馬浩軒 田光敏 劉 鵬△ 彭 琴 王 絨 鐘庭燕

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000；2.四川省自貢市第四人民醫(yī)院，四川 自貢643000）

急性肝衰竭是發(fā)展迅速的嚴(yán)重肝臟疾病，可由多種病因引起，臨床上以嚴(yán)重肝功能損傷、凝血功能異常、肝性腦病等為主要表現(xiàn)［1]。目前尚缺乏有效治療手段，人工肝、西醫(yī)綜合治療等療效欠佳。肝臟移植可從根源上治療急性肝衰竭，但因供肝來源稀少、手術(shù)昂貴及術(shù)后排異反應(yīng)等限制了肝臟移植的廣泛應(yīng)用［2-3]?，F(xiàn)有研究表明［4]，急性肝衰竭的主要病理機(jī)制為肝臟內(nèi)環(huán)境紊亂，炎癥因子釋放致內(nèi)毒素血癥形成，肝細(xì)胞大量凋亡壞死，導(dǎo)致肝臟功能急劇惡化，預(yù)后極差。治療關(guān)鍵點(diǎn)在于控制促炎因子生成、減輕肝臟炎癥、改善內(nèi)毒素血癥環(huán)境、減少肝細(xì)胞死亡。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是來源于骨髓的多能干細(xì)胞，因其具有多向分化潛能、易于培養(yǎng)、修復(fù)增殖能力突出等優(yōu)點(diǎn)而受到青睞［5]。 已有研究發(fā)現(xiàn)［6]，BMSCs 與肝細(xì)胞具有一定同源性，其不僅具有提升免疫及抗纖維化能力［6-7]，還具有炎癥調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞凋亡等作用［7-8]?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，BMSCs已逐步成為再生醫(yī)學(xué)及細(xì)胞領(lǐng)域研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)，不少學(xué)者已將其應(yīng)用于終末器官衰竭的研究中，以期取得更好的治療效果。

急性肝衰竭在中醫(yī)內(nèi)科學(xué)中可歸屬“鼓脹”“積聚”“急黃”等范疇，總的病機(jī)可歸納為濕熱邪毒交結(jié)致瘀血內(nèi)阻、熱瘀搏結(jié)。臨證以清熱解毒、涼血化瘀為其基本治法，茵陳四苓顆粒為代表方劑。茵陳四苓顆粒為西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院肝病科孫同郊教授經(jīng)驗(yàn)方所成，前期研究發(fā)現(xiàn)，肝衰竭體外環(huán)境下，茵陳四苓顆粒含藥血清可提高BMSCs的肝向分化及免疫調(diào)節(jié)能力［9]，但具體機(jī)制未做深入探討。本實(shí)驗(yàn)就茵陳四苓顆粒聯(lián)合BMSCs移植治療急性肝衰竭大鼠，從炎癥通路及相關(guān)促炎因子的轉(zhuǎn)錄方面進(jìn)一步探索中藥聯(lián)合干細(xì)胞治療急性肝衰竭大鼠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠10只，2～3周齡，體質(zhì)量100～120 g，作干細(xì)胞分離用。健康雄性SD 清潔級(jí)大鼠 60 只，6～8周齡，體質(zhì)量 180～200 g，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXY （川）2008-17，使用許可證號(hào)：SCXY（川）2008-065。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：茵陳四苓顆粒（組成：茵陳、梔子、大黃、白公翁、茯苓、白術(shù)等，西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備，川藥制字Z20070525，許可證號(hào)：川20160039HZ）；復(fù)方甘草酸苷片（日本米諾發(fā)源制藥株式會(huì)社，規(guī)格25 mg/片，國藥準(zhǔn)字J20130077，批號(hào) 16027）。 2）硫代乙酰胺（TAA）（北京化學(xué)試劑公司）；L-DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone 公司）；NF-κB單克隆抗體 （Abcam公司）；SABC免疫組化染色、DAB、PCR試劑盒 （Roche公司）；RT-PCR引物設(shè)計(jì)（上海生工）。2）儀器：CO2培養(yǎng)箱（3111系列直熱式，美國 Thermo）；-80℃超低溫冰箱（Thermo991，美國熱電）；醫(yī)用低速離心機(jī)（白洋400c，北京白洋）；熒光定量 PCR 儀（Realplex2，德國 eppendorf）；凝膠掃描成像系統(tǒng)（GelDocXR，美國伯樂公司）。

