史鐘　郁肖夫　朱靜　袁梅琴　呂汪霞　馮婷婷　鐘海均

[摘要] 目的 觀察結(jié)直腸癌術(shù)后患者化療前后外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化，評(píng)估患者免疫功能狀態(tài)變化。 方法 納入浙江省腫瘤醫(yī)院2016年1～12月住院的結(jié)直腸癌根治術(shù)后Ⅱ～Ⅲ期患者74例，健康對(duì)照組為25例同期我院就診的非惡性腫瘤患者，采用流式細(xì)胞術(shù)分析輔助化療第1、6、8周期前1 d外周血淋巴細(xì)胞亞群比例。 結(jié)果 結(jié)直腸癌根治術(shù)后患者外周血中CD3+（P=0.1532）、CD3+CD4+（P=0.1107）、CD3+CD8+（P=0.2576）T細(xì)胞與健康對(duì)照組比較無(wú)差異（P>0.05），而CD3+CD56+ NKT細(xì)胞（P=0.0210）及CD3-CD56+ NK細(xì)胞（P=0.0045）較健康對(duì)照者顯著升高（P<0.05）。術(shù)后輔助化療6周期前NK、NKT細(xì)胞比例均無(wú)顯著變化，P>0.05。8周期前NKT細(xì)胞比例無(wú)顯著變化（P>0.05），NK細(xì)胞比例僅輕度下降（19.10±4.63 vs 20.31±4.66，P=0.046）。 結(jié)論 結(jié)直腸癌根治術(shù)后患者NK及NKT細(xì)胞比例較健康人顯著升高，且輔助化療后表達(dá)率保持穩(wěn)定。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌;淋巴細(xì)胞亞群;NK細(xì)胞;NKT細(xì)胞

[中圖分類號(hào)] R730.4? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）10-0086-04

Expression of peripheral blood NKT and NK cells in postoperative colorectal cancer patients before and after chemotherapy

SHI Zhong YU Xiaofu ZHU Jing YUAN Meiqin LV Wangxia FENG Tingting ZHONG Haijun

Department of Abdominal Oncology， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou? ?310022， China

[Abstract] Objective To observe the changes of peripheral blood lymphocyte subsets in patients with postoperative colorectal cancer before and after chemotherapy， and to evaluate the changes of immune function status. Methods 74 patients with stage Ⅱ-Ⅲ colorectal cancer after radical resection admitted in Zhejiang Cancer Hospital from January to December 2016 were enrolled. 25 non-malignant patients in the same period in our hospital were selected as the control group. Flow cytometry was used to analyze the proportion of peripheral blood lymphocyte subsets at one day before the first， sixth and eighth cycles of adjuvant chemotherapy. Results There were no differences in CD3+（P=0.1532）， CD3+CD4+ （P=0.1107）， CD3+CD8+ （P=0.2576） T cells in the peripheral blood between patients with colorectal cancer after radical operation and control group（P>0.05）. While CD3+CD56+ NKT cells （P=0.0210） and CD3-CD56+ NK cells （P=0.0045） in the patients with colorectal cancer after radical operation were significantly higher than those of the control group （P<0.05）. There was no significant change in the proportion of NK and NKT cells before 6 cycles of postoperative adjuvant chemotherapy（P>0.05）. There was no significant change in the proportion of NKT cells before 8 cycles （P>0.05）， and the proportion of NK cells only decreased slightly（19.10±4.63 vs 20.31±4.66，P=0.046）. Conclusion The proportion of NK and NKT cells in patients with colorectal cancer after radical resection was significantly higher than that in healthy people， and the expression rate remains stable after adjuvant chemotherapy.

