與正常組相比，模型組FBG、FINS、HOMA-IR均升高；與模型組相比，姜黃素治療組、羅格列酮組FBG、FINS、HOMA-IR均降低，呈劑量依賴效應(P<0.05)。見表3。

2.3 各組血脂水平測定結(jié)果

與正常組相比，模型組血清HDC-L、LDC-L、TC、TG水平均升高；與模型組相比，姜黃素治療組、羅格列酮組HDC-L、LDC-L、TC、TG水平降低(P<0.05)。見表4。

2.4 正糖鉗實驗結(jié)果

與正常組相比，模型組葡糖糖注射速率降低；與模型組相比，姜黃素治療組、羅格列酮組葡糖糖注射速率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

2.5 免疫熒光檢測GluT4移位情況

與正常組相比，模型組GluT4 聚集在細胞質(zhì)內(nèi)，姜黃素治療組、羅格列酮組細胞膜內(nèi)GluT4 逐漸向外聚集，分散在細胞膜外。詳見下圖1。

表2 各組大鼠造模后體重變化

注：與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05.

表3 各組大鼠造模后FBG、FINS、HOMA-IR變化

注：與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與姜黃素低劑量組相比，aP<0.05；與姜黃素中劑量組相比，bP<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05. Compared with the low dose curcumin group,aP<0.05. Compared with the medium dose curcumin group,bP<0.05.

表4 各組大鼠血脂水平測定結(jié)果比較

注：與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與姜黃素低劑量組相比，aP<0.05；與姜黃素中劑量組相比，bP<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05. Compared with the low dose curcumin group,aP<0.05. Compared with the medium dose curcumin group,bP<0.05.

注：A：正常組；B：模型組；C：姜黃素低劑量組；D：姜黃素中劑量組；E：姜黃素高劑量；F：羅格列酮組。圖1 脂肪細胞GluT4免疫熒光檢測結(jié)果(× 1000)Note. A, Normal group; B, Model group; C, Low dose curcumin group; D, Medium dose curcumin group; E, High dose curcumin group; F, Rosiglitazone group.Figure 1 Immunofluorescence analysis of GluT4 localization in adipocytes

表5 各組葡萄糖注射速率對比

注：與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與姜黃素低劑量組相比，aP<0.05；與姜黃素中劑量組相比，bP<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05. Compared with the low dose curcumin group,aP<0.05. Compared with the medium dose curcumin group,bP<0.05.

2.6 脂肪細胞GluT4 mRNA表達

與正常組相比，模型組細胞GluT4 mRNA表達降低；與模型組相比，姜黃素治療組、羅格列酮組細胞GluT4 mRNA表達升高，具有劑量依賴性(P<0.05)。見表6。

2.7 脂肪細胞內(nèi)、外膜GluT4、Irs2、p-PI3K/PI3K、pAkt/Akt表達

與正常組相比，模型組細胞內(nèi)外膜GluT4、Irs2、p-PI3K/PI3K、pAkt/Akt蛋白表達降低；與模型組相比，姜黃素治療組、羅格列酮組細胞內(nèi)外膜GluT4、Irs2、p-PI3K/PI3K、pAkt/Akt蛋白表達升高，具有劑量依賴性(P<0.05)。見圖2、3，表7、8。

表6 脂肪細胞GluT4 mRNA表達

注：與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與姜黃素低劑量組相比，aP<0.05；與姜黃素中劑量組相比，bP<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05. Compared with the low dose curcumin group,aP<0.05. Compared with the medium dose curcumin group,bP<0.05.

注：A：正常組；B：模型組；C：姜黃素低劑量組；D：姜黃素中劑量組；E：姜黃素高劑量；F：羅格列酮組。圖2 脂肪細胞外膜GluT4、Irs2、p-PI3K/PI3K、pAkt/Akt表達Note. A, Normal group; B, Model group; C, Low dose curcumin group; D, Medium dose curcumin group; E, High dose curcumin group; F, Rosiglitazone group.Figure 2 GluT4, Irs2, p-PI3K and p-Akt protein expressions on the outer membrane of adipocytes

表7 脂肪細胞外膜GluT4、Irs2、p-PI3K/PI3K、pAkt/Akt表達

注：與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與姜黃素低劑量組相比，aP<0.05；與姜黃素中劑量組相比，bP<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05. Compared with the low dose curcumin group,aP<0.05. Compared with the medium dose curcumin group,bP<0.05.

表8 脂肪細胞內(nèi)膜GluT4、Irs2、p-PI3K/PI3K、pAkt/Akt表達

注：與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與姜黃素低劑量組相比，aP<0.05；與姜黃素中劑量組相比，bP<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05. Compared with the low dose curcumin group,aP<0.05. Compared with the medium dose curcumin group,bP<0.05.

