經(jīng)灑灑 郁吉鋒 宋騰蛟 楊蔣舜 高建莉 袁小鳳

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053；2.浙江理工大學(xué)，浙江杭州 310018）

0 引言

元胡Corydalis turtschaninovii 又名延胡索、玄胡，為罌粟科紫堇屬多年生草本植物，與白術(shù)、芍藥、貝母等并稱(chēng)“浙八味”，為大宗常用中藥。性溫，味辛苦，是活血化瘀、行氣止痛的良藥。在我國(guó)，元胡主要分布在安徽、江蘇、浙江、陜西等地，其中，在浙江省東陽(yáng)市已有1200多年的種植歷史，逐漸形成了特有的品質(zhì)和地道產(chǎn)區(qū)，中藥材向來(lái)注重道地性，然而隨著產(chǎn)業(yè)的需求和種植規(guī)模的擴(kuò)大，就需要不斷的引入新種源，這勢(shì)必會(huì)對(duì)藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)造成不同程度的影響。中藥材質(zhì)量可因產(chǎn)地不同而存在明顯差異，這些與植物、土壤和微生物所構(gòu)建的土壤生態(tài)系統(tǒng)密切相關(guān)。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，在土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化循環(huán)、系統(tǒng)穩(wěn)定性、抗干擾能力以及可持續(xù)利用中占據(jù)主導(dǎo)地位。有研究表明，土壤微生物不僅能促進(jìn)植物對(duì)礦質(zhì)元素的吸收，還具有增強(qiáng)植物抵抗生物和非生物脅迫能力等作用。因此，中藥材道地性應(yīng)研究不可忽視的根際微生物。本文選擇元胡道地產(chǎn)區(qū) (浙江東陽(yáng)) 和非道地產(chǎn)區(qū) (陜西漢中、浙江磐安) 藥用元胡為研究對(duì)象，運(yùn)用Miseq測(cè)序技術(shù)，研究不同種源藥用元胡根際土壤細(xì)菌菌的多樣性，旨在為中藥材道地性理論提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

試驗(yàn)田設(shè)在東陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)基地。本實(shí)驗(yàn)選擇不同種源的元胡種，主要包括金華市東陽(yáng)市老區(qū)-東門(mén)村、金華市東陽(yáng)市老區(qū)-馬宅鎮(zhèn)、金華市東陽(yáng)市新區(qū)-南馬鎮(zhèn)、金華市東陽(yáng)市老區(qū)-龍泉村、金華市磐安-冷水鎮(zhèn)、陜西-漢中市6個(gè)種源。于2017年9月25日將元胡種植在實(shí)驗(yàn)田中，按上述不同種源將實(shí)驗(yàn)分為6組，即道地-東門(mén)，道地-馬宅，道地-南馬，道地-龍泉，非道地-冷水，和非道地-漢中組。每組10株，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。于2018年5月4日元胡采挖時(shí)，采集其塊莖，收集根際土。

1.2 土壤細(xì)菌多樣性檢測(cè)

采用Omega試劑盒提取土壤DNA，具體步驟按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。得到的DNA 做為模板，采用Ependorf的PCR system2700 型基因擴(kuò)增儀，以Miseq測(cè)序平臺(tái)的V3-V4通用引物（融合341F引物：CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN (barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG融合805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAG AATTCCAGACTACHVGGGTATC TAATCC），進(jìn)行擴(kuò)增。采用普通PCR策略：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，45℃退火20 s，65℃延伸20s(重復(fù)5個(gè)循環(huán)) ；再以94℃變性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s (重復(fù)5個(gè)循環(huán)) 最后再72℃延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將目的產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒進(jìn)行割膠回收，回收產(chǎn)物用Qubit2.0定量，根據(jù)測(cè)得的DNA濃度，將所有樣品按照1：1的比例進(jìn)行混合；混合后充分震蕩均勻。送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行Miseq測(cè)序。