1.3 大鼠BMSCs的分離、純化與體外培養(yǎng)大鼠置于操作臺(tái)，予以脫頸處死。將大鼠浸泡于75%酒精中消毒。后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs。剪去大鼠雙側(cè)腿骨，剝凈皮毛及肌肉筋膜，剪去兩端骨骺，予以細(xì)胞培養(yǎng)基反復(fù)快速?zèng)_洗骨髓腔，無菌條件下收集干細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×106個(gè)/mL，靜置細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)（37℃，5%CO2）。每隔2 d全量換液，觀察記錄細(xì)胞形態(tài)。每于細(xì)胞鋪滿皿底約90%面積時(shí)予以胰酶消化傳代。傳至P3代時(shí)，細(xì)胞呈旋渦狀緊密排列，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定后備用。

1.4 模型制備 將大鼠隨機(jī)分為6組，包括正常組、模型組、陽性對(duì)照組、中藥組、干細(xì)胞組、聯(lián)合組。大鼠自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于造模。造模前12 h禁食不禁水，采用硫代乙酰胺（TAA）400 mg/kg灌胃，間隔24 h重復(fù)1次，制備急性肝衰竭模型，正常組予以等量生理鹽水灌胃。觀察大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤、進(jìn)食水量、體質(zhì)量等變化。造模后模型組大鼠血清ALT、AST水平較正常組明顯升高，肝組織病理染色提示急性肝損傷表現(xiàn)，肝細(xì)胞壞死、凋亡，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，表明成功完成急性肝衰竭模型制備。

1.5 給藥方法 將5 g茵陳四苓顆粒溶于20 mL蒸餾水中，調(diào)整質(zhì)量濃度為250 mg/mL。按照標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量動(dòng)物間藥物劑量換算將復(fù)方甘草酸苷片配置成質(zhì)量濃度為23 mg/kg的溶液常溫備用。造模成功后中藥組及聯(lián)合組予以茵陳四苓顆粒1.5 g/kg灌胃，每天2次，陽性對(duì)照組予以復(fù)方甘草酸苷片23 mg/kg灌胃，其余各組等量生理鹽水灌胃；干細(xì)胞組及聯(lián)合組尾靜脈注射干細(xì)胞懸液1.0×106個(gè)/mL，其余各組尾靜脈注射等體積（1.2 mL）細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.6 標(biāo)本采集及檢測(cè) 干預(yù)72 h后，大鼠麻醉后開腹，腹主動(dòng)脈采血，右肝相近部位取肝組織，部分予以4%多聚甲醛固定，進(jìn)行后續(xù)病理觀察及核因子-κB（NF-κB）免疫組化檢測(cè)，部分置于凍存管內(nèi)，用于iNOS及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測(cè)。 1）生化指標(biāo)檢測(cè)：腹主動(dòng)脈采血后離心，經(jīng)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清AST、ALT及血漿內(nèi)毒素（ET）水平。2）肝臟病理觀察：肝組織經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后，常規(guī)包埋、切片、脫蠟、HE染色、脫水、石蠟封片，光鏡下觀察各組大鼠肝組織病理變化。3）SABC免疫組化法檢測(cè)肝組織中NF-κB的表達(dá)。按說明書步驟進(jìn)行，山羊血清常溫封閉20 min后滴加一抗，4℃過夜，PBS清洗后加入二抗（生物素標(biāo)記羊抗兔抗體），37℃溫箱中放置30 min，清洗后滴加SABC，溫箱靜置后DAB顯色，后經(jīng)脫水、透明、封片、晾干等處理。切片經(jīng)Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行平均光密度值檢測(cè)，積分光密度（IOD）值表示NF-κB表達(dá)強(qiáng)度。陽性表現(xiàn)：細(xì)胞染呈棕黃色，定位于細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)。4）RT-PCR檢測(cè)肝組織中TNF-α及iNOS基因表達(dá)。按照RNA抽提試劑盒說明書方法提取總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。取cDNA產(chǎn)物2 μL，反應(yīng)體系為 20 μL，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95℃變性 15s，60℃［TNF-α]，58℃［iNOS]退火15 s，72℃延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，以GAPDH作為內(nèi)參作數(shù)據(jù)分析。引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank公布的基因序列，設(shè)計(jì)合成均由上海生工完成。見表1。