注：A：正常組；B：模型組；C：姜黃素低劑量組；D：姜黃素中劑量組；E：姜黃素高劑量；F：羅格列酮組。圖3 脂肪細胞內(nèi)膜GluT4、Irs2、p-PI3K/PI3K、pAkt/Akt表達Note. A, Normal group; B, Model group; C, Low dose curcumin group; D, Medium dose curcumin group; E, High dose curcumin group; F, Rosiglitazone group.Figure 3 GluT4, Irs2, p-PI3K and p-Akt protein expressions on the inner membrane of adipocytes

3 討論

本研究結(jié)果顯示，給藥2、8周模型組大鼠體重明顯增加，經(jīng)藥物治療后不同時間體重明顯低于模型組，表明姜黃素能夠控制T2DM大鼠體重，幫助消耗攝入高能量。血清檢測結(jié)果顯示模型組FBG、FINS、HOMA-IR、HDC-L、LDC-L、TC、TG水平，而經(jīng)過治療后以上指標水平均明顯降低，具有劑量依賴性，高劑量組效果與羅格列酮組相似，表明高劑量姜黃素能夠降低T2DM模型大鼠血糖、改善胰島素抵抗、血脂水平，與相關(guān)研究[8-9]結(jié)果相符，以上結(jié)果提示姜黃素在控制血糖以及改善胰島素方面效果較好。

正糖鉗實驗是分析胰島素敏感性常用方法，T2DM大鼠血漿中胰島素水平較高，抑制葡萄糖的生成，通過外源調(diào)控葡萄糖注射速率能夠保持血糖穩(wěn)態(tài)，因此試驗中葡萄糖的灌注速率可反映大鼠胰島素敏感性[10]。本研究顯示，與正常組相比，模型組葡糖糖注射速率降低；姜黃素治療組、羅格列酮組葡糖糖注射速率明顯升高，說明模型組大鼠胰島素敏感性降低，而給予姜黃素后能夠提高胰島素敏感性，高劑量組效果與羅格列酮組相似，進一步提示高劑量姜黃素能夠改善機體胰島素敏感性，與Panahi等[11]、張麗莉等[12]研究結(jié)果相符合。

GluT4正常情況下位于細胞內(nèi)囊泡膜上，少數(shù)位于細胞外膜。研究顯示當其受到胰島素或者其他生理刺激后GluT4轉(zhuǎn)移至細胞外膜，在與葡萄糖結(jié)合后將其轉(zhuǎn)運入細胞，因此當GlT4位于細胞外膜時，才能將葡萄轉(zhuǎn)運入細胞內(nèi)[13]。本研究免疫熒光檢測結(jié)果顯示，模型組GluT4聚集在細胞膜內(nèi)，經(jīng)處理后細胞膜內(nèi)GluT4逐漸向外聚集，說明給予姜黃素處理后能夠促進細胞膜內(nèi)GluT4與葡萄糖結(jié)合，進而促進葡萄糖轉(zhuǎn)運。Western blot結(jié)果顯示模型組脂肪細胞內(nèi)外膜GluT4水平均降低，給予姜黃素處理后細胞內(nèi)外膜GluT4水升高，進一步說明姜黃素可促進GluT4移位，促進葡萄糖轉(zhuǎn)運，改善機體IS。

PI3K為PI3K/Akt信號通路中的起始因子，在其他多種生長因子激活下促使胰島素與膜受體結(jié)合，使IRS發(fā)生磷酸化，隨后結(jié)合PI3K，激活PIK3，Akt磷酸化，激活后的Akt從細胞質(zhì)膜上釋放后轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)內(nèi)，誘導底物發(fā)生磷酸化，進而調(diào)節(jié)糖原合成[14]。本研究Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組細胞內(nèi)外膜Irs2、 p-PI3K/PI3K、 pAkt/Akt 蛋白表達明顯降低；姜黃素處理后細胞內(nèi)外膜Irs2、 p-PI3K/PI3K、pAkt/Akt 蛋白表達呈劑量升高，表明姜黃素可通過激活脂肪細胞PI3K/Akt信號通路蛋白表達，促進胰島素信號傳遞恢復進而干預IR，改善T2DM，推測這可能為姜黃素提高葡萄糖轉(zhuǎn)運的作用機制，提示姜黃素可能通過調(diào)控脂肪細胞PI3K/Akt信號促進葡萄糖轉(zhuǎn)運。

綜上所述，姜黃素能夠降低T2DM大鼠血糖、血脂、胰島素水平，呈劑量依賴性，且高劑量姜黃素作用效果與羅格列酮組作用相似，其作用機制可能與促進脂肪細胞膜GluT4轉(zhuǎn)位，激活PI3K/Akt信號通路有關(guān)，為姜黃素治療T2DM的分子機制研究提供一定的參考。