李鑫峰 楊建飛 王 倩 周亞濱△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150040；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬鹽城市中醫(yī)院，江蘇 鹽城 224000）

急性冠脈綜合征（ACS）是以冠狀動脈內(nèi)粥樣斑塊破裂，繼而誘導(dǎo)不完全或完全閉塞性血栓形成，從而引起一系列的急性、重癥心肌缺血綜合征［1]。易損斑塊是指有破裂傾向的不穩(wěn)定性斑塊，其作為ACS的重要危險因素之一，早期有效干預(yù)能夠減少心血管事件的發(fā)生、降低臨床死亡率。斑塊內(nèi)纖維帽是血液和脂質(zhì)成分的血液屏障，其完整性和厚度決定著粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性，而膠原纖維作為纖維帽的主要成分之一，其含量直接影響著纖維帽的狀態(tài)［2]。因此，調(diào)控膠原代謝能夠有效維持斑塊的穩(wěn)定性。基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是MMPs家族的一員，作為細胞外基質(zhì)降解過程中重要的蛋白水解酶，能夠分解纖維帽中的膠原纖維，削弱纖維帽，從而降低斑塊的穩(wěn)定性［3]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蘇木乙酸乙酯提取液（SAEE）能夠改善動脈粥樣硬化大鼠腹主動脈的組織形態(tài)和內(nèi)皮細胞功能，并且降低MMP-9的含量，從而起到抗動脈粥樣硬化的作用［4]。此外，SAEE還具有顯著的抗炎作用，能夠降低動脈粥樣硬化大鼠血清超敏C反應(yīng)蛋白的表達，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用［5]。因此，本研究以ApoE-/-小鼠為模型，通過觀察炎性因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1-c-Jun氨基端激酶（ASK1-JNK）信號通路中關(guān)鍵蛋白及下游Ⅰ型膠原（COL-Ⅰ）及Ⅲ型膠原（COL-Ⅲ）膠原的表達，進一步明確SAEE抗動脈粥樣硬化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50只雄性ApoE-/-小鼠（品系C57B/6J），10周齡，體質(zhì)量18～21 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（黑）2015003。飼養(yǎng)條件：二級，室溫21～24℃，濕度46%～51%，自由飲水，光照時間 7∶00～19∶00，整個實驗過程符合《實驗動物管理和使用指南》［6]中的有關(guān)規(guī)定。

1.2 試劑與儀器

1）試劑：總膽固醇（TC）、甘油三酯（TAG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、TNF-α 試劑盒 （南京建成生物工程研究所）；一抗：兔抗大鼠TNF-α、p-ASK1 （Thr 845）、ASK1、p-JNK （T 183）、JNK、P4H、COL-I及 COL-Ⅲ和 β-actin 單克隆抗體（萬類生物科技有限公司），二抗：HRP標記的山羊抗兔IGG抗體（碧云天生物科技有限公司）。2）儀器：酶標儀 （美國BIO-RAD公司），DYCZ-24K電泳儀、DYCZ-24EN電泳槽 （北京六一生物科技公司）；Tanon 2500全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能公司）。

1.3 藥物制備

將蘇木生藥制成40目的粗粉，乙醇經(jīng)浸泡、加熱、回流、過濾，合并后的濾液水浴蒸干，制成乙醇提取干粉。雙蒸水混懸乙醇提取干粉，經(jīng)乙酸乙酯萃取，所得溶液為乙酸乙酯提取物。

1.4 分組與造模

ApoE-/-小鼠隨機分為空白對照組、模型組、SAEE低劑量組、SAEE中劑量組和SAEE高劑量組，每組10只?？瞻讓φ战M給予普通飼料喂養(yǎng)，其余4組給予高脂飼料喂養(yǎng) （83.5%普通飼料，8%牛油，7.5%蛋黃粉，1%膽固醇），喂養(yǎng)4周后，隨機抽取1只小鼠解剖觀察胸主動脈，光鏡下發(fā)現(xiàn)斑塊為造模成功。造模成功后各組開始藥物干預(yù)。

