石青青 蘇湘川 楊小平 劉丙進(jìn)

（1.浙江省臺(tái)州市立醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 318000；2.臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000）

急性肺損傷是以肺泡-毛細(xì)血管通透性增加為特 征的一種呼吸道感染類疾病，可急性加重轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙院粑狡染C合征，急性肺損傷預(yù)后差，其病死率可達(dá)到40%［1]。在急性肺損傷疾病發(fā)展過(guò)程中，各種炎癥介質(zhì)，包括腫瘤壞死因子 α（TNF-α）和白介素-8（IL-8），引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞在肺部積聚［2-3]。因此，抑制炎癥介質(zhì)的分泌可以改善急性肺損傷的病理進(jìn)程。目前，臨床上對(duì)急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的治療還以對(duì)癥支持治療為主，尚缺乏有效的治療手段和特效藥。姜黃素是姜黃的活性成分，從姜黃根莖中分離得到，具有廣泛的抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤等多種藥理作用［4]。姜黃素在重癥急性胰腺炎大鼠模型中具有治療作用，同時(shí)在順鉑誘導(dǎo)的小鼠腎毒性中抑制了腎炎，提示姜黃素具有抗炎的作用［5-6]。Janus激酶2-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3（JAK2/STAT3）信號(hào)通路在細(xì)胞因子刺激下被激活，并將生物信號(hào)傳遞給靶細(xì)胞，參與細(xì)胞增殖、炎癥和纖維化的基因的調(diào)控［7]。研究顯示，JAK2/STAT3信號(hào)通路參與了胰腺炎的病理變化過(guò)程，但姜黃素改善急性肺損傷的作用是否通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路的調(diào)控尚不清楚［8]。因此，本研究小鼠腹腔注射脂多糖建立急性肺損傷模型，探討姜黃素通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路對(duì)急性肺損傷的改善作用，為急性肺損傷的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取雄性6～9周齡昆明種小鼠30只，體質(zhì)量 18～24 g，動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度 22～24℃、相對(duì)濕度為40%～70%、噪音≤50 dB的環(huán)境中自由進(jìn)食和飲水，控制飼養(yǎng)環(huán)境晝夜循環(huán)（12 h/12 h），動(dòng)物相關(guān)處置均符合 《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》［9]要求，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：姜黃素和脂多糖（Sigma公司，美國(guó)）；昆明種小鼠（河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，中國(guó)）；戊巴比妥鈉（上海上藥新亞藥業(yè)有限公司，中國(guó)）；BCA蛋白測(cè)定試劑盒和Western blotting試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；TNF-α和IL-8 ELISA試劑盒 （上海酶聯(lián)生物科技有限公司，中國(guó)）；蛋白抽提試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，中國(guó)）；鼠抗 JAK2、p-JAK2、STAT3 和 p-STAT3 單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國(guó)）；辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗鼠IgG二抗和鼠抗GADPH單克隆抗體（武漢艾美捷科技有限公司，中國(guó)）；聚偏乙烯二氟膜（PVDF 膜）（Millipore公司，美國(guó)）；ECL 化學(xué)發(fā)光液（北京索萊寶科技有限公司，中國(guó)）；HBS-1096B酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，中國(guó)）；HE染色試劑盒（中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)，中國(guó)）。2）儀器：組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)等病理配套設(shè)備（Leica公司，德國(guó)）；凝膠成像儀（UVP公司，美國(guó)）；BIO-RAD垂直電泳儀（BIO-RAD公司，美國(guó)）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)Sorvall STR ATOS（Heraeus 公司，德國(guó)）；光學(xué)顯微鏡（Nikon公司，日本）。

1.3 分組及給藥 對(duì)小鼠進(jìn)行編號(hào)，分配選取的隨機(jī)數(shù)字，用隨機(jī)數(shù)字法將小鼠均分為3組，每組10只：對(duì)照組、模型組和姜黃素干預(yù)組。姜黃素溶液用生理鹽水配制成100 mg/mL的儲(chǔ)備液備用，姜黃素干預(yù)組連續(xù)灌胃給予姜黃素（100 mg/kg），對(duì)照組和模型組給予等量（2 mL）的生理鹽水，7 d，每日 1 次。