[Key words] Colorectal cancer; Lymphocyte subsets; NK cells; NKT cells

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是歐美國(guó)家最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在中國(guó)，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展及飲食結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)病率亦逐年遞增，2015年發(fā)病率和死亡率均位于所有惡性腫瘤的第5位，嚴(yán)重危害居民的健康[1]。手術(shù)仍是早中期結(jié)直腸癌的主要治療手段，而術(shù)后輔助化療目前是高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（Ⅲ期及部分Ⅱ期）結(jié)直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞在惡性腫瘤發(fā)展的不同階段（起始到轉(zhuǎn)移擴(kuò)散到生長(zhǎng)）中起到了控制腫瘤的作用[2]。而手術(shù)及放化療對(duì)免疫系統(tǒng)的“破壞”，是一部分患者抗拒手術(shù)及化療的主要顧慮。目前認(rèn)為，參與抗腫瘤的細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞主要有T細(xì)胞、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞、自然殺傷T（natural killer T，NKT）細(xì)胞等，CD3+ T細(xì)胞主要參與特異性免疫，而NK、NKT細(xì)胞參與固有免疫（非特異性免疫）。外周血淋巴細(xì)胞亞群分析能從一定程度上反應(yīng)機(jī)體的免疫狀態(tài)。為評(píng)估結(jié)直腸癌患者術(shù)后及輔助化療后抗腫瘤免疫反應(yīng)狀態(tài)，本研究對(duì)74例結(jié)直腸癌患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化作了觀察，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集浙江省腫瘤醫(yī)院2016年1～12月于大腸外科住院手術(shù)，并之后于腹部腫瘤內(nèi)科行輔助化療的結(jié)直腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者均經(jīng)手術(shù)病理確診為結(jié)腸癌或直腸癌（其中直腸癌患者為高位直腸癌，手術(shù)前后未行放療）;（2）病理分期為Ⅱ～Ⅲ期，影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)其他遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;（3）既往無(wú)其他惡性腫瘤手術(shù)、化療或放療史;（4）年齡18～75歲，ECOG評(píng)分0～1分;（5）無(wú)其他嚴(yán)重并發(fā)癥和化療禁忌證;（6）排除合并肺結(jié)核、肝炎和艾滋病等傳染性疾病以及免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的患者。

根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)選取患者共74例，其中男38例，女36例。年齡26～71歲，中位年齡55歲。右半結(jié)腸癌28例，左半結(jié)直腸癌46例。免疫組化錯(cuò)配修復(fù)蛋白（mismatch repair，MMR）檢測(cè)為錯(cuò)配修復(fù)缺陷（mismatch repair deficient，dMMR）6例，錯(cuò)配修復(fù)完全（mismatch repair proficient，pMMR）63例，未檢測(cè)5例。其中根據(jù)2017年UICC-AJCC臨床分期第8版分為ⅡB期20例，ⅡC期1例，ⅢA期5例，ⅢB期31例，ⅢC期17例。病理類型：均為腺癌，其中黏液腺癌7例。分化程度：高-中分化1例，中分化57例，中-低分化12例，低分化4例。74例患者術(shù)后均無(wú)化療禁忌。

所有患者均術(shù)后3～4周內(nèi)給予輔助化療，其中XELOX方案化療69例，卡培他濱口服化療2例，mFolfox6方案化療3例。

健康對(duì)照組為25例同期我院就診的非惡性腫瘤患者，且未合并肺結(jié)核、肝炎和艾滋病等傳染性疾病以及免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病。其中男12例，女13例。年齡23～70歲，中位年齡52歲。健康對(duì)照組與腸癌組患者的年齡、性別具有可比性（P>0.05）。

1.2 標(biāo)本采集及檢測(cè)

所有患者于術(shù)后第1次化療前、第6、8次化療前1 d抽取空腹靜脈血5 mL，檢測(cè)外周靜脈血中相關(guān)淋巴細(xì)胞亞群的比例。

1.2.1 試劑及儀器? CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5四聯(lián)標(biāo)記單克隆抗體﹑CD45-FITC/CD56-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5四聯(lián)標(biāo)記單克隆抗體﹑OptiLyse C溶血素﹑Immuno-Trol全血質(zhì)控品及儀器光路流路校正品Flowcheck。采用FC500流式細(xì)胞儀（flow cytometry method，F(xiàn)CM）分析。以上試劑及儀器均來(lái)自美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.2.2 流式細(xì)胞檢測(cè)及分析? 采用肝素鈉抗凝全血進(jìn)行熒光標(biāo)記，100 μL全血分別與10 μL CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5四聯(lián)標(biāo)記單克隆抗體或CD45-FITC/CD56-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5四聯(lián)標(biāo)記單克隆抗體，室溫避光孵育15 min，OptiLyse C溶血素溶血后避光孵育15 min，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌一次，最后用500 μL PBS重懸細(xì)胞待FCM分析。每次檢測(cè)均用Immuno-Trol進(jìn)行全程質(zhì)控。所有測(cè)定隨常規(guī)樣本分析進(jìn)行。采用CXP Analysis分析系統(tǒng)，根據(jù)檢測(cè)需要設(shè)計(jì)方案中所需的散點(diǎn)圖﹑直方圖。采用同型對(duì)照抗體確定線性門(mén)的位置和檢測(cè)方案電壓;在電壓確定的基礎(chǔ)上進(jìn)行顏色補(bǔ)償：去掉兩種熒光的發(fā)射光譜中重疊部分，確保所檢測(cè)熒光表達(dá)的準(zhǔn)確性。針對(duì)前向散射（forward scatter，F(xiàn)S）與側(cè)向散射（side scatter，SS）細(xì)胞分群所得淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析，在相應(yīng)的直方圖的散點(diǎn)圖中讀取相應(yīng)CD分子的陽(yáng)性表達(dá)率。每次分析前用Flowcheck進(jìn)行儀器光路和流路的校正，保證FS和各熒光通路的半高峰變異均<2%;并采用Immuno-Trol質(zhì)控品進(jìn)樣本檢測(cè)的質(zhì)量控制。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)由SPSS 15.0及Microsoft Office Excel 2007軟件完成。計(jì)量資料以（x±s）表示，成組資料兩樣本均數(shù)比較用雙尾t檢驗(yàn)，化療前后指標(biāo)比較采用雙尾配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌術(shù)后患者與健康人外周血淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)率比較

