吳程程 婁成龍 韓淑萍

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 310006；2.浙江省杭州市紅十字會醫(yī)院，浙江 杭州310003）

百草枯（PQ）為速效觸滅型的除草劑，其常見商品名是克蕪蹤，對牲畜和人類有較強(qiáng)毒性。PQ中毒后，可迅速分布于人體的各大組織器官，尤以肺組織濃度最高，可在肺內(nèi)蓄積，可通過多胺攝取途徑導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)的發(fā)生。PQ引起的肺損傷主要出現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞的損害及炎性細(xì)胞的浸潤，導(dǎo)致肺組織的炎癥、水腫，最終可誘發(fā)肺纖維化的發(fā)生，危及患者生命。目前，對于PQ所致的肺損傷暫無有效解毒劑，主要以預(yù)防性減輕肺損傷程度為主。關(guān)于PQ中毒所致的肺損傷的致病機(jī)理尚不完全明確。相關(guān)研究顯示，絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）路徑為細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號的主要通路，很多刺細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖、分化及凋亡等生物學(xué)反應(yīng)都需要此通路傳導(dǎo)，而MAPK內(nèi)主要成員為p38 MAPK，可調(diào)控肺損傷中炎性反應(yīng)與細(xì)胞凋亡，并調(diào)節(jié)內(nèi)皮通透性［1-2]。 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（NF-κB）為多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)與炎性介質(zhì)表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子，涉及機(jī)體內(nèi)細(xì)胞凋亡與分化、應(yīng)激及組織損傷等過程中信息傳遞［2-3]。血必凈注射液為在血府逐瘀湯基礎(chǔ)上，經(jīng)過反復(fù)篩選精煉所提取靜脈制劑，有研究顯示對臨床PQ中毒患者有一定療效，但其對PQ所致肺損傷的療效及機(jī)制研究報(bào)道較少［4]。因此，本研究成功復(fù)制PQ中毒大鼠急性肺損傷模型，觀察血必凈注射液通過調(diào)控p38 MAPK/NF-κB通路對PQ中毒大鼠急性肺損傷保護(hù)影響，為臨床患者診療提供一些實(shí)驗(yàn)室依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF級Wistar雄性大鼠75只，8周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，許可證號SCXK（京）2018-21，體質(zhì)量（208.71±5.62） g。 常規(guī)飼養(yǎng) 1 周后開始實(shí)驗(yàn)，大鼠分籠飼養(yǎng)，每個(gè)籠內(nèi)5只，室溫維持在22～26℃，相對濕度在55%～65%間，晝夜循環(huán)，保持12 h光照，大鼠灌胃、添加飼料及換水等都有專人進(jìn)行［3]。本文研究經(jīng)本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試藥與儀器

體積分?jǐn)?shù)20%PQ溶液 （購自青島瀚生生物公司，加入0.9%氯化鈉注射液稀釋至25 mg/mL），血必凈注射液（10 mL/支，購自天津紅日藥業(yè)公司）。 Trizol（購自美國Invitrogen公司，生產(chǎn)批號50473208），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、髓過氧化物酶（MPO）、超氧化物歧化酶 （SOD）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）及IL-1β（購自南京建成生物研究所）。 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（型號DHG-9023A）、離心機(jī)（型號TGL-168）均由美國KIMBLE公司生產(chǎn)，PCR擴(kuò)增儀（型號PE9600，由美國PE公司生產(chǎn)），病理組織漂烘儀（型號PHY-Ⅲ，由常州中威電子儀器廠生產(chǎn)），轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（型號萊卡-2016，由德國萊卡公司生產(chǎn)），包埋機(jī)（型號BMJ-Ⅲ，由常州中威電子儀器廠生產(chǎn)），全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)（型號TSJ-Ⅱ，由常州中威電子儀器廠生產(chǎn)）。

1.3 分組與造模

隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成5組，模型組、正常組及血必凈低、中、高劑量組，每組各15只。除正常組外，其他各組大鼠一次性灌胃劑量為25 mg/kg的PQ溶液染毒。染毒2 h［4]后血必凈低、中、高劑量組大鼠分別經(jīng)尾巴靜脈注射含生藥0.43、0.86、1.72 g/kg的血必凈注射液2 mL，模型組和正常組大鼠注射等劑量0.9%氯化鈉注射液［5]，每日 1 次，連續(xù)注射 3 d。