1.5 藥物干預(yù)

SAEE低劑量組、SAEE中劑量組和SAEE高劑量組分別給予 1.15、2.30、3.45 g/（kg·d） 的 SAEE 溶液灌胃治療，空白對照組和模型組則給予等體積（0.2 mL）的蒸餾水灌胃，喂養(yǎng)6周。

1.6 樣本采集及檢測

末次給藥結(jié)束后，所有小鼠禁食12 h，用20%烏拉坦腹腔注射麻醉，摘取眼球取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，并剝離主動脈弓，待測。

1.6.1 ELISA法檢測 采用ELISA法分別檢測各組小鼠血清 TC、TAG、HDL-C、LDL-C、TNF-α 的水平，具體操作參照試劑盒說明書。

1.6.2 Western blotting法檢測 主動脈粥樣斑塊中TNF-α、ASK1、p-JNK、JNK、P4H、COL-I及 COL-Ⅲ蛋白的含量檢測。取適量主動脈弓組織于液氮中研碎，RIPA裂解后勻漿，12 000 r/min離心10 min，BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1.5 h，加入 TNF-α、p-ASK1、ASK1、p-JNK、JNK、P4H、COL-I及 COL-Ⅲ和 β-actin 一抗（1∶500 稀釋），孵育過夜，洗滌，加入 HRP標記的二抗（1∶1 000稀釋），孵育 1.5 h，洗滌，顯色，掃描，Quantity One軟件分析，β-actin作為內(nèi)參，以比值結(jié)果表示蛋白的相對含量。

1.6.3 Realtime-PCR法檢測 主動脈粥樣斑塊中TNF-α、ASK1、JNK、P4H、COL-I及 COL-Ⅲ mRNA 的表達檢測。取適量主動脈弓組織，采用Trizole勻漿制備總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cRNA進行PCR擴增反應(yīng)。應(yīng)用Primer Prim 6.0軟件設(shè)計并合成PCR引物。引物序列分別為 TNF-α 上游：5′-TTCTCATTCCTGCTCGTGG-3′， 下游：5′-TTTGGTGGTTCGCCTCCT-3′（203 bp）；ASK1 上游：5′-AACCCAGTTGAGGCTGTAGCG-3′，下游：5′-ACATGAT GCAGTACGAGGTCAC-3′（98 bp）；JNK 上游：5′-TGATGACGCCTTACGTGGTA-3′，下游：5′-GGCAAACCATTTCTCCCATA-3′（40 bp）；P4H 上游：5′-GAGTGAGTTGGAGAATCTGGTCC-3′， 下游：5′-CAATTGTTAGGTATCCTGGAGACG-3′（198bp）；COL-I 上游：5′-TGTTCGTGGTTCTCAGGGTAG-3′，下游 ：5′-TTGTCGTACCAGGGTTCTTTC-3′（245 bp）；COL-Ⅲ上游：5′-ATGGTGGCTTTCAGTTCAGC-3′，下游：5′-TGGGGTTTCAG AGAGTTTGG-3′（425 bp）；βactin 上 游 ：5′-TGTTGCCCTAGACTTCGAGCA-3′，下游：5′-GGACCCAGGAAGGAAGGCT-3′（155 bp）?？偡磻?yīng)體系為 SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，69 ℃ 15 s， 共 40個循環(huán)進行擴增。采用 β-actin作為內(nèi)參照，2-ΔΔCT法計算組間倍數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血脂水平比較 見表1。模型組小鼠TC、TAG、LDL較空白對照組顯著升高，HDL顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；SAEE各劑量組均能夠顯著降低動脈粥樣硬化小鼠TC、TAG、LDL水平，升高HDL水平，其中以SAEE高劑量組效果最顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其中SAEE中、高劑量組與SAEE低劑量組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），SAEE高劑量組與SAEE中劑量組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組小鼠血脂水平比較（mmol/L，±s）

