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        基于JAK2/STAT3信號(hào)通路探討姜黃素改善脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的作用研究*

        2019-06-05 02:34:06石青青蘇湘川楊小平劉丙進(jìn)
        中國(guó)中醫(yī)急癥 2019年5期
        關(guān)鍵詞:小鼠模型

        石青青 蘇湘川 楊小平 劉丙進(jìn)

        (1.浙江省臺(tái)州市立醫(yī)院,浙江 臺(tái)州 318000;2.臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江 臺(tái)州 318000)

        急性肺損傷是以肺泡-毛細(xì)血管通透性增加為特 征的一種呼吸道感染類疾病,可急性加重轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙院粑狡染C合征,急性肺損傷預(yù)后差,其病死率可達(dá)到40%[1]。在急性肺損傷疾病發(fā)展過(guò)程中,各種炎癥介質(zhì),包括腫瘤壞死因子 α(TNF-α)和白介素-8(IL-8),引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞在肺部積聚[2-3]。因此,抑制炎癥介質(zhì)的分泌可以改善急性肺損傷的病理進(jìn)程。目前,臨床上對(duì)急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的治療還以對(duì)癥支持治療為主,尚缺乏有效的治療手段和特效藥。姜黃素是姜黃的活性成分,從姜黃根莖中分離得到,具有廣泛的抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤等多種藥理作用[4]。姜黃素在重癥急性胰腺炎大鼠模型中具有治療作用,同時(shí)在順鉑誘導(dǎo)的小鼠腎毒性中抑制了腎炎,提示姜黃素具有抗炎的作用[5-6]。Janus激酶2-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3(JAK2/STAT3)信號(hào)通路在細(xì)胞因子刺激下被激活,并將生物信號(hào)傳遞給靶細(xì)胞,參與細(xì)胞增殖、炎癥和纖維化的基因的調(diào)控[7]。研究顯示,JAK2/STAT3信號(hào)通路參與了胰腺炎的病理變化過(guò)程,但姜黃素改善急性肺損傷的作用是否通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路的調(diào)控尚不清楚[8]。因此,本研究小鼠腹腔注射脂多糖建立急性肺損傷模型,探討姜黃素通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路對(duì)急性肺損傷的改善作用,為急性肺損傷的治療提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取雄性6~9周齡昆明種小鼠30只,體質(zhì)量 18~24 g,動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度 22~24℃、相對(duì)濕度為40%~70%、噪音≤50 dB的環(huán)境中自由進(jìn)食和飲水,控制飼養(yǎng)環(huán)境晝夜循環(huán)(12 h/12 h),動(dòng)物相關(guān)處置均符合 《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》[9]要求,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

        1.2 試藥與儀器 1)試藥:姜黃素和脂多糖(Sigma公司,美國(guó));昆明種小鼠(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,中國(guó));戊巴比妥鈉(上海上藥新亞藥業(yè)有限公司,中國(guó));BCA蛋白測(cè)定試劑盒和Western blotting試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,中國(guó));TNF-α和IL-8 ELISA試劑盒 (上海酶聯(lián)生物科技有限公司,中國(guó));蛋白抽提試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司,中國(guó));鼠抗 JAK2、p-JAK2、STAT3 和 p-STAT3 單克隆抗體(Santa Cruz公司,美國(guó));辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗鼠IgG二抗和鼠抗GADPH單克隆抗體(武漢艾美捷科技有限公司,中國(guó));聚偏乙烯二氟膜(PVDF 膜)(Millipore公司,美國(guó));ECL 化學(xué)發(fā)光液(北京索萊寶科技有限公司,中國(guó));HBS-1096B酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司,中國(guó));HE染色試劑盒(中國(guó)國(guó)藥集團(tuán),中國(guó))。2)儀器:組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)等病理配套設(shè)備(Leica公司,德國(guó));凝膠成像儀(UVP公司,美國(guó));BIO-RAD垂直電泳儀(BIO-RAD公司,美國(guó));臺(tái)式冷凍離心機(jī)Sorvall STR ATOS(Heraeus 公司,德國(guó));光學(xué)顯微鏡(Nikon公司,日本)。

        1.3 分組及給藥 對(duì)小鼠進(jìn)行編號(hào),分配選取的隨機(jī)數(shù)字,用隨機(jī)數(shù)字法將小鼠均分為3組,每組10只:對(duì)照組、模型組和姜黃素干預(yù)組。姜黃素溶液用生理鹽水配制成100 mg/mL的儲(chǔ)備液備用,姜黃素干預(yù)組連續(xù)灌胃給予姜黃素(100 mg/kg),對(duì)照組和模型組給予等量(2 mL)的生理鹽水,7 d,每日 1 次。