1.4 標(biāo)本采集與檢測

給藥1 d后各組隨機(jī)選取5只大鼠，腹腔注射劑量為0.8 mL/100 g的2.4%水合氯醛麻醉，斷頸處死，取股動(dòng)脈血清，分離后保存在-70℃冰箱內(nèi)待測。給藥3 d后將剩余10只大鼠斷頸處死，取股動(dòng)脈血清和肺組織，血清分離后和肺組織均保存在-70℃冰箱內(nèi)待測。

1.4.1 檢測大鼠肺濕/干重比例 觀察大鼠飲食、活動(dòng)及呼吸等一般狀況，取大鼠右肺上葉對其濕重進(jìn)行精確稱量，而后在80℃的烤箱內(nèi)烘烤至恒重，稱量后確定其肺濕/干重比例。

1.4.2 大鼠肝臟組織病理學(xué)觀察 取大鼠肝臟組織，緩沖液沖洗，10%甲醛固定，酒精梯度脫水、透明，石蠟包埋后切片，厚度為4 m，常規(guī)行HE染色，在光鏡下觀察各組大鼠肺組織病理狀況。

1.4.3 檢測血清氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎性因子 生化法檢測血清 GSH-PX、SOD、MPO、MDA 活性，ELISA 法檢測血清IGF-1、TNF-α、IL-1β及IL-6含量，具體步驟依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.4 免疫組化檢測各組大鼠肺組織內(nèi)Bax、Bcl-2表達(dá)狀況 石蠟切片脫蠟后將內(nèi)源性過氧化物酶滅活，熱修復(fù)暴露抗原位點(diǎn)，置入孵育盒內(nèi)，PBS溶液沖洗3次，每次3 min，加入山羊血清，孵育10 min，在加入一抗兔多克隆抗體，在4℃下過夜。PBS溶液沖洗3次，每次3 min，滴入二抗在室溫下孵育10 min，PBS溶液沖洗3次，每次3 min，在滴入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，采用DAB顯色，中性樹膠封片。棕黃色為染色陽性，使用Image-Pro Plus6.0圖片分析檢測檢測圖像光密度。

1.4.5 Real time-PCR檢測各組大鼠肺組織內(nèi)NF-κB及IκB mRNA相對表達(dá)量 Trizol法提取大鼠肺組織細(xì)胞總RNA行 RT-PCR擴(kuò)增，NF-κB上游引物5′-CATTGAGAAGATCTTGGAG-3′， 下游引物 5′-CTATGTTCAGTACAT GATTG-3′， 擴(kuò)增片段是 482 bp；IκB上游引物 5′-GCTCCAGGAATTCCTCGGTA-3′，下游引物 5′-GAGT CCTGCATGCTAGCTAG-3′。 擴(kuò)增片段為389 bp；內(nèi)參 GAPDH 上游引物 5′-CTTGATCGTACGTAGCCTGA-3′， 下游引物 5′-GTGTAGTGTACTGTCATGCA-3′，擴(kuò)增片段 482 bp。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃下45 s，55℃下50 s，72℃下 75 s， 在 40次循環(huán)以后獲取 NF-κB 及 IκB mRNA 循環(huán)閾值（Ct），ΔΔCt（ΔΔCt=Ct目的基因-ΔCt內(nèi)參基因）分析，算出 2-ΔΔCt目的基因相對表達(dá)量。

1.4.6 Western blotting檢測肺組織p38-MAPK蛋白表達(dá) 選取肺組織組織研磨，經(jīng)過組織裂解后上樣電泳，起始電壓80 V，溴酚藍(lán)染料前緣進(jìn)入到分離膠上緣后電壓提升到100 V，溴酚藍(lán)泳出分離膠下緣后電泳結(jié)束。半干電轉(zhuǎn)移儀于PVDF膜內(nèi)行蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移，恒流為30 mA，連續(xù)90 min。PVDF膜取出后采用5%TBST脫脂奶粉封閉，震蕩60 min。結(jié)束封閉后采用TNS-T漂洗液洗膜10 min，3次，把膜轉(zhuǎn)移到雜交袋內(nèi)，加入適量漂洗液稀釋抗體，封口后在4℃下孵育過夜；TBST漂洗液洗膜10 min，3次，在加入漂洗液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，震蕩60 min。PVDF膜放置在ECL顯色液內(nèi)震蕩溫育5 min，暗室下曝光、顯影及定影。清水沖洗以后，晾干掃描，Image J軟件對掃描圖像目的條帶行灰度分析。內(nèi)參蛋白為β-actin校準(zhǔn)，各組蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值間比值為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀況及肺組織肺濕/干質(zhì)量比較