表1 各組小鼠血脂水平比較（mmol/L，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與 SAEE 高劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。 下同

組 別 n TC TAG HDL LDL 4.07±0.85 0.92±0.29 1.49±0.41 1.94±0.33 5.93±0.93△△ 1.19±0.57△△ 0.61±0.22△△ 2.97±0.28△△SAEE 低劑量組 10 5.22±0.84▲▲ 1.45±0.41▲▲ 1.07±0.38**▲▲ 2.46±0.31**▲▲SAEE 中劑量組 10 4.65±0.92**▲ 1.30±0.32*▲ 1.13±0.38**▲ 1.87±0.22**▲空白對照組 10模型組 10 SAEE高劑量組 104.17±0.64** 0.90±0.28** 1.41±0.30** 0.41±0.22*

2.2 各組小鼠TNF-α蛋白及mRNA表達比較 見表2，圖1。模型組小鼠血清及組織中 TNF-α蛋白及mRNA的表達顯著增高，與空白對照組比較，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）；SAEE各劑量均能顯著降低動脈粥樣硬化小鼠TNF-α蛋白及mRNA的表達，與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），其中SAEE中、高劑量與SAEE低劑量組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），SAEE高劑量組與SAEE中劑量組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠TNF-α蛋白及mRNA表達比較（±s）

表2 各組小鼠TNF-α蛋白及mRNA表達比較（±s）

組 別 n TNF-α（pg/mL）TNF-α/β-actin TNF-α mRNA 17.78±2.13 0.83±0.07 1.02±0.08 29.97±3.15△△ 2.98±0.18△△ 3.03±0.15△△SAEE 低劑量組 10 26.62±3.67*▲▲ 2.75±0.26**▲▲ 2.70±0.14**▲▲SAEE 中劑量組 10 22.95±2.43**▲ 2.10±0.20**▲ 2.13±0.20**▲空白對照組 10模型組 10 SAEE高劑量組 1019.64±2.57** 1.34±0.14** 1.42±0.12**

圖1 各組小鼠組織中TNF-α蛋白表達電泳條帶

2.3 各組小鼠ASK1-JNK信號通路及膠原蛋白表達比較 見表3，表4，圖2。模型組小鼠p-ASK1、p-JNK蛋白的水平較空白對照組顯著升高，P4H、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白的水平和COL-Ⅰ/COL-Ⅲ的比值顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），ASK1和JNK蛋白的水平與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；SAEE中、高劑量組均能顯著降低p-ASK1、p-JNK蛋白的水平，升高P4H、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白的水平和COL-Ⅰ/COL-Ⅲ的比值，與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其中SAEE中、高劑量組與SAEE低劑量組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），SAEE高劑量組與SAEE中劑量組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而SAEE各劑量組中ASK1和JNK蛋白的水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組小鼠ASK1-JNK信號通路及膠原蛋白表達比較（±s）

表3 各組小鼠ASK1-JNK信號通路及膠原蛋白表達比較（±s）

組 別 n p-ASK1/β-actin ASK1/β-actin p-JNK/β-actin JNK/β-actin 0.26±0.06 1.37±0.24 0.31±0.07 1.04±0.20 0.84±0.27△△ 1.21±0.26 0.74±0.19△△ 1.11±0.36 SAEE 低劑量組 10 0.70±0.23▲▲ 1.15±0.19▲▲ 0.60±0.17*▲▲ 1.19±0.26▲▲SAEE 中劑量組 10 0.50±0.13**▲ 1.09±0.32▲ 0.51±0.12**▲ 1.05±0.20▲空白對照組 10模型組 10 SAEE高劑量組 100.39±0.11** 1.32±0.25 0.42±0.12** 0.94±0.24