腸癌根治術(shù)后患者外周血中CD3+（總T細(xì)胞）（P=0.1532）、CD3+CD4+（輔助/效應(yīng)T細(xì)胞）（P=0.1107）、CD3+CD8+（抑制/細(xì)胞毒T細(xì)胞）（P=0.2576）T細(xì)胞與健康對(duì)照組比較無(wú)差異（見(jiàn)表1）。而CD3+CD56+ NKT細(xì)胞（P=0.0280）及CD3-CD56+ NK細(xì)胞（P=0.0039）較健康對(duì)照者顯著升高。見(jiàn)表1。

2.2 結(jié)直腸癌患者術(shù)后輔助化療前后外周血NKT細(xì)胞及NK細(xì)胞表達(dá)率分析

剔除了15例未完成全部輔助化療的患者（12例為XELOX方案，3例為mFolfox6方案），余59例患者均完成了7～8周期的XELOX方案或卡培他濱方案化療，對(duì)這59例患者進(jìn)行分析（其中6例患者第8周期化療前1 d驗(yàn)血發(fā)現(xiàn)血小板Ⅲ°減少等化療禁忌，未行第8周期化療）?？紤]6個(gè)月（一般為8周期XELOX方案或卡培他濱方案）的輔助化療（Ⅲ期T1-3N1低危患者可3個(gè)月）為腸癌術(shù)后標(biāo)準(zhǔn)治療，本文主要研究標(biāo)準(zhǔn)治療后的患者免疫狀態(tài);并結(jié)合文獻(xiàn)中的方法及數(shù)據(jù)結(jié)果[3]，我們對(duì)患者第6、8周期化療前1 d的外周血進(jìn)行分析（mFolfox6方案患者擬分析8、12周期前1 d，但患者均未完成治療）。腸癌患者術(shù)后輔助化療6周期前NK、NKT細(xì)胞比例均無(wú)顯著變化（P>0.05）（表2）。8周期前NKT細(xì)胞比例無(wú)顯著變化（P>0.05），NK細(xì)胞比例僅輕度下降（19.10±4.63 vs. 20.31±4.66，P=0.0431）。見(jiàn)表2。

3 討論

腫瘤細(xì)胞對(duì)宿主的適應(yīng)是腫瘤進(jìn)展、治療失敗以及機(jī)體最終死亡的一個(gè)重要原因。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不斷的面臨免疫選擇，能在免疫攻擊下存活的細(xì)胞被保留，而不能逃避免疫攻擊的則被清除[4，5]。參與抗腫瘤的細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞主要有T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞等，CD3+T細(xì)胞主要參與特異性免疫，而NK及NKT細(xì)胞均為體內(nèi)抗腫瘤固有免疫反應(yīng)的重要細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌根治術(shù)后患者的外周血中，CD3+（總T細(xì)胞）、CD3+CD4+（輔助/效應(yīng)T細(xì)胞）、CD3+CD8+（抑制/細(xì)胞毒T細(xì)胞）T細(xì)胞比例與健康人無(wú)顯著性差異;而CD3+CD56+ NKT細(xì)胞及CD3-CD56+ NK細(xì)胞比例均較健康人顯著升高，且保持穩(wěn)定不受輔助化療影響，提示我們固有免疫可能在這類患者中發(fā)揮更重要的作用。