見表1。正常組大鼠飲食及活動(dòng)正常，毛色有光澤，沒有發(fā)生呼吸急促或者呼吸困難；模型組大鼠飲水和飲食量降低，毛色發(fā)暗，易煩躁，活動(dòng)量下降，發(fā)生呼吸困難或者呼吸急促狀況，口、鼻周邊有血性分泌物，出現(xiàn)瀕死狀或者全身衰竭，血必凈低劑量組大鼠和模型組近似；血必凈中、高劑量組大鼠毛發(fā)較模型組有光澤，食量、活動(dòng)量增大，呼吸急促或者呼吸困難等癥狀明顯好轉(zhuǎn)。和正常組相比，模型組大鼠肺濕/干質(zhì)量比例上升，和模型組相比，血必凈中、高劑量組比例下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠肺組織肺濕/干質(zhì)量比較（±s）

表1 各組大鼠肺組織肺濕/干質(zhì)量比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n正常組 15模型組 15血必凈低劑量組 15肺濕/干質(zhì)量（g/g）3.28±0.10 4.89±0.12*4.85±0.09血必凈中劑量組 15 4.39±0.10△血必凈高劑量組 15 4.37±0.08△

2.2 各組大鼠肺組織病理觀察

見圖1。正常組大鼠肝小葉及肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞飽滿，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)無異常，沒有出血壞死、水腫及炎癥滲出等狀況；模型組大鼠肺泡內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，毛細(xì)血管充血，肺泡腔內(nèi)滲出蛋白水腫液，有大量炎性細(xì)胞浸潤，血必凈低劑量組和模型組近似；血必凈中、高劑量組大鼠肺組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤減輕，肝小葉和肝組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)正常。

圖1 各組大鼠肺組織病理比較（HE染色，100倍）

2.3 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

見表2。給藥后1、3 d，和正常組相比，模型組大鼠血清GSH-PX、SOD含量下降，MPO、MDA含量上升；和模型組相比，血必凈中、高劑量組大鼠血清GSHPX、SOD含量上升，MPO、MDA含量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）

表2 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）

GSH-PX（U/mL） MPO（U/mL） SOD（U/mL） MDA（nmol/L）106.05±5.92 30.15±4.19 310.64±15.19 3.02±0.29 105.68±5.34 30.31±4.22 312.54±14.36 3.05±0.30 35.21±5.30* 291.05±4.60*216.38±15.09* 5.03±0.35*（n＝15） 給藥 3 d 41.17±5.23* 275.81±4.39*231.57±14.28* 4.71±0.34*血必凈低劑量組 給藥 1 d 38.91±5.23 283.35±4.80 220.47±15.31 5.04±0.36（n＝15） 給藥 3 d 43.60±5.44 269.17±4.68 233.60±15.25 4.67±0.32血必凈中劑量組 給藥 1 d 76.94±5.11△ 221.49±4.13△ 281.67±15.22△ 4.10±0.32△（n＝15） 給藥 3 d 88.52±5.19△ 204.35±4.29△ 291.36±15.64△ 3.98±0.31△血必凈高劑量組 給藥 1 d 79.05±5.32△ 218.65±4.36△ 185.93±15.67△ 4.05±0.30△（n＝15） 給藥 3 d 89.67±5.17△ 202.61±4.15△ 293.14±14.90△ 3.95±0.28△組 別 時(shí)間正常組 給藥1 d（n＝15） 給藥 3 d模型組 給藥1 d

