林筱潔 萬浩宇 李志威 周惠芬 虞 立 楊端昕 楊潔紅 萬海同△

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州310006）

缺血性中風(fēng)又稱腦梗死，是中老年人群常見的急癥，且近年有發(fā)病年齡年輕化的趨勢，我國大概有10%～15%患者是45歲之前發(fā)病的［1]。因此缺血性中風(fēng)的早期防治是一個重要的研究方向。缺血性中風(fēng)的常見中醫(yī)證型為風(fēng)痰瘀阻證、痰熱腑實證、氣虛血瘀證等，血瘀既作為缺血性中風(fēng)的病理產(chǎn)物又作為致病因素，貫穿整個疾病過程［2]?！梆錾逍啊奔觿∧X缺血損傷［3]。 梗死證屬“血瘀證”者可占 40%［4]。 因此活血化瘀藥廣泛應(yīng)用于缺血性中風(fēng)的治療。丹紅注射液就是臨床廣泛使用的活血化瘀藥之一。我們在前期研究發(fā)現(xiàn)丹紅注射液能有效治療缺血性中風(fēng)大鼠［5-6]，PET檢查顯示缺血灶減小，能抗氧化、抗血栓、抗凋亡、促進神經(jīng)元成熟，保護神經(jīng)膠質(zhì)細胞。因此研究丹紅注射液對缺血性中風(fēng)血瘀證的影響具有臨床參考價值。舌象臨床表征一直是臨床診斷的重要依據(jù)，舌質(zhì)紫暗、少腹部抵抗壓痛、脈澀等對血瘀證診斷的貢獻最大［7]。2011年修訂的血瘀證中西醫(yī)結(jié)合十二條診斷標(biāo)準(zhǔn)［8]及2016年修訂的實用血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)［9]都可說明舌質(zhì)紫暗、舌下靜脈曲張、瘀血等舌象在血瘀證診斷中具有重要作用。臨床研究還發(fā)現(xiàn)舌象的改變與腦梗死患者血液中的纖維蛋白原水平和中性粒細胞計數(shù)有關(guān)，與急性腦梗死患者的神經(jīng)功能缺損程度有關(guān)，還與患者的腦梗死部位有關(guān)［10-12]。觀察丹紅注射液對血瘀證相關(guān)舌象的改善作用具有重要研究價值和實際臨床意義。本研究參照文獻［13-16]對缺血性中風(fēng)大鼠血瘀證相關(guān)舌象進行分析，并研究其與腦梗死的相關(guān)性，同時觀察丹紅注射液治療后舌象的變化，證實丹紅注射液可以有效干預(yù)缺血性中風(fēng)大鼠血瘀證相關(guān)舌象并促進神經(jīng)功能恢復(fù)，為其臨床療效提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，鼠齡2～3個月，體質(zhì)量為270～280 g，共40只。購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，動物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心層流屏障內(nèi)，許可證號SCXK（滬）2013-0016。

1.2 藥物與儀器 1）藥物：丹紅注射液（山東丹紅制藥有限公司提供，國藥準(zhǔn)字Z20026866，批號2018011035；玻璃安瓿每支裝10 mL，含丹參、紅花提取物）。丁苯酞注射液（石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20100041，批號 20170808，100 mL∶25 mg）。 特耐（注射用帕瑞昔布鈉針，輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字J20080045，批號 T13127）。 2）儀器：佳能 IXUS1100HS型數(shù)碼照相機（1 210萬像素，佳能株式會社生產(chǎn)）；標(biāo)準(zhǔn)色卡（美國愛色麗公司生產(chǎn)）。栓線（2636-A4，線身直徑0.26 mm，北京西濃科技有限公司生產(chǎn)）；恒溫毯（型號TT160X80-1，張家港市科興碳纖維制品有限公司生產(chǎn)）。