表1 不同處理組土壤的細(xì)菌多樣性及豐富度

表2 不同處理組門(mén)水平的分類(lèi)及百分含量

表3 不同處理組優(yōu)勢(shì)菌屬的分類(lèi)及百分含量

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

Miseq數(shù)據(jù)采用Flash軟件融合雙末端序列，而后通過(guò)各樣品barcode使數(shù)據(jù)回歸樣品，并對(duì)各樣本序列做QC，去除非靶區(qū)域序列及嵌合體。物種分類(lèi)，采用RDP classifier將序列進(jìn)行物種分類(lèi)，對(duì)每個(gè)樣本和每個(gè)物種單元分類(lèi)進(jìn)行序列豐度計(jì)算構(gòu)建樣本和物種分類(lèi)單元序列豐度矩陣。OTU聚類(lèi)，將多條序列根據(jù)其序列之間的距離來(lái)對(duì)它們進(jìn)行聚類(lèi)，后根據(jù)序列之間的相似性作為域值分成操作分類(lèi)單元（OTU）。α多樣性分析，計(jì)算各種物種多樣性指數(shù)，衡量樣本物種多樣性。β多樣性分析，β多樣性指標(biāo)用來(lái)比較多組樣本之間的差別度量，將代表性序列比對(duì)參考核心16S rDNA序列，根據(jù)多序列隊(duì)列構(gòu)建代表性序列為節(jié)點(diǎn)的進(jìn)化樹(shù)，利用Unifrac算法計(jì)算樣本距離、樣本聚類(lèi)、樣本PCOA。

2 結(jié)果

2.1 根際土壤細(xì)菌豐度及多樣性的種源差異

基于Miseq測(cè)序結(jié)果，根據(jù)OTU的豐度信息，使用稀疏曲線(xiàn)對(duì)元胡根際細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行評(píng)估。稀疏曲線(xiàn)顯示當(dāng)樣本測(cè)序的序列較少時(shí)，OTU數(shù)劇增，而隨著測(cè)序量的不斷增大，OTU數(shù)目趨于平緩，表示各個(gè)樣本達(dá)到了環(huán)境樣品的取樣深度，測(cè)到了絕大多數(shù)種類(lèi)的微生物。

利用Miseq測(cè)序技術(shù)檢測(cè)元胡根際土壤細(xì)菌多樣性及組成（表1），OTUs和ACE是菌群豐度的評(píng)估指標(biāo)，Shannon指數(shù)是細(xì)菌多樣性的評(píng)估指標(biāo)。從表1可知，道地各種源之間細(xì)菌豐度及多樣性水平無(wú)顯著性差異，而陜西漢中種引種到東陽(yáng)后，其細(xì)菌多樣性水平與豐度相對(duì)磐安種源有所下降，但與東陽(yáng)種源之間無(wú)顯著性差異，而磐安冷水相對(duì)于東陽(yáng)南馬種源的細(xì)菌豐度及多樣性水平無(wú)顯著性差異。由此可知，不同種源之間元胡根際細(xì)菌多樣性水平整體差異不大，影響元胡細(xì)菌多樣性或許有其他相關(guān)因素。

圖1 不同處理組根際細(xì)菌主成分分析圖

2.2 根際土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)的種源差異

2.2.1 門(mén)水平上的差異

對(duì)元胡根際細(xì)菌門(mén)的多樣性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，本研究共有34個(gè)菌門(mén)被鑒定，結(jié)果如表2所示。在所有樣品中，變形菌是豐度最高的門(mén)類(lèi)，分別占有總序列數(shù)的37.4%-42.5%，其次為酸桿菌、放線(xiàn)菌和厚壁菌；24個(gè)菌門(mén)為6個(gè)種源共有，占總菌門(mén)的70%，分別為擬桿菌、疣微菌、芽單胞菌、厚壁菌、浮霉菌、綠彎菌等。分析發(fā)現(xiàn)，這些共有菌門(mén)在不同種源間均無(wú)顯著性差異。當(dāng)然，有些種源亦有特有菌，如梭桿菌門(mén)為非道地漢中組特有，泉古菌為非道地冷水組特有，不過(guò)這些特有菌的豐度極低，所占比例均為0.01%。總之，不同種源元胡根際細(xì)菌門(mén)水平上無(wú)顯著性差異。