2.4 各組大鼠血清炎性因子含量比較

見表3。給藥后1、3 d，和正常組相比，模型組大鼠血清IGF-1、TNF-α、IL-1β及IL-6含量上升；和模型組相比，血必凈中、高劑量組大鼠血清IGF-1、TNF-α、IL-1β及IL-6含量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠肺組織內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較

見表4。和正常組相比，模型組大鼠肺組織內(nèi)Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)上升；和模型組相比，血必凈中、高劑量組大鼠肺組織內(nèi)Bax蛋白表達(dá)下降，Bcl-2蛋白表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清炎性因子含量比較（±s）

表3 各組大鼠血清炎性因子含量比較（±s）

IGF-1（mg/L） TNF-α（ng/L） IL-1β（ng/L） IL-6（pg/mL）15.04±4.13 31.25±4.71 10.34±3.80 21.86±4.28 15.34±4.07 31.86±4.69 10.14±3.65 22.23±4.17 55.67±4.38* 148.50±4.92* 63.15±3.50* 201.53±4.27*（n＝15） 給藥 3 d 46.92±4.18* 122.58±4.31* 49.02±3.81* 160.58±4.82*血必凈低劑量組 給藥1 d 53.92±4.50 145.33±4.60 60.34±3.25 198.52±4.60（n＝15） 給藥 3 d 45.25±4.33 120.47±4.26 47.52±3.77 156.29±4.43血必凈中劑量組 給藥 1 d 31.61±4.85△ 100.36±4.80△ 45.28±3.39△ 145.28±4.73△（n＝15） 給藥 3 d 22.17±4.50△ 89.54±4.42△ 37.91±3.25△ 125.84±4.69△血必凈高劑量組 給藥 1 d 28.51±4.23△ 96.31±4.29△ 42.10±3.82△ 141.92±4.51△（n＝15） 給藥 3 d 21.94±4.28△ 86.53±4.69△ 35.64±3.42△ 123.41±4.70△組 別 時(shí)間正常組 給藥1 d（n＝15） 給藥 3 d模型組 給藥1 d

表4 各組大鼠肺組織內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠肺組織內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（±s）

組 別 n正常組 15模型組 15 Bax蛋白 Bcl-2蛋白0.58±0.22 0.52±0.18 5.42±0.26* 3.67±0.20*血必凈低劑量組 15 5.31±0.24 3.70±0.21血必凈中劑量組 15 3.18±0.27△ 5.06±0.26△血必凈高劑量組 15 3.14±0.25△ 5.10±0.24△

2.6 各組大鼠肺組織內(nèi)NF-κB及IκB mRNA相對表達(dá)量及p38 MAPK蛋白表達(dá)比較

見表5，圖2～圖3。和正常組相比，模型組大鼠NF-κB mRNA、p38 MAPK 蛋白表達(dá)上升，IκB mRNA 表達(dá)下降；和模型組相比，血必凈中、高劑量組大鼠NF-κB mRNA、p38 MAPK 蛋白表達(dá)下降，IκB mRNA 表達(dá)上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表5 各組大鼠肺組織內(nèi)NF-κB及IκB mRNA相對表達(dá)量及p38 MAPK 蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組大鼠肺組織內(nèi)NF-κB及IκB mRNA相對表達(dá)量及p38 MAPK 蛋白表達(dá)比較（±s）

組 別 n正常組 15模型組 15 NF-κB mRNA 0.24±0.03 0.42±0.04*血必凈低劑量組 15 0.39±0.04血必凈中劑量組 15 0.29±0.03△血必凈高劑量組 15 0.28±0.03△IκB mRNA p38 MAPK 蛋白1.18±0.09 0.38±0.06 0.65±0.06* 0.97±0.09*0.67±0.07 0.93±0.08 0.94±0.08△ 0.50±0.07△0.96±0.08△ 0.49±0.06△

圖2 Real time-PCR檢測各組大鼠肺組織內(nèi)NF-κB及IκB mRNA相對表達(dá)量

圖3 Western blotting檢測各組大鼠肺組織p38 MAPK蛋白表達(dá)