        1.4 模型制備 末次給藥1 h后模型組和姜黃素腹腔注射給予脂多糖(10 mg/kg),對(duì)照組給予腹腔注射等量(0.2 mL)生理鹽水,6 h后麻醉處死大鼠進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

        1.5 標(biāo)本采集及檢測(cè) 1)大鼠肺組織切片觀察:每組取5只小鼠右肺上葉用10%甲醛固定,經(jīng)脫水、包埋、將蠟塊切成3 μm厚切片、攤片、烤片后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色,最后用中性樹脂封片。用光學(xué)顯微鏡觀察肺組織學(xué)變化。2)肺濕重/干重(W/D)比:每組用5只小鼠分離左側(cè)左肺上葉,用濾紙吸棄肺組織表面水分,稱濕重(W),用恒溫干烤箱于110℃烘烤24 h,稱取余重即為干重(D)。計(jì)算肺組織W/D=W(mg)/D(mg)。3)支氣管肺泡灌洗及蛋白、TNF-α和 IL-8含量的測(cè)定:每組用5只小鼠結(jié)扎右側(cè)主支氣管近端和氣管遠(yuǎn)端,在氣管結(jié)扎下端用0.3 mL預(yù)冷生理鹽水進(jìn)行左肺灌洗,重復(fù)3次,回收支氣管肺泡灌洗液,離心取上清,根據(jù)BCA蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量的測(cè)定;用ELISA法檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8,按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行TNF-α和IL-8的測(cè)定。4)Western Blotting法檢測(cè)JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平:每組取5只小鼠右肺中葉,用研缽進(jìn)行研碎,根據(jù)肺組織質(zhì)量加入相應(yīng)量蛋白抽提試劑,裂解2 h,離心取上清,進(jìn)行蛋白定量;調(diào)整蛋白濃度,用SDS-PAGE)凝膠進(jìn)行電泳,每孔上樣量20 μg,然后將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上,加入封閉液封閉1 h,孵育一抗[JAK2(1∶1 000)、p-JAK2 (1∶500)、STAT3 (1∶500)、p-STAT3(1∶500)、GADPH(1∶4 000)],4 ℃孵育過(guò)夜,孵育二抗[山羊抗鼠(1∶5 000)],用 ECL 顯色液顯色后進(jìn)行曝光顯影,采集圖像,對(duì)免疫印跡條帶灰度值并進(jìn)行分析。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以(±s)表示,用單因素方差分析進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 各組小鼠小鼠肺組織病理變化 見(jiàn)圖1。對(duì)照組小鼠肺組織切片未見(jiàn)明顯異常,肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺泡腔清晰未見(jiàn)水腫液,肺泡毛細(xì)血管無(wú)充血。模型組小鼠肺組織切片見(jiàn)肺泡壁部分增厚,細(xì)支氣管腔內(nèi)有大量脫落炎細(xì)胞及滲出物,泡壁毛細(xì)血管充血嚴(yán)重。姜黃素干預(yù)組小鼠肺組織肺泡壁部分增厚,肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞滲出及毛細(xì)血管出血較模型組輕。

        2.2 各組小鼠肺組織W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量的比較 見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較,模型組肺組織W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量增加,給予姜黃素干預(yù)后,肺組織W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        圖1 各組小鼠肺組織病理變化(HE染色,200倍)

        2.3 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8水平的比較 見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較,模型組支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8含量增加,給予姜黃素干預(yù)后,支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8含量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        表1 各組小鼠肺組織W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量的比較(±s)

        表1 各組小鼠肺組織W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量的比較(±s)

        與對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05。 下同

        組 別 n W/D 蛋白含量(mg/mL)對(duì)照組 5 2.35±0.08 107.03±11.89模型組 5 5.85±0.22* 359.68±24.08*姜黃素干預(yù)組 5 3.71±0.18*△ 155.64±18.43*△

        2.4 各組小鼠肺組織中 JAK2、p-JAK2、STAT3和 p-STAT3蛋白表達(dá)的比較 見(jiàn)表3和圖2。與對(duì)照組比較,模型組和姜黃素干預(yù)組小鼠肺組織中JAK2和STAT3蛋白表達(dá)變化不顯著,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),模型組小鼠肺組織中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)增加,給予姜黃素干預(yù)后,小鼠肺組織中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        表2 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8水平的比較(ng/L,±s)