1.4 模型制備 末次給藥1 h后模型組和姜黃素腹腔注射給予脂多糖（10 mg/kg），對(duì)照組給予腹腔注射等量（0.2 mL）生理鹽水，6 h后麻醉處死大鼠進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.5 標(biāo)本采集及檢測(cè) 1）大鼠肺組織切片觀察：每組取5只小鼠右肺上葉用10%甲醛固定，經(jīng)脫水、包埋、將蠟塊切成3 μm厚切片、攤片、烤片后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，最后用中性樹脂封片。用光學(xué)顯微鏡觀察肺組織學(xué)變化。2）肺濕重/干重（W/D）比：每組用5只小鼠分離左側(cè)左肺上葉，用濾紙吸棄肺組織表面水分，稱濕重（W），用恒溫干烤箱于110℃烘烤24 h，稱取余重即為干重（D）。計(jì)算肺組織W/D＝W（mg）/D（mg）。3）支氣管肺泡灌洗及蛋白、TNF-α和 IL-8含量的測(cè)定：每組用5只小鼠結(jié)扎右側(cè)主支氣管近端和氣管遠(yuǎn)端，在氣管結(jié)扎下端用0.3 mL預(yù)冷生理鹽水進(jìn)行左肺灌洗，重復(fù)3次，回收支氣管肺泡灌洗液，離心取上清，根據(jù)BCA蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量的測(cè)定；用ELISA法檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行TNF-α和IL-8的測(cè)定。4）Western Blotting法檢測(cè)JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平：每組取5只小鼠右肺中葉，用研缽進(jìn)行研碎，根據(jù)肺組織質(zhì)量加入相應(yīng)量蛋白抽提試劑，裂解2 h，離心取上清，進(jìn)行蛋白定量；調(diào)整蛋白濃度，用SDS－PAGE）凝膠進(jìn)行電泳，每孔上樣量20 μg，然后將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，加入封閉液封閉1 h，孵育一抗［JAK2（1∶1 000）、p-JAK2 （1∶500）、STAT3 （1∶500）、p-STAT3（1∶500）、GADPH（1∶4 000）]，4 ℃孵育過(guò)夜，孵育二抗［山羊抗鼠（1∶5 000）]，用 ECL 顯色液顯色后進(jìn)行曝光顯影，采集圖像，對(duì)免疫印跡條帶灰度值并進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以（±s）表示，用單因素方差分析進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠小鼠肺組織病理變化 見(jiàn)圖1。對(duì)照組小鼠肺組織切片未見(jiàn)明顯異常，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰未見(jiàn)水腫液，肺泡毛細(xì)血管無(wú)充血。模型組小鼠肺組織切片見(jiàn)肺泡壁部分增厚，細(xì)支氣管腔內(nèi)有大量脫落炎細(xì)胞及滲出物，泡壁毛細(xì)血管充血嚴(yán)重。姜黃素干預(yù)組小鼠肺組織肺泡壁部分增厚，肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞滲出及毛細(xì)血管出血較模型組輕。

2.2 各組小鼠肺組織W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量的比較 見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，模型組肺組織W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量增加，給予姜黃素干預(yù)后，肺組織W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化（HE染色，200倍）

2.3 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8水平的比較 見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，模型組支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8含量增加，給予姜黃素干預(yù)后，支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組小鼠肺組織W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量的比較（±s）

表1 各組小鼠肺組織W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量的比較（±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n W/D 蛋白含量（mg/mL）對(duì)照組 5 2.35±0.08 107.03±11.89模型組 5 5.85±0.22* 359.68±24.08*姜黃素干預(yù)組 5 3.71±0.18*△ 155.64±18.43*△

2.4 各組小鼠肺組織中 JAK2、p-JAK2、STAT3和 p-STAT3蛋白表達(dá)的比較 見(jiàn)表3和圖2。與對(duì)照組比較，模型組和姜黃素干預(yù)組小鼠肺組織中JAK2和STAT3蛋白表達(dá)變化不顯著，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），模型組小鼠肺組織中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)增加，給予姜黃素干預(yù)后，小鼠肺組織中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8水平的比較（ng/L，±s）

表2 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8水平的比較（ng/L，±s）

組 別 n TNF-α IL-8對(duì)照組 5 0.27±0.03 0.06±0.01模型組 5 1.57±0.10* 0.24±0.05*姜黃素干預(yù)組 5 0.54±0.08*△ 0.17±0.01*△