2.2.2 屬水平上的差異

從屬水平上分析可知，6個(gè)種源分別具有637、580、604、652、620及680個(gè)屬，每個(gè)種源屬組成差異不大，選取每個(gè)處理組中排名前20的屬作為優(yōu)勢(shì)菌屬（表3）。對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，10個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬為其共有，分別為Gp1、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、Rhizomicrobium、Gaiella、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、Gp3、Gp2、Rudaea和伯克氏菌屬 (Burkholderia)，其中，Gp1含量最高，所占比例為7.3%-8.1%，其次為芽單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和Gaiella，所占比例分別為4.4%-4.8% 、2.9%-3.6%和2.8%-3.7%，分析發(fā)現(xiàn)，排名前三的Gp1、芽單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬在6個(gè)種源間所占比例均無(wú)顯著性差異；除上述含量相對(duì)較高的優(yōu)勢(shì)菌屬之外，我們發(fā)現(xiàn)，假單胞菌、伯克氏菌屬和固氮菌慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）也是他們的優(yōu)勢(shì)菌屬，對(duì)比之后發(fā)現(xiàn)，這些菌屬在不同種源之間均無(wú)顯著性差異；而6個(gè)種源間優(yōu)勢(shì)菌屬的組成也存在一定的差異，這主要體現(xiàn)在不同種源之間擁有其特有屬，如：Rhodoplanes、Nitrosospira為道地產(chǎn)區(qū)特有，Dongia、Tumebacillus、Aquisphaera只出現(xiàn)在磐安種中，而Chitinophaga和Thermosporothrix卻僅在漢中組出現(xiàn)，但這些優(yōu)勢(shì)菌屬豐度較低，所占的比例均小于1%。由此可知，不同種源元胡根際細(xì)菌多樣性在屬水平上整體差異不大。

2.3 主成分分析不同處理組根際細(xì)菌的差異

主成分分析（PCoA）結(jié)果如圖1所示。P1和P2分別解釋了40.1%和12.6%的變異率。由圖可知，6個(gè)種源之間聚為一類(lèi)，沒(méi)有體現(xiàn)差異性，這與OUTs和Shannon指數(shù)一致。

3 討論

道地藥材是傳統(tǒng)的、公認(rèn)的且來(lái)源于特定產(chǎn)地的名優(yōu)正品藥材，是中藥材精粹之所在，也是歷代醫(yī)家防病治病最有力的武器之一。元胡有1200多年的栽培歷史，傳統(tǒng)認(rèn)為浙江東陽(yáng)為元胡的道地產(chǎn)區(qū)，目前認(rèn)為元胡主要產(chǎn)地位于浙江東陽(yáng)和磐安、陜西漢中，而湖北、湖南、江蘇等省區(qū)也有栽培。目前，關(guān)于元胡土壤微生物的研究較少，而圍繞中藥材道地性方面的研究更加缺乏。因此，本研究采用Miseq測(cè)序技術(shù)，研究6個(gè)種源元胡根際細(xì)菌群落的多樣性，以期為中藥材的道地性與根際土壤微生物的相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)。

通過(guò)對(duì)元胡根際細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)，OTU及Shannon指數(shù)均表明元胡根際細(xì)菌多樣性整體差異不大，在門(mén)水平上亦無(wú)顯著性差異，屬水平上整體差異不大，因此，我們得出結(jié)論，不同種源元胡根際細(xì)菌多樣性整體無(wú)顯著性差異，種源對(duì)土壤根際微生物的影響微乎其微。

