易松　楊丹　幸志強(qiáng)

[摘要] 目的 探討Notch信號(hào)通路經(jīng)ROCK2對(duì)大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的凋亡影響。 方法 選擇SD大鼠乳鼠180只，分為6組，檢測(cè)Hes1的表達(dá)、心肌細(xì)胞活力、心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放情況、心肌細(xì)胞凋亡情況以及NICD、Bcl2、Caspase3以及Hes1表達(dá)水平。 結(jié)果 SI/R組OD值相比對(duì)照組明顯下降（P<0.05）;Jagged1+SI/R組與SI/R組、對(duì)照組對(duì)比，存在明顯差異（P<0.05）;Jagged+DAPT+SI/R組OD值與Jagged1+SI/R組對(duì)比，存在明顯差異（P<0.05）;Jagged1組、DAPT組OD值與對(duì)照組對(duì)比，均未見顯著差異（P>0.05）。SI/R組、Jagged1+SI/R組、Jagged+DAPT+SI/R組的LDH釋放率、細(xì)胞凋亡率相比對(duì)照組均有明顯上升（P<0.05）;SI/R組、Jagged1+SI/R組、Jagged+DAPT+SI/R組經(jīng)處理后的Notch1、Hes1、Bcl2均有顯著下降，而Caspase3表達(dá)顯著上升（P<0.05）。結(jié)論 Notch 信號(hào)通路在心肌缺血/再灌注的過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，對(duì)誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡具有重要影響，且激活Notch信號(hào)通路能起到抗缺血/再灌注損傷的效果。

[關(guān)鍵詞] Notch信號(hào)通路;ROCK2;心肌缺血/再灌注;H9c2心肌細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)] R363? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）10-0038-04

Effect of Notch signaling pathway on apoptosis of H9c2 cardiomyocytes induced by hypoxia/reoxygenation by ROCK2

YI Song? ?YANG Dan? ?XING Zhiqiang

Department of Cardiology， Yichun People's Hospital in Jiangxi Province， Yichun? ?336000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Notch signaling pathway on the apoptosis of H9c2 cardiomyocytes induced by hypoxia/reoxygenation in rat cardiomyocytes via ROCK2. Methods A total of 180 SD neonatal rats were selected as the study materials and divided into 6 groups. The expression of Hes1， myocardial cell viability， release of cardiomyocyte lactate dehydrogenase， cardiomyocyte apoptosis and NICD， Bcl2， Caspase3 and Hes1 expression levels were detected. Results The OD value of SI/R group was significantly lower than that of the control group（P<0.05）， the OD value of Jagged1+ SI/R group was significantly different from that of the SI/R group and the control group（P<0.05）. There was significant difference in the OD value between Jagged+DAPT+SI/R group and the Jagged1+SI/R group（P<0.05）. There was no significant difference in the OD value between the control group and Jagged1 group， the DAPT group（P>0.05）. The LDH release rate and apoptosis rate of SI/R group， Jagged1+SI/R group and Jagged+DAPT+SI/R group were significantly higher than those of the control group（P<0.05）. The levels of Notch1， Hes1 and Bcl2 in the SI/R group， Jagged1+SI/R group and Jagged+DAPT+SI/R group were significantly decreased， while the expression of Caspase3 was significantly increased（P<0.05）. Conclusion Notch signaling pathway plays an important role in the regulation of myocardial ischemia/reperfusion， and has an important effect on the induction of H9c2 cardiomyocyte apoptosis. Activation of Notch signaling pathway can inhibit ischemia/reperfusion injury.

[Key words] Notch signaling pathway; ROCK2; Myocardial ischemia/reperfusion; H9c2 cardiomyocyte apoptosis

缺血性心臟病是當(dāng)前一類嚴(yán)重危害人類身體健康的疾病。在我國(guó)，有超過2000萬(wàn)缺血性心臟病患者，且每年以100萬(wàn)例的速度在不斷增長(zhǎng)[1-2]。此類患者可通過溶栓治療、經(jīng)皮導(dǎo)管冠脈介入術(shù)治療（PCI）等方法以恢復(fù)心肌血液供應(yīng)[3]。但臨床發(fā)現(xiàn)，缺血心肌組織在重新恢復(fù)血液供應(yīng)后，常出現(xiàn)繼發(fā)、加重心肌組織的損傷現(xiàn)象，即易發(fā)生缺血/再灌注損傷。對(duì)于心肌組織的缺血/再灌注，受多信號(hào)通路以及細(xì)胞因子的影響，是一項(xiàng)復(fù)雜的生物反應(yīng)過程。當(dāng)前對(duì)于心肌組織的缺血/再灌注相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究是一項(xiàng)重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。研究通過Notch信號(hào)通路作為切入點(diǎn)，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立大鼠乳鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注模型，探討Notch信號(hào)通路經(jīng)ROCK2對(duì)大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的凋亡影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供SD大鼠乳鼠180只，納入乳鼠雌雄不拘，育齡1～2 d，體重1.3～1.8 g，批號(hào)：20160221。