表3 各組小鼠肺組織中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的比較（±s）

表3 各組小鼠肺組織中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的比較（±s）

組 別 n JAK2 p-JAK2 STAT3 p-STAT3對(duì)照組 5模型組 5 0.85±0.15 0.21±0.02 0.70±0.06 0.12±0.01 0.81±0.08 0.54±0.06* 0.64±0.08 0.76±0.09*姜黃素干預(yù)組 50.88±0.14 0.41±0.04*△ 0.72±0.03 0.29±0.05*△

3 討 論

圖2 各組小鼠肺組織中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的條帶

脂多糖是內(nèi)毒素的主要成分，是革蘭陰性菌外膜的主要組成部分，具有一定的炎癥活性，被認(rèn)為是誘導(dǎo)急性肺損傷發(fā)生的重要因素［10]。W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量是血管內(nèi)皮通透性障礙所致肺水腫的指標(biāo)，用于評(píng)估實(shí)驗(yàn)性肺損傷［11]。在本研究中，模型組小鼠這兩個(gè)參數(shù)均較對(duì)照組有所增加，且病理結(jié)果顯示出現(xiàn)廣泛的組織學(xué)肺損傷，證明脂多糖誘導(dǎo)了急性肺損傷。姜黃素是從姜黃根中提取的多酚，已被證明可以減少炎癥反應(yīng)，在再灌注引起的心肌缺血中起到顯著的心臟保護(hù)作用［12]。在本研究中，姜黃素預(yù)處理顯著降低了脂多糖誘導(dǎo)W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量，而且減輕肺組織學(xué)改變。這些結(jié)果提示姜黃素對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷具有明顯的保護(hù)作用。

目前，急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。一般認(rèn)為，細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的過(guò)量釋放在急性肺損傷中起關(guān)鍵作用［13]。炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-6等影響感染性疾病的結(jié)果，特別是引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，使相關(guān)疾病的死亡率增加［14]。在急性胰腺炎的研究中發(fā)現(xiàn)，血清中TNF-α和IL-6水平顯著增高，在給予姜黃素治療后，TNF-α和IL-6水平降低，本研究結(jié)果與之相一致，提示姜黃素可通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子減輕急性肺損傷［15]。

JAK2/STAT3信號(hào)通路是細(xì)胞因子和生長(zhǎng)激素受體信號(hào)通路必不可少的通絡(luò)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，JAK2/STAT3信號(hào)通路參與炎癥性疾病［16]。值得注意的是，細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3（SOCS3）通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活，參與了IL家族細(xì)胞因子對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路的調(diào)控［17]。中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中脂多糖可激活SOCS3，SOCS3在肺部的功能以前已經(jīng)被研究過(guò)，SOCS蛋白在多個(gè)刺激下被激活，并抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路［18]。在高糖處理的A549肺上皮細(xì)胞，SOCS3被激活，抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的磷酸化，表明SOCS3是JAK2/STAT3信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，參與了炎癥反應(yīng)，在炎癥因子與JAK2/STAT3信號(hào)通路中起了橋梁作用［19]，激活JAK2/STAT3信號(hào)通路誘發(fā)IL-8在肺泡細(xì)胞過(guò)表達(dá)。值得注意的是，研究表明姜黃素作為JAK2/STAT3通路的抑制劑，在一些實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃腿祟惣膊≈邪l(fā)揮了顯著的作用［20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠急性肺損傷模型中，JAK2和STAT3的磷酸化明顯增加，而姜黃素預(yù)處理抑制了這兩種磷酸化，提示姜黃素通過(guò)干擾JAK2/STAT3通路激活，有效抑制了由急性肺損傷觸發(fā)的炎癥反應(yīng)。但本研究沒(méi)有對(duì)SOCS3的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，筆者將在活性的研究中完善相關(guān)檢測(cè)。

綜上所述，本研究證實(shí)了姜黃素在小鼠急性肺損傷模型組發(fā)揮了保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3通路激活，減少炎癥介質(zhì)分泌有關(guān)。因此，筆者認(rèn)為姜黃素可能具有治療急性肺損傷的潛力。