1.3 分組與造模 SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、丹紅注射液組和丁苯酞組，每組5只。參考Longa等［17]報道的改良線栓法及文獻［18]，簡要方法如下。隨機選取雄性SD大鼠，術(shù)前12 h禁食，但不禁水，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，肌肉注射特耐1.4 mg/kg止痛。經(jīng)右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈將線栓入顱，并順其推進18～22 mm（自頸總動脈分叉處計算），稍遇阻力時即可停止前進，可造成大腦中動脈（MCA）血流的阻斷。缺血1 h后緩慢拔出線栓進行再灌注。另設(shè)假手術(shù)組，結(jié)扎右側(cè)頸總動脈近端及遠端，不插入線栓。大鼠手術(shù)中注意保溫，均放置于恒溫毯上，直至術(shù)后清醒。

1.4 給藥方法 給藥劑量按大鼠與人體表面積等效劑量折算，丁苯酞注射液組按照成人用量［50 mg/60（kg·d），靜脈滴注，每日2次，每次25 mg]的6.25倍，計算大鼠用量為0.52 mg/100（g·d）。丹紅注射液組按照成人用量［40 mL/60 （kg·d）]的 6.25 倍，計算大鼠用量為0.42 mL/100（g·d）。分別于手術(shù)前0.5 h和再灌注即刻、再灌注后3、6、18 h尾靜脈注射相應(yīng)藥物各1次。假手術(shù)組和模型組大鼠則在同樣時間點注射無菌0.9%氯化鈉注射液 0.42 mL/100 （g·d）。

1.5 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分［17]在大鼠清醒后于再灌注23 h（術(shù)后24 h）觀察神經(jīng)缺損程度，由3人判斷、按4分制進行行為學(xué)計分。0分：無障礙；1分：不能完全伸左側(cè)前肢；2分：向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向左側(cè)傾倒；4分：意識不清，無自主活動。

1.6 大鼠舌象圖像采集和分析 拍攝部位：舌腹面、舌背面。大鼠處于深麻醉狀態(tài)下取仰臥位，用鑷子輕輕夾住大鼠舌尖從左輕輕拉出，直至露出舌根部，使整個舌體與大鼠軀干呈直線或有小于15°的夾角。于術(shù)后24 h約下午4∶00在同一室內(nèi)同一日光燈下觀察大鼠舌象，用數(shù)碼相機并配合標(biāo)準(zhǔn)色卡拍照。應(yīng)用Photoshop 5.0軟件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)色卡對所有照片進行校正，然后分析計算舌色的校正紅色值（R）、校正綠色值（G）、校正藍色值（B）。校正R值＝（標(biāo)準(zhǔn)色卡標(biāo)準(zhǔn)R值-標(biāo)準(zhǔn)色卡標(biāo)準(zhǔn)黑色值）×（舌象R值-標(biāo)準(zhǔn)色卡實際黑色值）/（標(biāo)準(zhǔn)色卡實際R值-標(biāo)準(zhǔn)色卡實際黑色值）。校正G值＝（標(biāo)準(zhǔn)色卡標(biāo)準(zhǔn)G值-標(biāo)準(zhǔn)色卡標(biāo)準(zhǔn)黑色值）×（舌象G值-標(biāo)準(zhǔn)色卡實際黑色值）/（標(biāo)準(zhǔn)色卡實際G值-標(biāo)準(zhǔn)色卡實際黑色值）。校正B值＝（標(biāo)準(zhǔn)色卡標(biāo)準(zhǔn)B值-標(biāo)準(zhǔn)色卡標(biāo)準(zhǔn)黑色值）×（舌象B值-標(biāo)準(zhǔn)色卡實際黑色值）/（標(biāo)準(zhǔn)色卡實際B值-標(biāo)準(zhǔn)色卡實際黑色值）。舌背面舌下脈絡(luò)顯色長短分級計分標(biāo)準(zhǔn)［16]如下：舌下脈絡(luò)色澤紅潤，顯色約1/3舌體長計0分；舌下脈絡(luò)色澤紫暗，顯色大于1/3小于1/2舌體長計1分；舌下脈絡(luò)色澤紫暗，顯色約1/2舌體長計2分；舌下脈絡(luò)色澤紫黑，血管明顯增粗，顯色約2/3舌體長計3分。