1.2主要試劑

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清均為美國(guó)Gibco公司生產(chǎn);膠原酶Ⅰ、HEPES、5-溴脫氧尿苷、2-deoxy-D-glucose、5-二苯基四氮唑嗅鹽、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2、MTT均為美國(guó)Sigma公司生產(chǎn);兔抗人Caspase3抗體、兔抗人Bcl2抗體均為美國(guó)Cell signaling公司生產(chǎn);兔抗人Notch1單克隆抗體為美國(guó)Abcom公司生產(chǎn);Notch信號(hào)通路的特異性抑制劑DAPT由德國(guó)Merck公司生產(chǎn);激活Notch信號(hào)通路的重組大鼠Jagged1蛋白由美國(guó)R&D公司生產(chǎn);LDH-釋放檢測(cè)試劑盒由南京建成生物制劑公司生產(chǎn);TUNEL-凋亡檢測(cè)試劑盒由德國(guó)Roche公司生產(chǎn)。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱;Olympus倒置顯微鏡;ZW-A微量振蕩器;低轉(zhuǎn)速離心機(jī);Olympus熒光顯微鏡。

1.4 方法

（1）培養(yǎng)乳鼠原代心肌細(xì)胞。應(yīng)用醫(yī)用酒精對(duì)SD大鼠乳鼠進(jìn)行消毒后，于超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件取下小鼠心臟，置于PBS中剪碎，在添加膠原酶Ⅰ的PBS進(jìn)行3次重復(fù)消化，每次持續(xù)5 min。將獲得細(xì)胞懸液置于DMEM（含有10%血清）中，經(jīng)1000 r/min離心處理5 min，棄去上清，通過血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞重懸處理，經(jīng)培養(yǎng)箱培育后通過差速貼壁法對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行純化，獲得純化心肌細(xì)胞中添加Brdu，以抑制成纖維細(xì)胞的增長(zhǎng)。心肌細(xì)胞接種至6、24、96孔培養(yǎng)板，加入載玻片進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。

（2）建立乳鼠心肌細(xì)胞SI/R模型。參考文獻(xiàn)報(bào)道[4]的模型建立方法建立心肌細(xì)胞SI/R損傷模型。再灌注條件：正常DMEM，經(jīng)37℃孵育處理4 h。于倒置顯微鏡下對(duì)心肌細(xì)胞形態(tài)變化進(jìn)行觀察。

（3）試驗(yàn)分組。將180只小鼠均分為6組，每組30只。6組分別為一般對(duì)照組、SI/R組、Jagged1+SI/R組、Jagged+DAPT+SI/R組、DAPT組以及Jagged1組。一般對(duì)照組應(yīng)用正常DMEM進(jìn)行7 h培養(yǎng);SI/R組經(jīng)正常培養(yǎng)1 h+模擬缺血培養(yǎng)2 h+正常DMEM再灌注處理4 h;Jagged1+SI/R組經(jīng)添加Jagged1（6.8 μM）DMEM孵育1 h+模擬缺血培養(yǎng)2 h+正常DMEM再灌注處理4 h;Jagged+DAPT+SI/R組經(jīng)添加DAPT（31.25 nM）以及Jagged1（6.8 μM）DMEM孵育1 h+模擬缺血培養(yǎng)2 h+正常DMEM再灌注處理4 h;DAPT組應(yīng)用添加DAPT（31.25 nM）DMEM孵育1 h+正常DMEM孵育6 h;Jagged1組應(yīng)用添加Jagged1（6.8 μM）孵育1 h+正常DMEM孵育6 h。

（4）各組心肌細(xì)胞活力檢測(cè)。各組分組處理后，每孔添加10 μL 的MTT溶液，置于37℃下孵育4 h，每孔再添加100 μL二甲基亞砜，震蕩處理15 min。置于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的光密度值（OD）。

（5）心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放試驗(yàn)。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液置于4℃冰箱中保存。給細(xì)胞添加相同體積裂解液，收集處理后的裂解液，于4℃下離心處理獲得上清液，對(duì)培養(yǎng)液與裂解液中的心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）活性進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算樣本LDH的釋放量。其中，LDH釋放量=培養(yǎng)液中LDH測(cè)定值/（培養(yǎng)液、裂解液的LDH測(cè)定總值）×100%。

