柏正平劉 雨劉 芳 譚小寧譚電波鄧秀娟 李仲普 劉 俊 侯公瑾 譚光波△

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006）

氣道黏液高分泌是慢性阻塞性肺疾病 （COPD）重要病理生理特征之一。黏液高分泌可導致氣道阻塞、氣流受限、通風灌注錯配及氣體交換減值與細菌定植，從而加速FEV1下降過程［1]。COPD屬中醫(yī)“喘證”范疇，我們認為“痰飲”貫穿其始發(fā)生發(fā)展始終。現(xiàn)代研究認為，黏蛋白MUC5AC、MUC5B是痰液分子物質基礎，痰飲的實質為氣道黏液高分泌［2]。金水六君煎出自《景岳全書》，主治咳嗽嘔惡，喘逆多痰，臨床上治療慢性支氣管炎咳嗽咯痰取得較好的效果，為進一步闡明金水六君煎治療痰飲的作用機制，本研究以氣道黏液高分泌為切入點，觀察金水六君煎及其拆方含藥血清對體外人肺腺癌A549細胞黏蛋白MUC5AC、MUC5B表達的影響，探討金水六君煎治療氣道黏液高分泌的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠40只，鼠齡10～12周，體質量（220±20）g，由湖南省斯萊克實驗動物中心提供，許可證號SYXK（湘）2016-0002。 飼養(yǎng)于溫度 22～26 ℃，相對濕度40%～70%，通風換氣8～12次/h的環(huán)境。

1.2 細胞株

人類腺癌肺泡基底上皮細胞（A549），購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.3 實驗藥物

金水六君煎組成：熟地黃15 g，當歸6 g，半夏6 g，陳皮4.5 g，茯苓6 g，炙甘草3 g，生姜5～7片。 金水六君煎拆方養(yǎng)陰組：熟地黃15 g，當歸6 g。金水六君煎拆方化痰組：半夏6 g，陳皮4.5 g，茯苓6 g，炙甘草3 g。中藥飲片購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院。

1.4 試劑與儀器

1）試劑：人中性粒細胞彈性蛋白酶（HNE）（英國Abcam，ab91099）；DMEM（HyClone，批號 SH30243.01）；胎牛血清（Pansera ES，美國）；0.25%胰酶消化液（Gibco，美國）；1%青霉素和鏈霉素 （上?；鄯f生物技術有限公司，SV30010）；MUC5AC ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，Y15037320）；MUC5B ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，Y10037321）；小鼠MUC5AC、MUC5B 單克隆抗體（SantaCruz）；Tris、APS、SDS、TEMED、Tween-20、丙烯酰胺、甘氨酸（美國 Sigma）；HRP 羊抗鼠 IgG（美國 Proteintech），RIPA 裂解液/蛋白酶抑制劑，SuperECL Plus超敏發(fā)光液（美國Thermo pierce）；上樣緩沖液6X（上海碧云天）；逆轉錄試劑盒（北京康為世紀）；Trizol（Invitrogen）；逆轉錄試劑盒、UltraSYBR Mixture（北京康為世紀）；SYBRGREEN I核酸染料（北京普博欣生物）。2）儀器：細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher）；倒置顯微鏡 （北京同舟同德，DSZ2000）；全自動酶標儀（DiaSorin，MAX3000）；臺式冷凍離心機（上海新力，Neofuge23R）；搖床（江蘇其林貝爾，TS-92）；電泳儀（美國 Biorad，164-5050）；轉膜儀（北京六一，DYCZ-40A）；全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（英國 Syngene G 公司）； 熒光 PCR 板（Thermo，SPL0960）；熒光定量 RCP 儀（Thermo，PIKO REAL 96）。

1.5 含藥血清制備

按照隨機數(shù)字表法將40只雄性SD大鼠平均分為空白組、金水六君煎組、養(yǎng)陰組、化痰組，每組10只。大鼠給藥劑量參考人和動物體表面積折算的等效劑量比例表，大鼠的等效劑量相當于人的6.3倍，每只動物每千克體質量給藥量按臨床人（70 kg）的等效量，并擴大5倍。按照10 mL/kg灌胃量，大鼠每天灌胃2次，兩次間隔時間為2 h，連續(xù)3 d，空白對照組灌胃等體積生理鹽水。末次給藥1 h后無菌條件下腹主動脈采血，3 000 r/min離心5 min，取血清，同組血清相混合，置于56℃水浴滅活補體30 min，過濾器（0.22 μm孔徑）過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細胞培養(yǎng)

人類腺癌肺泡基底上皮細胞 （A549）培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2日換液1次，按1∶3 比例傳代。