1.7 腦梗死體積測算 術(shù)后24 h，觀察舌象、神經(jīng)行為學(xué)評分結(jié)束后，大鼠斷頭取腦，-20℃冰箱冷凍10～15 min，作均勻冠狀切片 6片（厚約 2 mm），用 2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）37 ℃染色 13 min。 未缺血腦組織顏色為玫瑰紅色，缺血區(qū)變白色。數(shù)碼相機拍照，輸入電腦，用Image J圖像分析軟件計算腦片的梗死面積。分析計算每一腦片正常側(cè)及缺血側(cè)腦半球TTC 染紅（未缺血區(qū)）的面積，參照文獻的方法［19]，將兩者相減得到校正后的缺血面積，以消除腦水腫對梗死體積的影響。然后將每一腦片的缺血面積乘以腦片厚度，再將各腦片數(shù)值相加，得到全腦梗死體積的近似值，最后除以正常側(cè)腦半球體積，得到梗死體積百分比。梗死體積百分數(shù)計算公式為（左側(cè)未梗面積之和-右側(cè)未梗面積之和）/左側(cè)未梗面積之和×100%

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布及方差齊性檢驗后進行方差分析，統(tǒng)計分析工具為SPSS 17.0軟件包，計量資料以 （±s）表示。相關(guān)性分析也采用SPSS17.0軟件包進行pearson相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 缺血性中風(fēng)模型大鼠舌色變化與梗死灶體積的相關(guān)性 見圖1～圖3。采用SPSS軟件分別分析缺血性中風(fēng)模型大鼠舌色與TTC染色梗死灶大小的相關(guān)性，缺血性中風(fēng)模型大鼠舌色的校正R值、校正G值、校正B值與TTC染色腦梗死體積均密切相關(guān)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（分別為P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。 缺血性中風(fēng)大鼠舌下脈絡(luò)與TTC染色腦梗死體積的相關(guān)性分析差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 缺血性中風(fēng)大鼠舌色的校正R值與TTC染色腦梗死體積的相關(guān)性

圖2 缺血性中風(fēng)大鼠舌色的校正G值與TTC染色腦梗死體積的相關(guān)性

圖3 缺血性中風(fēng)大鼠舌色的校正B值與TTC染色腦梗死體積的相關(guān)性

2.2 各組大鼠腹面舌色的變化 見圖4。假手術(shù)組大鼠舌色淡紅，缺血性中風(fēng)模型組大鼠舌色偏暗，丁苯酞注射液組大鼠舌色改善明顯，丹紅注射液組大鼠的舌色也明顯得到改善。

圖4 各組大鼠腹面舌色的變化

2.3 各組大鼠舌色校正R、G、B值的比較 見表1。舌色分析結(jié)果顯示，缺血性中風(fēng)大鼠模型組舌色的校正紅色值（R值）、校正綠色值（G值）、校正藍色值（B值）均顯著低于假手術(shù)組大鼠（均P＜0.01）。丁苯酞組大鼠舌色校正R、G、B值顯著高于模型組（分別為P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05）。 丹紅注射液組大鼠舌色校正 R、G、B值顯著高于模型組，趨向正常水平（分別為P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05）。丹紅注射液組與丁苯酞組大鼠的舌色校正R、G、B值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 各組大鼠舌色的校正R、G、B值比較（±s）