（6）心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。在進(jìn)行接種前，將蓋玻片置于培養(yǎng)孔中進(jìn)行爬片細(xì)胞的培養(yǎng);實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出蓋玻片，經(jīng)濃度100%的冷丙酮置于-20℃下固定20 min，自然晾干。心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)參考試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作。檢測(cè)后置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的情況，以細(xì)胞核當(dāng)中存在綠色熒光顆粒記錄為TUNEL染色陽(yáng)性，即該細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，對(duì)每張切片均隨機(jī)取5個(gè)及以上高倍視野，計(jì)算心肌細(xì)胞核的凋亡率。其中，凋亡率=（觀察凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。

（7）Notch1、Hes1、Bcl2以及Caspase3表達(dá)的檢測(cè)。取小鼠心肌組織100 mg，置于勻漿器中，添加組織裂解液進(jìn)行勻漿，于冰上孵育處理1 h。孵育后經(jīng)1200 r/min離心處理15 min，取上清液。取部分用BCA法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，留取部分上清液添加5X上樣緩沖液經(jīng)沸水蒸煮處理7 min獲得蛋白質(zhì)樣品。依據(jù)第三版《分子克隆》制備蛋白電泳凝膠，控制電壓80 V，于甘氨酸電泳緩沖液當(dāng)中電泳90 min。電泳結(jié)束后裝配轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜處理60～120 min，應(yīng)用去離子水將硝酸纖維素膜進(jìn)行沖洗并置入麗春紅中5 min，應(yīng)用去離子水沖洗，標(biāo)記蛋白marker相應(yīng)條帶。剪下32 KD的Hes1、42 KD（β-actin）、120 KD的NICD膜。經(jīng)5%的脫脂奶粉封閉處理1 h，加入Hes1一抗（1：1000稀釋）、β-actin一抗（1：2000稀釋）、ICD一抗（1：1000稀釋），室溫下孵育處理1 h。經(jīng)TBST洗膜2次以及TBS洗膜1次，加入二抗（1：1000稀釋），室溫下孵育處理1 h，經(jīng)TBST洗膜2次以及TBS洗膜1次，ECL發(fā)光液曝光，分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。各組Western blotting的信號(hào)強(qiáng)度以對(duì)照組為基礎(chǔ)強(qiáng)度，強(qiáng)度100%，檢測(cè)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）描述，進(jìn)行方差分析，組間兩兩對(duì)比行LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞活力（OD值）檢測(cè)結(jié)果

一般對(duì)照組的心肌細(xì)胞OD值為（0.73±0.09）;SI/R組OD值為（0.41±0.07），相比對(duì)照組明顯下降（P<0.05）;Jagged1+SI/R組OD值為（0.53±0.06），相比SI/R組或?qū)φ战M差異顯著（P<0.05）;Jagged+DAPT+SI/R組OD值（0.23±0.06）（vs Jagged1+SI/R組，P<0.05）;Jagged1組OD值為（0.74±0.09），DAPT組OD值為（0.78±0.14），與對(duì)照組相比均未見顯著差異（P>0.05）。

2.2 各組LDH釋放試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞LDH釋放量檢測(cè)可用于確定細(xì)胞損傷的程度。對(duì)照組的LDH釋放率為（11.19±2.13）%;SI/R組LDH釋放率為（36.23±3.33）%，顯著高于對(duì)照組（P<0.05）;Jagged1+SI/R組LDH釋放率為（28.29±3.16）%，顯著高于對(duì)照組，低于SI/R組（P均<0.05）;Jagged+DAPT+SI/R組LDH釋放率為（49.62±3.40）%，與Jagged1+SI/R組存在顯著差異（P<0.05）;Jagged1組LDH釋放率為（11.23±2.26）%，DAPT組LDH釋放率為（11.37±2.41）%，與對(duì)照組相比均未見顯著差異（P>0.05）。

2.3 各組心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組心肌細(xì)胞凋亡率為（7.13±0.72）%;SI/R組細(xì)胞凋亡率為（34.24±3.55）%，顯著高于對(duì)照組（P<0.05）;Jagged1+SI/R組細(xì)胞凋亡率為（23.46±11.41）%，相比SI/R組顯著降低（P<0.05）;Jagged+DAPT+SI/R組細(xì)胞凋亡率為（46.33±6.26）%，顯著高于其他各組（P<0.05）;Jagged1組細(xì)胞凋亡率為（7.18±0.82）%，DAPT組細(xì)胞凋亡率為（7.10±0.65）%，與對(duì)照組相比均未見顯著差異（P>0.05）。