而不同種源間土壤根際微生物的無(wú)差異性在以往的研究中亦有體現(xiàn)。李國(guó)斌等研究了不同種源蒙古黃芪根際微生物的變化，結(jié)果表明，不同種源根際細(xì)菌及真菌豐度均無(wú)顯著性差異；邵士成等研究了云南元江印楝植物內(nèi)生真菌的種類(lèi)組成，結(jié)果表明，不同地理種源印楝植物內(nèi)生真菌的種類(lèi)組成沒(méi)有明顯差異，但王戈等研究發(fā)現(xiàn)，不同品種的烤煙根際微生物存在差異，苗則彥等人同樣發(fā)現(xiàn)不同品種的黃瓜根際真菌、放線(xiàn)菌數(shù)量存在明顯差異，與我們的研究結(jié)果不同，由此可知，種源對(duì)微生物多樣性的影響會(huì)因物種的不同而產(chǎn)生不同的作用，這可能和物種與微生物的根際互作有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。微生物可以成為藥材植株的內(nèi)生菌，影響藥材植株的次生代謝，如參與合成次生代謝產(chǎn)物或是植株在內(nèi)生菌的刺激下合成更多的防御性化合物，最終成為影響藥材道地性的一個(gè)因素。

同樣的種植環(huán)境，種源的不同并未對(duì)元胡根際細(xì)菌的多樣性產(chǎn)生影響，由此可見(jiàn)，土壤與環(huán)境等相關(guān)因素的作用或許是造成元胡根際細(xì)菌多樣性的主要原因。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，土壤理化特性如顆粒大小、pH值及有機(jī)質(zhì)的含量等因素均會(huì)影響根際微生物的種群結(jié)構(gòu)與功能，而土壤pH值的增加還能在一定程度上改善植物根際微生物的結(jié)構(gòu)，如增加生防菌熒光假單胞菌的數(shù)量；苗翠蘋(píng)等人分析了三七根際土壤中微生物群落的變化與環(huán)境因子之間的關(guān)系，結(jié)果表明，真菌和細(xì)菌的數(shù)量變化均與環(huán)境因子有顯著性關(guān)系，細(xì)菌群落受到了更大的影響，而土壤中的總磷、有效磷、水解氮及pH是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素。同樣，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，浙貝母菌群結(jié)構(gòu)和組成是浙貝母物種與土壤共同作用的結(jié)果；Berg等人同樣認(rèn)為植物物種和土壤類(lèi)型共同決定著根際微生物的結(jié)構(gòu)和功能。因此，我們推測(cè)，種源對(duì)元胡根際細(xì)菌多樣性影響不大，而土壤環(huán)境等因素是決定元胡根際細(xì)菌多樣性的主要因素。

除此之外，通過(guò)對(duì)不同種源的優(yōu)勢(shì)菌屬分析發(fā)現(xiàn)，不同種源間的優(yōu)勢(shì)菌屬假單胞菌（Pseudomonas）、伯克氏菌屬 (Burkholderia)和固氮菌慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）等所占比例并未產(chǎn)生顯著影響。有研究表明，假單胞菌（Pseudomonas）能產(chǎn)生活性物質(zhì)，抗多種植物病害；伯克氏菌屬 (Burkholderia)為根系促生菌（PGPR），其作用在番茄、美洲商陸和籽粒莧等植物中都已證實(shí)；慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）是豆科植物主要的固氮菌，可和豆科植物形成共生體，是陸生系統(tǒng)中固氮主要來(lái)源，這些細(xì)菌對(duì)藥用元胡的生長(zhǎng)乃至元胡的藥材品質(zhì)有著怎樣的影響有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，基于Miseq測(cè)序的方法顯示，東陽(yáng)產(chǎn)區(qū)元胡根際細(xì)菌具有豐富的多樣性，不同種源間元胡根際細(xì)菌多樣性在門(mén)及屬水平上均無(wú)顯著性差異。因此我們得出結(jié)論，種源并不是影響元胡根際細(xì)菌多樣性的主要因素，而土壤環(huán)境等因子的作用或許是決定元胡根際細(xì)菌多樣性的關(guān)鍵因素。除此之外，為了更好地闡明植物-土壤-微生物三者之間的關(guān)系，種源對(duì)元胡產(chǎn)量及品質(zhì)的影響還需進(jìn)一步的研究。