表1 各組大鼠舌色的校正R、G、B值比較（±s）

與缺血性中風(fēng)模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01。 下同

組 別 n 校正B值校正R值 校正G值假手術(shù)組 5 145.9±13.6缺血性中風(fēng)模型組 5 97.1±1.8△△丹紅注射液組 5 132.6±14.0*201.8±12.0 114.9±11.2 159.5±10.2△△ 82.4±10.9△△188.3±11.0** 104.6±17.5*丁苯酞注射液組 5 119.8±8.0*181.7±10.0** 99.8±7.1*

2.4 各組大鼠背面舌象的變化 見圖5，表2。假手術(shù)組大鼠舌下脈絡(luò)色澤紅潤，顯色小于1/3舌體長。模型組大鼠舌下脈絡(luò)色澤紫暗，有的血管明顯增粗，顯色大于1/3舌體長，最長約2/3舌體長。丁苯酞注射液組大鼠舌下脈絡(luò)色澤較模型組明顯改善，顯色長度縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），趨向假手術(shù)組。丹紅注射液組大鼠舌下脈絡(luò)色澤較模型組改善，顯色長度縮短，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），也趨向假手術(shù)組。丹紅注射液組與丁苯酞注射液組大鼠的舌下脈絡(luò)評分無明顯差異（P＞0.05）。

圖5 缺血性中風(fēng)大鼠背面舌象圖

表2 各組大鼠舌下脈絡(luò)評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠舌下脈絡(luò)評分比較（分，±s）

組 別 n 舌下脈絡(luò)評分假手術(shù)組 5缺血性中風(fēng)模型組 5丹紅注射液組 5 0 2.40±0.55 1.20±0.45**丁苯酞注射液組 50.80±0.45**

2.5 缺血性中風(fēng)大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分比較 見表3。與缺血性中風(fēng)模型組大鼠比較，丁苯酞注射液組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分明顯下降（P＜0.05）。丹紅注射液組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分也明顯下降（P＜0.05）。丹紅注射液組與丁苯酞注射液組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分無明顯差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分比較（分，±s）

表3 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分比較（分，±s）

組 別 n 神經(jīng)行為學(xué)評分假手術(shù)組 5缺血性中風(fēng)模型組 5丹紅注射液組 5 0 2.20±0.45 1.40±0.55*丁苯酞注射液組 51.20±0.45*

2.6 各組大鼠腦梗死體積比較 見表4。假手術(shù)組大鼠的大腦TTC染色無梗死灶，缺血性中風(fēng)模型組大鼠大腦TTC染色可見明顯梗死灶，丁苯酞組大鼠的腦梗死得到明顯改善，梗死灶明顯縮?。≒＜0.01）。丹紅注射液組大鼠的腦梗死得到明顯改善，梗死灶縮?。≒＜0.01）。丹紅注射液組與丁苯酞組大鼠的腦梗死體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠腦梗死體積比較（%，±s）

表4 各組大鼠腦梗死體積比較（%，±s）

組 別 n 腦梗死體積假手術(shù)組 5缺血性中風(fēng)模型組 5丹紅注射液組 5 0 43.54±1.89 13.60±0.41**丁苯酞注射液組 58.15±0.18**

3 討 論

缺血性中風(fēng)作為一種中老年人常見的急癥，具有高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率和高花費率，聯(lián)合中醫(yī)中藥常能獲得更好的療效并降低治療費用。血瘀證是缺血性中風(fēng)的主要證型。舌象作為臨床表征是血瘀證的重要依據(jù)。舌色的紅色值（R值）、綠色值（G值）、藍色值（B值）越大，則越接近于其代表的顏色。缺血性中風(fēng)大鼠舌色接近紫暗，校正R值、G值、B值均顯著低于假手術(shù)組大鼠（均P＜0.01）。我們觀察了缺血性中風(fēng)模型大鼠舌色校正R、G、B值與腦梗死體積的關(guān)系，結(jié)果顯示均密切相關(guān)。證實了缺血性中風(fēng)模型大鼠血瘀證相關(guān)舌象具有實際應(yīng)用價值，適合用來觀察丹紅注射液對其血瘀證相關(guān)舌象的干預(yù)研究。也為其他活血化瘀藥的療效觀察提供模型和方法。本文證實了丹紅注射液對缺血性中風(fēng)大鼠血瘀證相關(guān)舌象具有明顯的改善作用，且舌象與腦梗死體積均密切相關(guān)，這也為臨證辨證施治提供了科學(xué)依據(jù)。

