經灑灑 郁吉鋒 宋騰蛟 楊蔣舜 高建莉 袁小鳳

（1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州 310053；2.浙江理工大學，浙江杭州 310018）

0 引言

元胡Corydalis turtschaninovii 又名延胡索、玄胡，為罌粟科紫堇屬多年生草本植物，與白術、芍藥、貝母等并稱“浙八味”，為大宗常用中藥。性溫，味辛苦，是活血化瘀、行氣止痛的良藥。在我國，元胡主要分布在安徽、江蘇、浙江、陜西等地，其中，在浙江省東陽市已有1200多年的種植歷史，逐漸形成了特有的品質和地道產區(qū)，中藥材向來注重道地性，然而隨著產業(yè)的需求和種植規(guī)模的擴大，就需要不斷的引入新種源，這勢必會對藥材的產量和品質造成不同程度的影響。中藥材質量可因產地不同而存在明顯差異，這些與植物、土壤和微生物所構建的土壤生態(tài)系統(tǒng)密切相關。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，在土壤養(yǎng)分的轉化循環(huán)、系統(tǒng)穩(wěn)定性、抗干擾能力以及可持續(xù)利用中占據(jù)主導地位。有研究表明，土壤微生物不僅能促進植物對礦質元素的吸收，還具有增強植物抵抗生物和非生物脅迫能力等作用。因此，中藥材道地性應研究不可忽視的根際微生物。本文選擇元胡道地產區(qū) (浙江東陽) 和非道地產區(qū) (陜西漢中、浙江磐安) 藥用元胡為研究對象，運用Miseq測序技術，研究不同種源藥用元胡根際土壤細菌菌的多樣性，旨在為中藥材道地性理論提供科學的實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設計與樣品采集

試驗田設在東陽市農業(yè)科學研究所實驗基地。本實驗選擇不同種源的元胡種，主要包括金華市東陽市老區(qū)-東門村、金華市東陽市老區(qū)-馬宅鎮(zhèn)、金華市東陽市新區(qū)-南馬鎮(zhèn)、金華市東陽市老區(qū)-龍泉村、金華市磐安-冷水鎮(zhèn)、陜西-漢中市6個種源。于2017年9月25日將元胡種植在實驗田中，按上述不同種源將實驗分為6組，即道地-東門，道地-馬宅，道地-南馬，道地-龍泉，非道地-冷水，和非道地-漢中組。每組10株，每個處理6個重復。于2018年5月4日元胡采挖時，采集其塊莖，收集根際土。

1.2 土壤細菌多樣性檢測

采用Omega試劑盒提取土壤DNA，具體步驟按其說明書進行。得到的DNA 做為模板，采用Ependorf的PCR system2700 型基因擴增儀，以Miseq測序平臺的V3-V4通用引物（融合341F引物：CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN (barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG融合805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAG AATTCCAGACTACHVGGGTATC TAATCC），進行擴增。采用普通PCR策略：94℃預變性3min，94℃變性30s，45℃退火20 s，65℃延伸20s(重復5個循環(huán)) ；再以94℃變性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s (重復5個循環(huán)) 最后再72℃延伸5min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將目的產物用凝膠回收試劑盒進行割膠回收，回收產物用Qubit2.0定量，根據(jù)測得的DNA濃度，將所有樣品按照1：1的比例進行混合；混合后充分震蕩均勻。送上海生工生物工程有限公司進行Miseq測序。

表1 不同處理組土壤的細菌多樣性及豐富度

表2 不同處理組門水平的分類及百分含量

表3 不同處理組優(yōu)勢菌屬的分類及百分含量

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

Miseq數(shù)據(jù)采用Flash軟件融合雙末端序列，而后通過各樣品barcode使數(shù)據(jù)回歸樣品，并對各樣本序列做QC，去除非靶區(qū)域序列及嵌合體。物種分類，采用RDP classifier將序列進行物種分類，對每個樣本和每個物種單元分類進行序列豐度計算構建樣本和物種分類單元序列豐度矩陣。OTU聚類，將多條序列根據(jù)其序列之間的距離來對它們進行聚類，后根據(jù)序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元（OTU）。α多樣性分析，計算各種物種多樣性指數(shù)，衡量樣本物種多樣性。β多樣性分析，β多樣性指標用來比較多組樣本之間的差別度量，將代表性序列比對參考核心16S rDNA序列，根據(jù)多序列隊列構建代表性序列為節(jié)點的進化樹，利用Unifrac算法計算樣本距離、樣本聚類、樣本PCOA。