表4 各組小鼠ASK1-JNK信號通路及膠原蛋白表達比較（±s）

表4 各組小鼠ASK1-JNK信號通路及膠原蛋白表達比較（±s）

組 別 n P4H/β-actin COL-Ⅰ/β-actin COL-Ⅲ/β-actin COL-Ⅰ/COL-Ⅲ1.18±0.20 0.65±0.06 0.60±0.07 1.09±0.18 0.36±0.06△△ 0.30±0.05△△ 0.40±0.06△△ 0.77±0.15△△SAEE 低劑量組 10 0.45±0.13▲▲ 0.46±0.05**▲▲ 0.44±0.07▲▲ 1.07±0.20**▲▲SAEE 中劑量組 10 0.68±0.13**▲ 0.62±0.07**▲ 0.52±0.07**▲ 1.20±0.16**▲空白對照組 10模型組 10 SAEE高劑量組 101.12±0.18** 0.82±0.10** 0.55±0.06** 1.51±0.25**

2.4 各組小鼠ASK1-JNK信號通路及膠原mRNA的表達 見表5。造模后，模型組小鼠ASK1和JNK mRNA的水平較空白對照組顯著升高，P4H、COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA的水平和COL-Ⅰ/COL-Ⅲ的比值顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；SAEE各劑量組均能夠降低動脈粥樣硬化小鼠ASK1和JNK mRNA的水平，升高P4H、COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA的水平和COL-Ⅰ/COL-Ⅲ的比值，其中以SAEE高劑量組效果最佳，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其中SAEE中、高劑量組與SAEE低劑量組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），SAEE高劑量組與SAEE中劑量組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠組織中ASK1-JNK信號通路及膠原蛋白表達

表5 各組小鼠ASK1-JNK信號通路及膠原mRNA表達比較（±s）

表5 各組小鼠ASK1-JNK信號通路及膠原mRNA表達比較（±s）

組 別 n ASK1 JNK P4H COL-ⅠCOL-Ⅲ COL-Ⅰ/COL-Ⅲ0.92±0.05 1.15±0.13 0.73±0.07△△ 0.90±0.17△△SAEE 低劑量組 10 2.27±0.29▲▲ 2.18±0.40**▲▲ 0.60±0.08▲▲ 0.69±0.08▲▲ 0.72±0.07▲▲ 0.98±0.16▲▲SAEE 中劑量組 10 1.71±0.33**▲ 1.75±0.15**▲ 0.62±0.11*▲ 1.22±0.11**▲ 0.84±0.06**▲ 1.47±0.22**▲空白對照組 10模型組 10 0.97±0.08 0.94±0.11 1.07±0.18 2.55±0.57△△ 2.77±047△△ 0.48±0.05△△1.07±0.13 0.64±0.07△△SAEE高劑量組 101.48±0.22**1.26±0.18** 0.94±0.13**1.60±0.15**0.93±0.14** 1.75±0.28**

3 討 論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是由脂質(zhì)代謝異常引起的以冠狀動脈局灶性粥樣斑塊形成為病理特征的一類慢性免疫炎癥性疾病，是目前我國最常見的心血管疾病之一［7]。ACS作為冠心病急性發(fā)病的主要類型，其不僅致殘率高、并發(fā)癥多，而且病死率高，嚴重威脅著人們的健康。據(jù)《中國心血管病報告2014》顯示，我國ACS的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，其中城市地區(qū)急性心肌梗死的死亡率約為51.45/10萬，而且由心血管疾病導(dǎo)致的死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位［8]。因此，尋找一種安全、高效的治療方案，及時防控粥樣斑塊的進展，改善ACS患者的預(yù)后、延長患者的生命，具有重要的意義。