表1

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析（ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清AST、ALT及血漿ET水平比較見表2。72 h后各組AST、ALT及血漿ET水平明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但各治療組大鼠血清AST、ALT及ET水平較正常組仍高 （P＜0.01）。聯(lián)合組肝功能損傷程度及ET水平最低，與其他治療組比較，差異顯著（P＜0.01），其余各治療組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清AST、ALT及血漿ET比較（±s）

表2 各組大鼠血清AST、ALT及血漿ET比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與聯(lián)合組比較，▲P＜0.01。下同

組 別 n ET（EU/mL）正常組 10 0.097±0.01模型組 4 0.59±0.01*陽性對(duì)照組 5 0.41±0.01*△▲ALT（U/L） AST（U/L）55.20±6.36 71.30±7.50 747.75±20.78* 779.75±12.79*381.20±15.90*△▲ 398.80±19.08*△▲中藥組 5 0.39±0.01*△▲389.20±14.04*△▲ 416.20±14.82*△▲干細(xì)胞組 6 383.67±13.74*△▲ 406.67±13.95*△▲ 0.40±0.02*△▲聯(lián)合組 7 281.00±15.86*△ 276.71±13.07*△ 0.20±0.01*△

2.2 各組大鼠肝臟病理組織觀察結(jié)果 見圖1。干預(yù)72 h后模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞彌漫壞死，肝索破壞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；72 h后各治療組肝小葉結(jié)構(gòu)較模型組有所恢復(fù)，肝細(xì)胞壞死程度減輕，可見部分增生肝細(xì)胞，炎性浸潤(rùn)減輕，其中聯(lián)合組損傷程度最輕。

圖1 各組大鼠肝臟病理組織觀察結(jié)果（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠肝組織NF-κB表達(dá)水平比較 見表3，圖2。正常組肝組織中存在少量NF-κB表達(dá)。相較于正常組，其余各組表達(dá)NF-κB的細(xì)胞數(shù)量明顯增加（P＜0.01）。干預(yù)72 h后，各治療組NF-κB表達(dá)水平明顯低于模型組（P＜0.01）。但與正常組比較，NF-κB表達(dá)仍高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。各治療組間相比，NF-κB表達(dá)水平以聯(lián)合組降低最為顯著（P＜0.05），其余治療組間表達(dá)程度無明顯差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠肝組織NF-κB免疫組化表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠肝組織NF-κB免疫組化表達(dá)水平比較（±s）

組 別 n正常組 10模型組 4陽性對(duì)照組 5 NF-κB 172.40±6.65 292.00±11.60*245.80±8.53*△▲中藥組 5 240.40±5.08*△▲干細(xì)胞組 6 237.83±5.04*△▲聯(lián)合組 7 207.00±7.12*△

圖2 各組大鼠肝組織NF-κB免疫組化結(jié)果（DAB染色）

2.4 各組大鼠TNF-α、iNOS基因轉(zhuǎn)錄水平比較 見表4，圖3。正常組肝組織中存在少量TNF-α、iNOS基因轉(zhuǎn)錄。干預(yù)72 h后，與正常組相比，其余各組TNF-α、iNOS基因轉(zhuǎn)錄水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，各治療組中TNF-α、iNOS的基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低，且差異顯著（P＜0.01）；各治療組間比較，以聯(lián)合組基因轉(zhuǎn)錄水平降低最為顯著（P＜0.05），其余治療組間差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠肝組織中TNF-α、iNOS的基因轉(zhuǎn)錄水平比較（±s）

表4 各組大鼠肝組織中TNF-α、iNOS的基因轉(zhuǎn)錄水平比較（±s）

組 別 n正常組 10模型組 4陽性對(duì)照組 5中藥組 5干細(xì)胞組 6聯(lián)合組 7 TNF-α iNOS 1.01±0.17 1.00±0.11 3.18±0.20* 5.99±0.86*2.65±0.34*△▲ 4.13±0.36*△▲2.60±0.28*△▲ 3.93±0.64*△▲2.31±0.40*△▲ 3.53±0.95*△▲1.49±0.12*△ 1.80±0.24*△