2 結果

2.1 根際土壤細菌豐度及多樣性的種源差異

基于Miseq測序結果，根據(jù)OTU的豐度信息，使用稀疏曲線對元胡根際細菌群落多樣性進行評估。稀疏曲線顯示當樣本測序的序列較少時，OTU數(shù)劇增，而隨著測序量的不斷增大，OTU數(shù)目趨于平緩，表示各個樣本達到了環(huán)境樣品的取樣深度，測到了絕大多數(shù)種類的微生物。

利用Miseq測序技術檢測元胡根際土壤細菌多樣性及組成（表1），OTUs和ACE是菌群豐度的評估指標，Shannon指數(shù)是細菌多樣性的評估指標。從表1可知，道地各種源之間細菌豐度及多樣性水平無顯著性差異，而陜西漢中種引種到東陽后，其細菌多樣性水平與豐度相對磐安種源有所下降，但與東陽種源之間無顯著性差異，而磐安冷水相對于東陽南馬種源的細菌豐度及多樣性水平無顯著性差異。由此可知，不同種源之間元胡根際細菌多樣性水平整體差異不大，影響元胡細菌多樣性或許有其他相關因素。

圖1 不同處理組根際細菌主成分分析圖

2.2 根際土壤細菌結構的種源差異

2.2.1 門水平上的差異

對元胡根際細菌門的多樣性進行分析發(fā)現(xiàn)，本研究共有34個菌門被鑒定，結果如表2所示。在所有樣品中，變形菌是豐度最高的門類，分別占有總序列數(shù)的37.4%-42.5%，其次為酸桿菌、放線菌和厚壁菌；24個菌門為6個種源共有，占總菌門的70%，分別為擬桿菌、疣微菌、芽單胞菌、厚壁菌、浮霉菌、綠彎菌等。分析發(fā)現(xiàn)，這些共有菌門在不同種源間均無顯著性差異。當然，有些種源亦有特有菌，如梭桿菌門為非道地漢中組特有，泉古菌為非道地冷水組特有，不過這些特有菌的豐度極低，所占比例均為0.01%。總之，不同種源元胡根際細菌門水平上無顯著性差異。

2.2.2 屬水平上的差異

從屬水平上分析可知，6個種源分別具有637、580、604、652、620及680個屬，每個種源屬組成差異不大，選取每個處理組中排名前20的屬作為優(yōu)勢菌屬（表3）。對優(yōu)勢菌屬進行分析發(fā)現(xiàn)，10個優(yōu)勢菌屬為其共有，分別為Gp1、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、Rhizomicrobium、Gaiella、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、Gp3、Gp2、Rudaea和伯克氏菌屬 (Burkholderia)，其中，Gp1含量最高，所占比例為7.3%-8.1%，其次為芽單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和Gaiella，所占比例分別為4.4%-4.8% 、2.9%-3.6%和2.8%-3.7%，分析發(fā)現(xiàn)，排名前三的Gp1、芽單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬在6個種源間所占比例均無顯著性差異；除上述含量相對較高的優(yōu)勢菌屬之外，我們發(fā)現(xiàn)，假單胞菌、伯克氏菌屬和固氮菌慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）也是他們的優(yōu)勢菌屬，對比之后發(fā)現(xiàn)，這些菌屬在不同種源之間均無顯著性差異；而6個種源間優(yōu)勢菌屬的組成也存在一定的差異，這主要體現(xiàn)在不同種源之間擁有其特有屬，如：Rhodoplanes、Nitrosospira為道地產區(qū)特有，Dongia、Tumebacillus、Aquisphaera只出現(xiàn)在磐安種中，而Chitinophaga和Thermosporothrix卻僅在漢中組出現(xiàn)，但這些優(yōu)勢菌屬豐度較低，所占的比例均小于1%。由此可知，不同種源元胡根際細菌多樣性在屬水平上整體差異不大。

2.3 主成分分析不同處理組根際細菌的差異

主成分分析（PCoA）結果如圖1所示。P1和P2分別解釋了40.1%和12.6%的變異率。由圖可知，6個種源之間聚為一類，沒有體現(xiàn)差異性，這與OUTs和Shannon指數(shù)一致。