目前認為冠狀動脈內(nèi)不穩(wěn)定斑塊的破裂和血栓的形成是ACS患者猝死的主要原因，而斑塊的破裂多發(fā)生于纖維帽厚度小于100 μm的邊緣處。調(diào)查研究顯示，僅有20%的急性心肌梗死是由冠狀動脈內(nèi)狹窄超過70%的斑塊破裂處，而超過70%的急性心肌梗死發(fā)生于狹窄小于50%的斑塊破裂處，由此可見，斑塊的穩(wěn)定性較病變范圍和狹窄程度，更能反映ACS發(fā)生的風(fēng)險［9]。TNF-α是一種介導(dǎo)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的前炎性因子，不僅能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)的代謝，還能夠通過刺激血管平滑肌細胞的增殖和細胞表型的改變，促進動脈粥樣硬化的形成［10]。同時，TNF-α還可能通過刺激血管平滑肌細胞中MMP-9的表達，促進細胞外基質(zhì)的降解，加速血管壁的重構(gòu)、斑塊的破裂和血栓的形成，導(dǎo)致 ACS 的發(fā)?。?1]。

ASK1和JNK均為細胞絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員，已被證實與動脈粥樣硬化和術(shù)后再狹窄密切相關(guān)［12]。作為c-Jun氨基端激酶/p38絲裂原活化蛋白激酶（JNK/p38 MAPK）級聯(lián)蛋白上游重要的激活因子，ASK1幾乎能被所有的炎性因子激活，如TNF-α、IL-1等［13]。JNK信號通路作為MAPK重要的通路之一，能夠通過促進細胞凋亡的發(fā)生，參與AS的發(fā)生。JNK包含雙磷酸化功能區(qū)，活化的JNK能夠與轉(zhuǎn)錄子c-Jun和ATF2的氨基末端結(jié)合，使發(fā)生磷酸化。研究發(fā)現(xiàn)在高脂喂養(yǎng)的模型動物頸動脈粥樣硬化斑塊的基底部和纖維帽中，JNK蛋白的表達明顯增高，而通過喂養(yǎng)JNK抑制劑能夠顯著抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成［14]。同時，通過敲除巨噬細胞的JNK基因，能夠明顯抑制脂質(zhì)的攝取及粥樣硬化斑塊的泡沫化形成［15]。

P4H是膠原合成的限速酶，由兩個α亞基和兩個β亞基構(gòu)成的四聚體，P4H能夠通過羥化X-Pro-Gly序列上脯氨酸的殘基形成羥基脯氨酸，在膠原的合成中起著重要的作用［16]。膠原是細胞外基質(zhì)的主要成分，主要由內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞所分泌，對維持血管壁的通透性和完整性具有重要的意義。如前所述，纖維帽的完整是動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的重要標志，而纖維帽的破裂是細胞外基質(zhì)降解和合成失調(diào)造成。COL-Ⅰ和COL-Ⅲ作為纖維帽的主要構(gòu)成成分，與血管內(nèi)纖維帽的形成、結(jié)締組織斑塊的形成密切相關(guān)［17]。COL-Ⅰ主要存在于穩(wěn)定成熟的血管壁中層而COL-Ⅲ多見于增生活躍的不成熟血管，因此COL-Ⅰ的含量決定著斑塊的穩(wěn)定性，而COL-Ⅰ/COL-Ⅲ的比值間接反映了 AS 斑塊的穩(wěn)定性［18]。

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAEE能夠顯著降低動脈粥樣硬化小鼠TC、TAG、LDL的水平，升高HDL的水平，說明SAEE具有顯著的調(diào)脂功效；同時，SAEE能夠顯著降低動脈粥樣硬化小鼠TNF-α蛋白及mRNA的表達，從而抑制體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。之前有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α能夠通過激活A(yù)SK1-JNK信號通路，從而抑制平滑肌細胞中P4Hα1的表達，促進膠原的降解［19]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)SAEE能夠抑制ASK1-JNK信號通路中p-ASK1、p-JNK的磷酸化水平，進而促進下游P4H的表達，增加COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的表達和COL-Ⅰ/COL-Ⅲ的比值，達到穩(wěn)定斑塊的目的，同時Realtime-PCR的結(jié)果進一步驗證了我們的結(jié)果。

綜上所述，SAEE能夠通過抑制炎癥反應(yīng)，進而抑制ASK1-JNK信號通路的活化，促進膠原的表達，達到調(diào)控體內(nèi)的血脂水平、穩(wěn)定斑塊的目的。