3 討 論

目前關(guān)于PQ中毒相關(guān)機(jī)制研究還未全部明確，但對機(jī)體肺損傷多數(shù)研究認(rèn)為和氧化應(yīng)激反應(yīng)及氧自由基等有聯(lián)系。PQ進(jìn)入到肺組織以后，被還原型輔酶Ⅱ內(nèi)單電子還原成自由基，氧分子和其結(jié)合后產(chǎn)生許多超氧陰離子，并在SOD影響下產(chǎn)生過氧化氫，進(jìn)而產(chǎn)生羥自由基，其毒性更高會導(dǎo)致出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，自由基數(shù)量增大，對細(xì)胞的功能與結(jié)構(gòu)造成損壞［5-6]。GSH-PX和SOD則為機(jī)體內(nèi)主要自由基清除劑，MDA則為氧自由基代謝內(nèi)所形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，對機(jī)體內(nèi)GSH-PX、MDA、MPO及SOD檢測可反映其脂質(zhì)過氧化損傷和自由基清除功能。

機(jī)體肺受損時(shí)，肺巨噬細(xì)胞來源細(xì)胞因子包含TNF-α、IL-1β等，它們不但可使炎癥細(xì)胞發(fā)生浸潤，還可加速釋放炎癥遞質(zhì)，從而使機(jī)體產(chǎn)生復(fù)雜細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，加速肺受損。其中IL-1β和TNF-α的生物學(xué)活性比較相近，對中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可起到黏附與趨化影響，使血管通透性加強(qiáng)［7-8]。相關(guān)研究顯示，肺內(nèi)IGF-1在肺纖維化產(chǎn)生中其含量會升高，肺纖維化產(chǎn)生與進(jìn)展和IGF-1聯(lián)系緊密［9]。本研究顯示，和模型組相比，血必凈中、高劑量組大鼠血清IGF-1、TNF-α、IL-1β及IL-6含量下降，說明血必凈注射液可有效降低PQ中毒大鼠血清內(nèi)炎性因子含量，減輕肺受損程度。

PQ中毒造成急性肺損傷中一個(gè)重要過程為細(xì)胞凋亡，PQ可將Bcl-2家族內(nèi)細(xì)胞色素C釋放激活從而出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，其中Bax是促凋亡蛋白，而Bcl-2是抗凋亡調(diào)節(jié)蛋白，兩者共同構(gòu)成了機(jī)體凋亡調(diào)控系統(tǒng)［10-15]。本文研究顯示，和模型組相比，血必凈中、高劑量組大鼠肺組織內(nèi)Bax蛋白表達(dá)下降，Bcl-2蛋白表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明血必凈經(jīng)過降低促凋亡蛋白表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白表達(dá)來對肺組織起到保護(hù)作用。

p38 MAPK對機(jī)體炎癥反應(yīng)和正常免疫有重要影響，參加中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等功能性反應(yīng)，包含顆粒胞外凋亡、黏附、分泌、趨化現(xiàn)象，同時(shí)可對生成的微量干擾素進(jìn)行調(diào)節(jié)以調(diào)控T細(xì)胞分化、凋亡。PQ中毒后肺組織內(nèi)p38 MAPK被激活，參加炎癥反應(yīng)與細(xì)胞應(yīng)激、凋亡等，多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄都受p38 MAPK調(diào)控。NF-κB為調(diào)控炎癥關(guān)鍵環(huán)節(jié)，有啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，表達(dá)黏附分子、介導(dǎo)單核細(xì)胞形成細(xì)胞因子等多種生物效應(yīng)。NF-κB可加速釋放IL-1、細(xì)胞間的黏附分子-1、纖溶酶原激活物抑制物-1等炎癥介質(zhì)，激活單核細(xì)胞，從而促進(jìn)TNF-α等釋放來使炎癥反應(yīng)加劇。本文研究顯示，和模型組相比，血必凈中、高劑量組大鼠NF-κB mRNA、p38 MAPK 蛋白表達(dá)下降，IκB mRNA表達(dá)上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明血必凈注射液經(jīng)過調(diào)控p38 MAPK/NF-κB通路來降低機(jī)體炎癥反應(yīng)程度，從而對受損肺組織起到保護(hù)作用。

綜上所述，血必凈注射液通過調(diào)控p38 MAPK/NF-κB通路，降低PQ中毒大鼠炎癥反應(yīng)程度，對受損肺組織起到保護(hù)作用。