3 討論

道地藥材是傳統(tǒng)的、公認的且來源于特定產地的名優(yōu)正品藥材，是中藥材精粹之所在，也是歷代醫(yī)家防病治病最有力的武器之一。元胡有1200多年的栽培歷史，傳統(tǒng)認為浙江東陽為元胡的道地產區(qū)，目前認為元胡主要產地位于浙江東陽和磐安、陜西漢中，而湖北、湖南、江蘇等省區(qū)也有栽培。目前，關于元胡土壤微生物的研究較少，而圍繞中藥材道地性方面的研究更加缺乏。因此，本研究采用Miseq測序技術，研究6個種源元胡根際細菌群落的多樣性，以期為中藥材的道地性與根際土壤微生物的相關性研究奠定基礎。

通過對元胡根際細菌多樣性進行分析，我們發(fā)現(xiàn)，OTU及Shannon指數(shù)均表明元胡根際細菌多樣性整體差異不大，在門水平上亦無顯著性差異，屬水平上整體差異不大，因此，我們得出結論，不同種源元胡根際細菌多樣性整體無顯著性差異，種源對土壤根際微生物的影響微乎其微。

而不同種源間土壤根際微生物的無差異性在以往的研究中亦有體現(xiàn)。李國斌等研究了不同種源蒙古黃芪根際微生物的變化，結果表明，不同種源根際細菌及真菌豐度均無顯著性差異；邵士成等研究了云南元江印楝植物內生真菌的種類組成，結果表明，不同地理種源印楝植物內生真菌的種類組成沒有明顯差異，但王戈等研究發(fā)現(xiàn)，不同品種的烤煙根際微生物存在差異，苗則彥等人同樣發(fā)現(xiàn)不同品種的黃瓜根際真菌、放線菌數(shù)量存在明顯差異，與我們的研究結果不同，由此可知，種源對微生物多樣性的影響會因物種的不同而產生不同的作用，這可能和物種與微生物的根際互作有關，值得進一步研究。微生物可以成為藥材植株的內生菌，影響藥材植株的次生代謝，如參與合成次生代謝產物或是植株在內生菌的刺激下合成更多的防御性化合物，最終成為影響藥材道地性的一個因素。

同樣的種植環(huán)境，種源的不同并未對元胡根際細菌的多樣性產生影響，由此可見，土壤與環(huán)境等相關因素的作用或許是造成元胡根際細菌多樣性的主要原因。相關研究發(fā)現(xiàn)，土壤理化特性如顆粒大小、pH值及有機質的含量等因素均會影響根際微生物的種群結構與功能，而土壤pH值的增加還能在一定程度上改善植物根際微生物的結構，如增加生防菌熒光假單胞菌的數(shù)量；苗翠蘋等人分析了三七根際土壤中微生物群落的變化與環(huán)境因子之間的關系，結果表明，真菌和細菌的數(shù)量變化均與環(huán)境因子有顯著性關系，細菌群落受到了更大的影響，而土壤中的總磷、有效磷、水解氮及pH是影響細菌群落結構的重要因素。同樣，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，浙貝母菌群結構和組成是浙貝母物種與土壤共同作用的結果；Berg等人同樣認為植物物種和土壤類型共同決定著根際微生物的結構和功能。因此，我們推測，種源對元胡根際細菌多樣性影響不大，而土壤環(huán)境等因素是決定元胡根際細菌多樣性的主要因素。

除此之外，通過對不同種源的優(yōu)勢菌屬分析發(fā)現(xiàn)，不同種源間的優(yōu)勢菌屬假單胞菌（Pseudomonas）、伯克氏菌屬 (Burkholderia)和固氮菌慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）等所占比例并未產生顯著影響。有研究表明，假單胞菌（Pseudomonas）能產生活性物質，抗多種植物病害；伯克氏菌屬 (Burkholderia)為根系促生菌（PGPR），其作用在番茄、美洲商陸和籽粒莧等植物中都已證實；慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）是豆科植物主要的固氮菌，可和豆科植物形成共生體，是陸生系統(tǒng)中固氮主要來源，這些細菌對藥用元胡的生長乃至元胡的藥材品質有著怎樣的影響有待進一步研究。

綜上所述，基于Miseq測序的方法顯示，東陽產區(qū)元胡根際細菌具有豐富的多樣性，不同種源間元胡根際細菌多樣性在門及屬水平上均無顯著性差異。因此我們得出結論，種源并不是影響元胡根際細菌多樣性的主要因素，而土壤環(huán)境等因子的作用或許是決定元胡根際細菌多樣性的關鍵因素。除此之外，為了更好地闡明植物-土壤-微生物三者之間的關系，種源對元胡產量及品質的影響還需進一步的研究。