1.7 細胞分組及干預

對數(shù)期細胞進行實驗，以每孔1×105/mL密度接種于6孔板，加入DMEM培養(yǎng)基+10%FBS，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h至細胞貼壁。去原培養(yǎng)基，加入無血清DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱饑餓培養(yǎng)24 h。去原培養(yǎng)基，以孔為單位，分為正常對照組（加入20%空白組大鼠血清）、模型組（加入20%空白組大鼠血清和終濃度為25 nmol/L HNE）、金水六君煎組（加入20%金水六君煎含藥血清和終濃度為25 nmol/L HNE）、養(yǎng)陰組（加入20%養(yǎng)陰組含藥血清和終濃度為25 nmol/L HNE）、化痰組（加入20%化痰組含藥血清和終濃度為25 nmol/L HNE），每組設3個復孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后收集細胞進行檢測。

1.8 觀察項目

1.8.1 CCK-8法測定細胞活性 取對數(shù)生長期的A549細胞稀釋吹打成濃度為5×103/mL的單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔細胞懸液量為100 μL，設立空白對照孔（加培養(yǎng)基100 μL），實驗分空白組、模型組、金水六君煎組、養(yǎng)陰組、化痰組，每組復孔數(shù)為3，各組細胞均在37℃，5%CO2環(huán)境下共同孵育3 d，按照試劑盒說明書，每孔加CCK-8溶液10 μL，溫育1 h后，酶標儀測定450 nm波長處各孔的吸光度（OD值）。

1.8.2 Realtime-PCR檢測基因表達 采用Trizol法提取細胞總RNA，1%變性瓊脂糖凝膠鑒定，紫外分光光度計測定濃度及純度，根據(jù) HiFiScript cDNA Synthesis Kit進行逆轉錄。在NCBI上搜索目的基因的序列，運用primer5軟件設計引物，引物序列：actin：上游5′-ACCCTGAAGTACCCCATCGAG-3′，下游 5′-AGC ACA GCCTGGATAGCAAC-3′，引物長度 224 bp；MUC5AC：上游 5′-ACCAGCATCTTCATCAACCT-3′， 下游 5′-TT CCCAAACTCCAGCACGTC-3′， 引物長度 137 bp；MUC5B： 上游 5′-GCCCACATCTCCACCTATGAT-3′，下游 5′-GCAGTTCTCGTTGTCCGTCA-3′， 引物長度141 bp。DEPC水溶解引物至終濃度10 pmol/μL。按照UltraSYBRMixture合成試劑盒建立30 μL實時定量PCR反應體系，熒光定量PCR儀設定如下：95℃5 s變性，60℃ 60 s退火、延伸，循環(huán)40次。以各組β-actin作為內(nèi)參，應用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.8.3 Western blotting檢測蛋白 采用RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒操作，測定蛋白濃度。樣品孔加入20 μL已變性蛋白，SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳，濕轉法將蛋白質轉移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉，小鼠MUC5AC、MUC5B單克隆抗體（1∶200），β-actin（1∶5 000），4 ℃冰箱孵育過夜；辣根過氧化物酶標記的HRP羊抗鼠IgG（1∶5 000），室溫下孵育1.5 h，膜充分洗滌后用ECL化學發(fā)光液膜孵育3 min，暗室曝光沖印，BioRad成像系統(tǒng)分析電泳條帶，QuantityOne圖像分析軟件計算2個基因與βactin比值。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組A549細胞活性的比較

見表1。與空白組比較，模型組細胞活性降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，金水六君煎組，養(yǎng)陰組、化痰組對細胞活性無明顯變化（P＞0.05）。

表1 各組A549細胞活性比較（±s）

表1 各組A549細胞活性比較（±s）

組 別 n空白組 3模型組 3金水六君煎組 3 450 nm吸光光度值（OD值）0.85±0.10 0.71±0.09 0.75±0.12養(yǎng)陰組 3 0.84±0.10化痰組 3 0.78±0.04

2.2 各組A549細胞MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表達的比較

見表2。與空白組比較，模型組黏蛋白MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA 表達明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，金水六君煎組及養(yǎng)陰組MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表達明顯降低（P＜0.05），化痰組較模型組呈減少趨勢，但差異無明顯統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組A549細胞黏蛋白MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表達比較（±s）

表2 各組A549細胞黏蛋白MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表達比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組 別 n MUC5AC mRNA MUC5B mRNA空白組 3 1.26±0.24 0.74±0.27模型組 3 2.33±0.48△ 1.70±0.36△金水六君煎組 3 1.39±0.32* 0.87±0.23*養(yǎng)陰組 3 1.47±0.11* 0.76±0.08*化痰組 3 2.19±0.39△ 1.27±0.08△

