韓 瑩 蔡慶宇 張 巖

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.黑龍江省佳木斯市中醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002；3.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002）

自噬（Autophagy）是真核細(xì)胞內(nèi)獨(dú)有的自我保護(hù)機(jī)制，是細(xì)胞利用溶酶體降解大分子物質(zhì)和自身受損細(xì)胞器的一種高度保守的進(jìn)化過程［1]。自1963年比利時(shí)學(xué)者克里斯汀·德·迪夫首次提出 “自噬”的概念至今，細(xì)胞自噬的研究已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)最熱門的領(lǐng)域之一［2]。在自噬過程中，細(xì)胞質(zhì)的一部分被吞噬泡吞噬后形成雙膜結(jié)構(gòu)自噬體，再與溶酶體融合后形成自噬溶酶體，從而降解自噬體的內(nèi)容物。自噬降解后的產(chǎn)物可以作為細(xì)胞器和新蛋白質(zhì)的合成原料，在腸上皮細(xì)胞的損傷修復(fù)和維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)上面發(fā)揮著重要的作用［3]。

活性氧（ROS）是生物體內(nèi)一類活性含氧物質(zhì)和氧代謝產(chǎn)物的總稱，包括超氧陰離子（O2-）、羥基（OH-）和過氧化氫（H2O2）等［4]。 由 ROS 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)參與機(jī)體多個(gè)生理病理過程，是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、組織損傷、細(xì)胞凋亡的重要因素之一［5]。作為潰瘍性結(jié)腸炎（UC）病理過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)與UC急性期腸道黏膜中性粒細(xì)胞的活化和募集密切相關(guān)［6]。因此，本研究通過采用香連丸干預(yù)葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的急性UC模型，通過檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步明確兩者的內(nèi)在關(guān)聯(lián)及香連丸的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只無特異病原（SPF）級(jí)C57BL/6小鼠，體質(zhì)量（22±2）g，8周齡，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證批號(hào)：SCXK（黑）2015003。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)條件二級(jí)，恒溫恒濕，常規(guī)喂養(yǎng)。

1.2 試藥和儀器 1）試藥：美沙拉嗪緩釋顆粒（法國愛的發(fā)制藥集團(tuán)，國藥準(zhǔn)字：H20143164，500 mg/袋），配制成美沙拉嗪混懸液。香連丸（李時(shí)珍醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字：Z42020426，主要成分：萸黃連、木香，6 g/袋），藥物經(jīng)研磨后配制成香連丸混懸液；DSS購于上海翊圣生物科技有限公司；丙二醛（MDA）含量試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活力檢測(cè)分析試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測(cè)試劑盒購于南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠Beclin-1、LC3II、LC3I和p62單克隆抗體購于英國Viva Bioscience公司；兔抗大鼠β-actin、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG和高敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購于沈陽萬類生物科技公司。2）儀器：光學(xué)顯微鏡購于日本Olympus公司；電泳儀、電泳槽和凝膠成像分析系統(tǒng)均購于北京六一生物科技有限公司。

1.3 分組與造模 采用隨機(jī)數(shù)發(fā)生器，將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、美沙拉嗪組、香連丸低劑量組、香連丸中劑量組和香連丸高劑量組，每組10只。除空白組外，余下各組均參照文獻(xiàn)［7]中方法復(fù)制急性UC模型。具體方法如下：5%DSS溶液連續(xù)飲用7 d，改為蒸餾水連續(xù)飲用10 d，每隔1 d更換一次新鮮配制DSS溶液。空白組小鼠給予蒸餾水連續(xù)飲用15 d。

1.4 藥物干預(yù) 造模期間，根據(jù)人-小鼠體表面積比例換算。美沙拉嗪組給予美沙拉嗪混懸液20 mg/（kg·d）灌胃治療，香連丸用藥劑量參照文獻(xiàn)［8]中用量，低、中、高劑量組分別給予香連丸混懸液 1.6、3.2、6.4 g/（kg·d）灌胃治療，空白組和模型組則給予0.001 mL/kg的蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃給藥15 d。

1.5 標(biāo)本采集 各組小鼠于造模開始之日每日稱重，并觀察大便性狀及便血情況。于末次給藥結(jié)束后，禁食不禁水12 h，采用10%水合氯醛腹腔麻醉后，收集回盲部至肛緣的結(jié)腸組織，用于檢測(cè)。