固有樣T細(xì)胞是一類非肽類識(shí)別的T細(xì)胞，是哺乳動(dòng)物T細(xì)胞的一個(gè)重要組成部分。最近的一些研究表明這些固有樣T細(xì)胞在調(diào)節(jié)腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，因而潛在可用于腫瘤免疫治療的開(kāi)發(fā)。而腫瘤免疫中最具代表性的固有樣T細(xì)胞亞群為NKT細(xì)胞[6，7]。一方面，NKT 細(xì)胞可通過(guò) Fas/FasL 途徑、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α途徑以及穿孔素途徑發(fā)揮直接抗腫瘤作用[8]，且多項(xiàng)研究報(bào)道了NKT細(xì)胞在體外能有效殺傷白血病、肺癌、胰腺癌、宮頸癌、惡性黑色素瘤等多種血液或?qū)嶓w腫瘤細(xì)胞株[9]。另一方面，根據(jù)是否對(duì)α-半乳糖神經(jīng)酰胺（α-galactosylceramide，α-GalCer）/CD1d 復(fù)合體發(fā)生反應(yīng)，NKT 細(xì)胞被分為經(jīng)典NKT細(xì)胞（invariant NKT， iNKT或Ⅰ型 NKT）和非經(jīng)典NKT細(xì)胞（variant NKT， vNKT或Ⅱ型 NKT）[10]。iNKT細(xì)胞被激活后主要分泌干擾素（interferon，IFN）-γ、白介素（interleukin，IL）-2等T輔助細(xì)胞（T helper cells，Th）1類細(xì)胞因子，在腫瘤免疫中主要起到抗腫瘤作用;vNKT細(xì)胞激活后主要分泌如IL-13、IL-4等Th2類細(xì)胞因子，在腫瘤免疫中主要發(fā)揮抑制作用，形成雙向免疫調(diào)節(jié)模式[11，12]。綜上所述，NKT細(xì)胞既是一種重要的固有免疫效應(yīng)性細(xì)胞，也作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)腸癌術(shù)后患者外周血NKT細(xì)胞比例顯著高于健康人，提示腸癌患者中NKT細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫反應(yīng)處于活化狀態(tài)?？紤]到NKT細(xì)胞在抗腫瘤免疫反應(yīng)中的作用為雙向調(diào)節(jié)，且多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者的iNKT細(xì)胞數(shù)目減少且功能缺失[13]，因此，這種活化是否有利還難以下定論。如進(jìn)一步分析這些患者外周血中NKT的分型，將能更明確闡述其腫瘤免疫反應(yīng)狀態(tài)。

NK細(xì)胞是固有免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞之一，其不需要主要組織相容性復(fù)合體的抗原提呈，就可識(shí)別和殺死腫瘤細(xì)胞[14]。一方面，NK細(xì)胞可以通過(guò)分泌穿孔素（Perforin）和顆粒酶B（Granzyme B）等直接裂解并殺傷腫瘤細(xì)胞;另一方面，還可以通過(guò)分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，參與免疫調(diào)控而促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)[15]。有研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中NK細(xì)胞活性強(qiáng)的患者治療緩解率更高，無(wú)進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）更長(zhǎng)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)腸癌術(shù)后患者外周血NK細(xì)胞比例顯著高于健康人，但未發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞比例與腫瘤患者臨床及分子病理特征之間的關(guān)系，有待更全面的研究及生存隨訪數(shù)據(jù)來(lái)全面闡述NK細(xì)胞比例升高的意義。

本文研究還存在如下一些局限性。已有研究表明，dMMR腸癌患者腫瘤組織有更多的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)[17，18]，左右半結(jié)腸的分子生物學(xué)特征及免疫狀態(tài)也有很大差異，但本研究從MSI狀態(tài)與腫瘤部位兩個(gè)角度進(jìn)行分層分析（數(shù)據(jù)未列出），均未發(fā)現(xiàn)有差異，可能與樣本量不足有關(guān)。本研究選取的對(duì)象為腸癌根治術(shù)后患者，與腫瘤負(fù)荷大的術(shù)前或者晚期患者相比可能免疫反應(yīng)狀態(tài)有差異，化療對(duì)免疫狀態(tài)的影響也有差異[19]。另外，已有些個(gè)案報(bào)道發(fā)現(xiàn)高NK細(xì)胞比例的晚期腸癌患者治療后獲得臨床完全緩解以及長(zhǎng)期生存[20]，而研究對(duì)象中也有數(shù)例患者NK或者NKT比例明顯高于正常標(biāo)準(zhǔn)。由于時(shí)間所限，研究中的患者目前還未能獲得復(fù)發(fā)生存相關(guān)的隨訪數(shù)據(jù)，如對(duì)這部分患者進(jìn)行跟蹤隨訪，可能為NK或NKT細(xì)胞高表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系提供更重要的臨床證據(jù)。

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