2.3 各組A549細胞MUC5AC、MUC5B蛋白表達的比較

見表3，圖1。與空白組比較，模型組 MUC5AC、MUC5B蛋白表達顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，金水六君煎MUC5AC、MUC5B蛋白表達降低 （P＜0.05或P＜0.01）；化痰組MUC5AC、MUC5B蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；養(yǎng)陰組較模型組 MUC5AC、MUC5B 蛋白表達減少，但差異無明顯統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組A549細胞黏蛋白MUC5AC、MUC5B蛋白表達比較（±s）

表3 各組A549細胞黏蛋白MUC5AC、MUC5B蛋白表達比較（±s）

組 別 n MUC5AC MUC5B空白組 3 0.27±0.06 0.32±0.04模型組 3 0.52±0.06△△ 0.48±0.05△△金水六君煎組 3 0.35±0.06* 0.25±0.05**養(yǎng)陰組 3 0.44±0.06△ 0.42±0.05△化痰組 3 0.29±0.05** 0.20±0.05△**

圖1 各組A549細胞黏蛋白MUC5AC、MUC5B蛋白電泳條帶

3 討 論

氣道黏液高分泌是COPD重要病理生理特征，在成人呼吸道分泌的黏蛋白中，MUC5AC和MUC5B是主要分泌物，氣道黏液高分泌過程中MUC5AC和MUC5B表達明顯升高。中醫(yī)學認為痰飲貫穿COPD始終，現(xiàn)代醫(yī)學與中醫(yī)學進行較為全面的研究，認為“氣道黏液高分泌”就是中醫(yī)學“痰飲”［3-4]。金水六君煎出自《景岳全書》，主治肺腎虛寒，水泛為痰，及年邁陰虛、氣血不足外受風寒，咳嗽嘔惡多痰，喘急等證，臨床上治療老年慢性咳嗽咯痰具有顯著的效果。其組方由二陳湯 （半夏、陳皮、茯苓、甘草）及貞元飲（熟地黃、當歸、炙甘草）組合而成，其中二陳湯為治一切痰飲之通劑，貞元飲補精血固下元，使腎水不上泛為痰。全方利濕化痰與滋腎養(yǎng)陰并行，濕痰無以生成，肺無濁痰則清寧肅降，肺腎之陰得復則氣能歸根，而咳喘諸癥得除［5-6]。藥效學研究能促進纖毛運動和排痰量［7]。

目前國內(nèi)外用于構建體外黏液高分泌的細胞模型主要有人氣道上皮細胞的黏液上皮細胞癌細胞株NCI-H292、肺腺癌細胞株A549、人支氣管上皮細胞16HBE。HNE和LPS是黏液高分泌的主要誘導劑［8-12]。HNE是目前公認最強促黏液分泌劑，可同時誘導MUC5AC和MUC5B表達增高。蘭箭等研究發(fā)現(xiàn)，A549同時表達MUC5AC和MUC5B，且對人HNE的刺激誘導呈良好的量效關系［13]。高健美、楊娟等［11，14]采用50 nmol/L HNE誘導A549細胞黏液高分泌，均發(fā)現(xiàn)MUC5AC表達明顯升高。因此，本研究采用人中性粒細胞彈性蛋白酶誘導A549細胞建立體外氣道黏液高分泌細胞模型。

本研究采用終濃度為25 nmol/L HNE誘導A549細胞，同時用正常大鼠及含藥血清干預24 h，發(fā)現(xiàn)各組細胞活性無明顯差異，模型組MUC5AC、MUC5B基因與蛋白表達較正常組均顯著升高，提示HNE對細胞增殖及活性無影響，HNE誘導可成功建立黏液高分泌細胞模型。與模型組比較，金水六君煎組及養(yǎng)陰組能顯著降低MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表達，金水六君煎組及化痰組能顯著降低MUC5AC、MUC5B蛋白表達，提示金水六君煎在轉錄水平及翻譯水平抑制黏蛋白MUC5AC、MUC5B基因表達，金水六君煎中養(yǎng)陰成分主要通過轉錄水平抑制MUC基因表達，金水六君煎中化痰成分主要通過翻譯水平抑制MUC蛋白表達。周建龍等研究發(fā)現(xiàn)高濃度半夏提取物能通過抑制MUC5AC表達，上調AQP5表達抑制大鼠氣道黏液高分泌狀態(tài)，半夏燥濕化痰可能是金水六君煎治療氣道黏液高分泌主要藥效成分［15]。

綜上，金水六君煎及其拆方含藥血清可通過抑制黏蛋白基因及蛋白表達改善HNE誘導的細胞黏液高分泌，為臨床金水六君煎治療COPD高黏液分泌提供理論基礎與臨床指導。但金水六君煎及其拆方調控黏蛋白基因與蛋白表達的信號通路及作用機制還需要進一步深入研究。