1.6 觀察項(xiàng)目 1）疾病活動(dòng)指數(shù)：疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分參照文獻(xiàn)［9]，具體如下：根據(jù)體質(zhì)量的減少量（＜1%，1%～5%，5%～10%，10%～15%和＞15%）分別計(jì) 0、1、2、3、4 分，大便性狀（正常、軟便、便溏）和便血情況（潛血陰性、潛血陽性和肉眼血便）分別計(jì)0、2、4分，總分0～12分，分值越高，病情越重。2）結(jié)腸組織病學(xué)觀察：處死小鼠后取一部分結(jié)腸組織，10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色。并根據(jù)參考文獻(xiàn)［10]中標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)結(jié)腸組織進(jìn)行組織學(xué)損傷評(píng)分。該評(píng)分從潰瘍分級(jí)、病變深度、炎癥、纖維化和肉芽組織5個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分，總分0～10分，分值越高，病情越重。3）MDA的表達(dá)和SOD、GSH-px的活性檢測(cè)：取部分結(jié)腸組織，加抽提緩沖液，4℃電動(dòng)勻漿，15 000 r/min離心20 min，取上清液，采用生化法測(cè)定MDA的表達(dá)和SOD、GSH-px的活性。具體實(shí)驗(yàn)方法參照試劑盒說明書。4）Western blotting法檢測(cè)結(jié)腸組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)：取部分結(jié)腸組織，RIPA裂解，均漿，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉。 加入 Beclin-1（1∶1 000）、LC3II（1∶1 000）、LC3I（1∶1 000）、p62（1∶1 000）和 β-actin（1∶500）一抗，孵育過夜12 h。緩沖液洗滌，加入HRP標(biāo)記的二抗HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，洗滌，ECL發(fā)光，顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察（HE染色，200倍）

2.1 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 見圖1。正常組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)清晰，杯狀細(xì)胞豐富，腺體排列規(guī)整；模型組黏膜結(jié)構(gòu)紊亂，杯狀細(xì)胞減少，腺體破壞伴有大量炎性細(xì)胞的浸潤。各治療組小鼠結(jié)腸黏膜損傷較模型組均有不同程度的改善，杯狀細(xì)胞增加，腺體破壞減輕，炎性細(xì)胞減少，其中以香連丸高劑量組改善最佳。

2.2 各組小鼠DAI及組織學(xué)損傷評(píng)分比較 見表1。造模后，模型組小鼠DAI及組織學(xué)損傷評(píng)分顯著增高，與空白組比較差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；美沙拉嗪組及香連丸各劑量組小鼠DAI及組織學(xué)損傷評(píng)分均顯著降低，與模型組比較差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 各組小鼠DAI及組織學(xué)損傷評(píng)分的比較（分，±s）

表1 各組小鼠DAI及組織學(xué)損傷評(píng)分的比較（分，±s）

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同

組 別 n DAI 組織學(xué)損傷評(píng)分空白組 10 0.80±1.03 0.40±0.52模型組 10 9.20±1.69** 6.50±2.27**美沙拉嗪組 10 4.10±1.79△△ 3.00±2.21△△香連丸低劑量組 10 7.00±1.89△△ 4.20±2.20△△香連丸中劑量組 10 5.00±1.15△△ 3.80±1.32△△香連丸高劑量組 10 3.80±1.23△△ 1.50±1.08△△

2.3 各組小鼠結(jié)腸組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 見表2。造模后，模型組小鼠結(jié)腸組織中MDA的表達(dá)顯著增加，SOD及GSH-px的活性顯著降低，與空白組比較差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；美沙拉嗪組及香連丸各劑量組均能顯著減少結(jié)腸組織中MDA的表達(dá)，增加SOD及GSH-px的活性，與模型組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05和P＜0.01）。香連丸各劑量組中，以香連丸高劑量組療效最佳。

表2 各組結(jié)腸組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較（±s）

表2 各組結(jié)腸組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較（±s）

組 別 n MDA（mmol/mg）空白組 10 10.06±1.86模型組 10 38.74±6.86**美沙拉嗪組 10 19.93±4.24△△香連丸低劑量組 10 30.18±5.33△△香連丸中劑量組 10 26.62±3.28△△香連丸高劑量組 10 16.40±3.09△△SOD（U/mg） GSH-px（U/g）53.82±9.79 199.35±15.20 19.73±3.53** 125.69±8.35**41.28±5.03△△ 164.19±7.24△△24.83±3.80△ 137.18±9.45△29.93±4.68△△ 138.60±13.05△△43.06±5.67△△ 162.49±8.33△△