圖3 各組大鼠肝組織PCR電泳結(jié)果

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)［10]，急性肝衰竭導(dǎo)致肝細(xì)胞大量壞死，內(nèi)環(huán)境紊亂促進(jìn)各種炎癥因子釋放，致內(nèi)毒素血癥形成是其早期主要的病理機(jī)制。其治療重點(diǎn)在于減少細(xì)胞壞死及炎癥因子，減輕肝臟炎癥反應(yīng)，避免加重內(nèi)毒素血癥。

NF-κB是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)最重要的通路之一，活化后的NF-κB誘導(dǎo)大量炎癥因子的合成，引起炎癥過度化與重癥化［11-12]。肝衰竭發(fā)生時(shí)，其下游炎癥因子如TNF-α、iNOS、IL-1等大量合成釋放，加重肝臟損傷，且進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB的激活，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致肝內(nèi)爆發(fā)性炎癥失控，使肝臟合成、代謝及解毒功能發(fā)生嚴(yán)重障礙［13]。當(dāng)TNF-α大量分泌時(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥，可對(duì)肝細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷［5，14]。且TNF-α不僅介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，其還可與FAS死亡受體結(jié)合，激活凋亡起始物Caspase-8，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［15]。當(dāng)受到內(nèi)毒素、TNF-α等刺激后，iNOS表達(dá)迅速升高，通過干擾肝臟生物轉(zhuǎn)化及線粒體毒性、損傷DNA、誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡等途徑參與肝臟炎癥損傷［16]。

由于干細(xì)胞在細(xì)胞修復(fù)、再生方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，且骨髓來源的干細(xì)胞具有免疫原性低，易于獲得和培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，目前已將其應(yīng)用于急慢性肝病的治療，干細(xì)胞不僅能夠提高爆發(fā)性肝衰竭的生存率，還可以促進(jìn)受損肝細(xì)胞增殖，抑制肝細(xì)胞凋亡［6-7]。

茵陳四苓顆粒為本院自制，由四川省名老中醫(yī)孫同郊教授經(jīng)驗(yàn)方所成。方中重用茵陳為君，取其清熱利濕退黃之功，大黃、赤芍為臣藥，涼血化瘀，佐以茯苓、白術(shù)補(bǔ)中健脾，全方以清泄為主，攻補(bǔ)兼施，共奏清熱解毒化瘀扶正之效。臨床研究顯示，茵陳四苓顆粒在治療重型肝炎中表現(xiàn)出改善肝功能、提高凝血酶原活動(dòng)度等功效［17]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)［18]，茵陳四苓顆粒明顯降低急性肝損傷大鼠的轉(zhuǎn)氨酶及血漿ET水平，表明其在調(diào)節(jié)重肝大鼠炎癥反應(yīng)方面有一定作用。

本實(shí)驗(yàn)通過TAA灌胃成功建立急性肝衰竭大鼠模型，通過復(fù)方甘草酸苷片、茵陳四苓顆粒、單純干細(xì)胞和茵陳四苓顆粒聯(lián)合干細(xì)胞等治療方法，發(fā)現(xiàn)各治療組均能有效降低AST、ALT及血漿ET水平，且聯(lián)合組效果優(yōu)于其他治療組。為進(jìn)一步探索相關(guān)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了炎癥信號(hào)通路NF-κB的表達(dá)及其下游炎性因子TNF-α、iNOS的基因轉(zhuǎn)錄。結(jié)果證明單純中藥治療、干細(xì)胞干預(yù)、二者聯(lián)合治療均能降低NF-κB的表達(dá)、減少TNF-α、iNOS的基因轉(zhuǎn)錄，有效控制肝內(nèi)失控性炎癥反應(yīng)、保護(hù)肝臟功能。聯(lián)合組療效優(yōu)于各單純治療組，表明茵陳四苓顆粒聯(lián)合干細(xì)胞治療可能通過介導(dǎo)炎癥通路、清除內(nèi)毒素及炎性介質(zhì)等作用，促進(jìn)干細(xì)胞的分泌，增強(qiáng)干細(xì)胞的修復(fù)增殖及抗凋亡能力。清熱解毒涼血化瘀切中急性肝衰竭的主要病理環(huán)節(jié)，以其為治療大法而成的茵陳四苓顆粒可以為干細(xì)胞治療急性肝衰竭提供新的聯(lián)合手段，二者聯(lián)合亦可為急性肝衰竭的治療提供新的思路。