        表2 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8水平的比較(ng/L,±s)

        組 別 n TNF-α IL-8對(duì)照組 5 0.27±0.03 0.06±0.01模型組 5 1.57±0.10* 0.24±0.05*姜黃素干預(yù)組 5 0.54±0.08*△ 0.17±0.01*△

        表3 各組小鼠肺組織中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的比較(±s)

        表3 各組小鼠肺組織中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的比較(±s)

        組 別 n JAK2 p-JAK2 STAT3 p-STAT3對(duì)照組 5模型組 5 0.85±0.15 0.21±0.02 0.70±0.06 0.12±0.01 0.81±0.08 0.54±0.06* 0.64±0.08 0.76±0.09*姜黃素干預(yù)組 50.88±0.14 0.41±0.04*△ 0.72±0.03 0.29±0.05*△

        3 討 論

        圖2 各組小鼠肺組織中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的條帶

        脂多糖是內(nèi)毒素的主要成分,是革蘭陰性菌外膜的主要組成部分,具有一定的炎癥活性,被認(rèn)為是誘導(dǎo)急性肺損傷發(fā)生的重要因素[10]。W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量是血管內(nèi)皮通透性障礙所致肺水腫的指標(biāo),用于評(píng)估實(shí)驗(yàn)性肺損傷[11]。在本研究中,模型組小鼠這兩個(gè)參數(shù)均較對(duì)照組有所增加,且病理結(jié)果顯示出現(xiàn)廣泛的組織學(xué)肺損傷,證明脂多糖誘導(dǎo)了急性肺損傷。姜黃素是從姜黃根中提取的多酚,已被證明可以減少炎癥反應(yīng),在再灌注引起的心肌缺血中起到顯著的心臟保護(hù)作用[12]。在本研究中,姜黃素預(yù)處理顯著降低了脂多糖誘導(dǎo)W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量,而且減輕肺組織學(xué)改變。這些結(jié)果提示姜黃素對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷具有明顯的保護(hù)作用。

        目前,急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。一般認(rèn)為,細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的過(guò)量釋放在急性肺損傷中起關(guān)鍵作用[13]。炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-6等影響感染性疾病的結(jié)果,特別是引發(fā)全身炎癥反應(yīng),使相關(guān)疾病的死亡率增加[14]。在急性胰腺炎的研究中發(fā)現(xiàn),血清中TNF-α和IL-6水平顯著增高,在給予姜黃素治療后,TNF-α和IL-6水平降低,本研究結(jié)果與之相一致,提示姜黃素可通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子減輕急性肺損傷[15]。

        JAK2/STAT3信號(hào)通路是細(xì)胞因子和生長(zhǎng)激素受體信號(hào)通路必不可少的通絡(luò)。越來(lái)越多的證據(jù)表明,JAK2/STAT3信號(hào)通路參與炎癥性疾病[16]。值得注意的是,細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3(SOCS3)通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活,參與了IL家族細(xì)胞因子對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路的調(diào)控[17]。中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中脂多糖可激活SOCS3,SOCS3在肺部的功能以前已經(jīng)被研究過(guò),SOCS蛋白在多個(gè)刺激下被激活,并抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路[18]。在高糖處理的A549肺上皮細(xì)胞,SOCS3被激活,抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的磷酸化,表明SOCS3是JAK2/STAT3信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子,參與了炎癥反應(yīng),在炎癥因子與JAK2/STAT3信號(hào)通路中起了橋梁作用[19],激活JAK2/STAT3信號(hào)通路誘發(fā)IL-8在肺泡細(xì)胞過(guò)表達(dá)。值得注意的是,研究表明姜黃素作為JAK2/STAT3通路的抑制劑,在一些實(shí)驗(yàn)?zāi)P秃腿祟惣膊≈邪l(fā)揮了顯著的作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn),在小鼠急性肺損傷模型中,JAK2和STAT3的磷酸化明顯增加,而姜黃素預(yù)處理抑制了這兩種磷酸化,提示姜黃素通過(guò)干擾JAK2/STAT3通路激活,有效抑制了由急性肺損傷觸發(fā)的炎癥反應(yīng)。但本研究沒(méi)有對(duì)SOCS3的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),筆者將在活性的研究中完善相關(guān)檢測(cè)。

        綜上所述,本研究證實(shí)了姜黃素在小鼠急性肺損傷模型組發(fā)揮了保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3通路激活,減少炎癥介質(zhì)分泌有關(guān)。因此,筆者認(rèn)為姜黃素可能具有治療急性肺損傷的潛力。

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