2.4 各組Notch1、Hes1、Bcl2以及Caspase3的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

各組Notch1、Hes1、Bcl2以及Caspase3的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果見表1。SI/R組、Jagged1+SI/R組、Jagged+DAPT+SI/R組經(jīng)處理后Notch1、Hes1、Bcl2均顯著下降，Caspase3表達(dá)顯著上升（P<0.05）。

3討論

Notch信號(hào)通路是作為心血管系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育、病理以及生理過程當(dāng)中的一種基本的信號(hào)通路，該通路具有促進(jìn)干細(xì)胞的分化與增殖，促進(jìn)損傷細(xì)胞的再生作用[4-6]。有研究提示，Notch信號(hào)通路在缺血/再灌注的過程中發(fā)揮一定的作用[7]。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，心梗后晚期的 Notch信號(hào)通路中，Notch1分子胞內(nèi)區(qū)的關(guān)鍵分子NICD在心梗邊緣區(qū)（即在缺血但未壞死的區(qū)域內(nèi)）的表達(dá)出現(xiàn)顯著提升;且在Notch 信號(hào)通路激活后，心?；謴?fù)期心臟功能出現(xiàn)明顯的改善[8-9]。Gude NA等[10]研究提示，Notch信號(hào)通路可能在心肌的缺血損傷過程以及心肌保護(hù)過程均發(fā)揮出重要的調(diào)控作用。Notch信號(hào)通路與NF-κB及PI3K/Akt等信號(hào)通路通過分子網(wǎng)絡(luò)互相間影響，NF-κB以及PI3K/Akt等相關(guān)信號(hào)通路已被研究證明為心肌缺血/再灌注過程發(fā)揮重要作用的通路，不少研究均提示，與NF-κB及PI3K/Akt相關(guān)的Notch 信號(hào)通路也可能通過多信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)效應(yīng)對(duì)心肌缺血/再灌注過程起到調(diào)控作用[11]。不少學(xué)者基于相關(guān)通路的研究認(rèn)為，心肌缺血/再灌注損傷中，Notch信號(hào)通路的激活或發(fā)揮出重要的調(diào)控作用[12-14]。

本研究主要以通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立大鼠乳鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注模型，探討Notch信號(hào)通路經(jīng)ROCK2對(duì)大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的凋亡影響，SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞模型對(duì)于Notch信號(hào)通路的相關(guān)分子Notch與Hes1在正常心肌細(xì)胞、缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞中的表達(dá)明確，其相對(duì)于人心房肌標(biāo)本實(shí)驗(yàn)可有效避免臨床因素的影響[15]。本研究納入小鼠180只，分6組處理，檢測(cè)Hes1的表達(dá)、心肌細(xì)胞活力、心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放情況、心肌細(xì)胞凋亡情況以及NICD、Bcl2、Caspase3以及Hes1表達(dá)水平。結(jié)果提示，各組心肌細(xì)胞活力（OD值）檢測(cè)中，SI/R組、Jagged1+SI/R組、Jagged+DAPT+SI/R組明顯下降，而Jagged1組、DAPT組與對(duì)照組均無(wú)明顯差異，研究排除了Jagged1與DAPT對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。而LDH釋放率、細(xì)胞凋亡率在SI/R組、Jagged1+SI/R組、Jagged+DAPT+SI/R組均有明顯上升，Notch1、Hes1、Bcl2、Caspase3表達(dá)以對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果為100.00%，SI/R組、Jagged1+SI/R組、Jagged+DAPT+SI/R組經(jīng)處理后Notch1、Hes1、Bcl2均有顯著下降，Caspase3表達(dá)顯著上升（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過激活Notch信號(hào)通路能有效減輕心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷，激活Notch信號(hào)通路后，心肌細(xì)胞的活力增加，且LDH的釋放率降低，細(xì)胞凋亡率降低，且抗凋亡蛋白-Bcl2的表達(dá)水平升高，凋亡蛋白Caspase3的表達(dá)水平下降;通過抑制Notch信號(hào)通路能加重缺血/再灌注損傷現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制Notch信號(hào)通路后心肌細(xì)胞的活力受到抑制，LDH釋放率升高，細(xì)胞凋亡率升高，抗凋亡蛋白-Bcl2的表達(dá)水平降低，凋亡蛋白Caspase3的表達(dá)水平提升。

綜上所述，本研究提示Notch 信號(hào)通路在心肌缺血/再灌注的過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，對(duì)誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡具有重要影響，且激活Notch 信號(hào)通路能起到抗缺血/再灌注損傷的效果。

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