2.4 各組小鼠結(jié)腸組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的比較見表3，圖2。造模后，模型組小鼠結(jié)腸組織中Beclin-1、LC3Ⅱ、p62蛋白的表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3I的比值顯著降低，LC3Ⅰ蛋白的表達(dá)顯著增加，與空白組比較差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；美沙拉嗪組及香連丸各劑量組均能上調(diào)Beclin-1、LC3Ⅱ、p62蛋白的表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，下調(diào)LC3I蛋白的表達(dá)，與模型組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05和P＜0.01）。

表3 各組結(jié)腸組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的比較（±s）

表3 各組結(jié)腸組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的比較（±s）

組 別 n空白組 10模型組 10美沙拉嗪組 10香連丸低劑量組 10香連丸中劑量組 10香連丸高劑量組 10 Beclin-1/β-actin 1.00±0.10 0.27±0.07**0.75±0.14△△0.49±0.06△△0.66±0.09△△0.87±0.14△△LC3Ⅰ/β-actin LC3II/β-actin 0.82±0.14 1.15±0.27 1.62±0.37** 0.51±0.07**1.21±0.27△△ 1.86±0.36△△1.36±0.25△ 0.79±0.11△1.17±0.18△△ 1.01±0.22△△0.92±0.18△△ 3.42±0.72△△LC3Ⅱ/LC3Ⅰ p62/β-actin 1.41±0.34 0.95±0.18 0.28±0.07**0.40±0.10**1.55±0.58△△ 0.90±0.14△△0.58±0.16 0.57±0.08△△0.87±0.11△ 0.69±0.14△△3.77±1.24△△ 1.19±0.21△△

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 結(jié) 論

氧化應(yīng)激指體內(nèi)在受到各種有害刺激的情況下，抗氧化和氧化作用的失衡，活性氮簇和反應(yīng)性氧化物消除減少、生成過多，從而引起組織損傷的一個(gè)重要病理過程［11]。同時(shí)，作為炎癥反應(yīng)的一個(gè)病理過程，氧化應(yīng)激與炎性因子相互促進(jìn)，炎性能夠通過氧化作用使氧化應(yīng)激反應(yīng)擴(kuò)大化，而氧化應(yīng)激又能誘導(dǎo)炎性因子的大量釋放［12]。MDA作為組織氧化損傷的指示劑，是脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物，能夠引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和DNA的破壞、蛋白質(zhì)的交聯(lián)和變性［13]。SOD和GSH-Px作為重要的過氧化物分解酶，能夠有效地清除體內(nèi)的氧自由基，抑制腸道組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而起到保護(hù)結(jié)腸組織屏障的功能［14]。

研究證實(shí)，氧化應(yīng)激反應(yīng)和自噬之間存在著復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，活性氧能夠通過一系列途徑參與細(xì)胞自噬過程，并通過降解各種被氧化的蛋白以減輕氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷。Beclin-1是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，通過與PI3K形成復(fù)合體參與ATG蛋白在自噬前體中的定位，并通過促進(jìn)自噬小泡的成核和招募細(xì)胞溶質(zhì)中的蛋白調(diào)節(jié)自噬的活性。作為自噬體膜上的標(biāo)記蛋白，LC3通常以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。自噬體形成后，散在分布于細(xì)胞質(zhì)中的LC3Ⅰ通過偶聯(lián)磷酸酰乙醇胺形成LC3Ⅱ，并定位于自噬體的內(nèi)膜和外膜上，直至與溶酶體融合，因此LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在一定程度上反映了機(jī)體的自噬水平［15-18]。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)，香連丸能夠顯著改善由DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織形態(tài)，降低DAI及組織學(xué)損傷評(píng)分。同時(shí)香連丸通過減少結(jié)腸組織中MDA的表達(dá)，增加SOD及GSH-px的活性，增加組織抗氧化的能力，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的黏膜損傷。在自噬水平，我們發(fā)現(xiàn)伴隨著UC小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的增加，其自噬水平受到抑制，而香連丸各劑量均能上調(diào)Beclin-1、LC3Ⅱ、p62蛋白的表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，下調(diào)LC3Ⅰ蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，從而減輕組織損傷。

綜上所述，我們認(rèn)為香連丸在治療UC方面具有顯著的療效，能夠顯著改善結(jié)腸組織損傷，其作用機(jī)制可能是通過降低氧化應(yīng)激反應(yīng)和促進(jìn)細(xì)胞自噬實(shí)現(xiàn)的。