目前有關(guān)大鼠舌象的研究，宏觀和微觀觀察方面均取得了一定的進展，利用了計算機軟件等輔助手段，在技術(shù)層面觀察方式已經(jīng)比較完善。特別是應(yīng)用數(shù)碼相機拍攝大鼠舌象后，通過Image-proplus醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件分析大鼠舌色，可以更客觀地觀察舌色的改變。但是病理狀態(tài)舌象僅通過經(jīng)驗判斷，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)［19]。為了客觀、定量地評價缺血性中風(fēng)模型大鼠的舌象變化，我們在舌象采集過程中也注意在當(dāng)日同一時間點、同一地點、同一日光燈下進行拍攝，以避免光線不同的影響。在采集過程中，我們應(yīng)用了標(biāo)準(zhǔn)色卡，在一定程度上排除了拍攝角度、距離對舌象的影響［20]。我們還采用了舌色校正公式進行計算以獲得校正R值、校正G值和校正B值，且驗證了其與腦梗死體積均相關(guān)，因此我們的舌象采集和分析方法是比較客觀和可靠的。本文為中醫(yī)證候動物模型評價提供了依據(jù)，為中醫(yī)望診內(nèi)容的血瘀舌象的客觀化、定量化提供了一種較為可靠的方法。

本文采用的是改良Longa法制備的缺血性中風(fēng)大鼠模型，通過線栓法入顱導(dǎo)致大腦中動脈（MCA）血流的阻斷，造成了確定可控的缺血性腦梗死灶，能很好地模仿缺血性中風(fēng)患者的病理狀態(tài)，適合觀察藥物的作用及其機制。我們在前期的實驗和PET檢查均發(fā)現(xiàn)丹紅注射液能有效治療缺血性中風(fēng)大鼠［5-6]，ELISA結(jié)果顯示丹紅注射液能提高6-keto-PGF1α水平、SOD活性、血漿t-PA水平，同時降低MDA和PAI活性，降低TNF-α和IL-1β表達，免疫組化結(jié)果顯示丹紅注射液能促進Bcl-2表達，降低Bax表達，促進神經(jīng)元成熟，NeuN表達增加，促進神經(jīng)膠質(zhì)細胞表達GFAP，促進vWF表達，降低GLUT1表達。

在此基礎(chǔ)上，本文觀察到與缺血性中風(fēng)模型組大鼠比較，丹紅注射液組大鼠舌色校正R、校正G、校正B值顯著高于模型組，說明丹紅注射液可以顯著改善大鼠舌色，使其更接近于假手術(shù)大鼠。丹紅注射液組舌背面舌下脈絡(luò)色澤較模型組改善，顯色長度縮短。這些從舌象的角度說明了丹紅注射液具有活血化瘀的作用。丹紅注射液組神經(jīng)行為學(xué)評分也明顯下降，腦梗死灶縮小（P＜0.05或P＜0.01）。丹紅注射液組與陽性對照丁苯酞注射液組的各指標(biāo)比較無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），這說明DHI與丁苯酞注射液的療效相當(dāng)。至于缺血性中風(fēng)大鼠舌下脈絡(luò)與TTC染色梗死體積的相關(guān)性分析無顯著性差異（P＝0.051）。這可能與舌下脈絡(luò)評分較為主觀，且動物數(shù)較少有關(guān)。我們將進一步擴大動物數(shù)，再選擇更為客觀的舌部組織的分子學(xué)指標(biāo)，深入研究丹紅注射液對缺血性中風(fēng)大鼠血瘀相關(guān)舌象的改善作用。